lncRNA在肝細胞肝癌中的研究進展

李松，陸軼杰，吳建武，蔣新衛

（南京醫科大學附屬蘇州醫院 肝膽胰外科，江蘇 蘇州 215000）

據2021年全球癌癥數據統計，原發性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）在所有惡性腫瘤中發病率排名第七，由于其惡性度高，進展快，病死率排名第二，僅次于肺癌[1]。原發性肝癌起源于肝臟上皮組織，病理學上可分為肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、膽管細胞癌及混合型癌，其中HCC是主要類型。目前，對于肝癌的治療多采取以外科手術為主，聯合靶向、免疫、介入、放化療、中醫等的綜合療法[2]。雖然對于早期肝癌的治療效果有了很大程度的提升，但總體上肝癌患者的長期生存狀況仍不樂觀，5年生存率僅為18%左右。病毒性肝炎導致的肝硬化是我國肝癌最常見的誘因[3]，但肝癌發生發展的具體機制仍不清晰，難以實現精準的個體化治療。因此，亟需尋找一種新的分子標志物，為肝癌的早期診斷及精準治療提供新的思路。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）近年來逐漸引起學者們的關注，其在HCC中具有影響腫瘤細胞增殖、轉移的作用[4]，提示lncRNA有望成為改善HCC診斷及治療的新的切入點。

1 關于lncRNA

1.1 lncRNA的概念和特點

lncRNA現定義為長度超過200 bp的無編碼蛋白作用的DNA轉錄產物[5]，由日本學者在小鼠cDNA測序研究中首次提出[6]。根據lncRNA在基因組中的定位將其分為lncRNA、反義lncRNA、雙向lncRNA、基因內lncRNA和基因間lncRNA五類[7]。lncRNA在人類基因組廣泛轉錄，但具有高復雜性和低保守性的特點，表現在其與蛋白編碼基因相比具有更高的細胞表達特異度，表達量也會隨環境和時間動態變化[8]，因此曾被認為是RNA聚合酶保真性差而致的轉錄噪聲[5]。隨著研究的深入，學者們發現某些lncRNA的表達限于特定的發育背景，受到一定的精確調控，如大量的小鼠lncRNA在其胚胎干細胞分化階段和大腦中高度表達[9]，提示其可能具有某些特定的功能。lncRNA與mRNA相比轉錄本更短，包含的外顯子更少，穩定性也較差。lncRNA也可含有一個或多個開放閱讀框（open reading frame，ORF），但基本不通過翻譯蛋白質發揮生物學作用[10]。

1.2 lncRNA的作用方式

lncRNA主要參與轉錄、轉錄后和翻譯后等基因表達過程[11]，可以通過多種方式與DNA、RNA、蛋白質相互作用從而調節DNA的表達和蛋白質的合成，具體的作用方式有以下幾種。（1）染色質重塑：lncRNA可以通過招募染色質重構復合物到特定的基因組位點來介導表觀遺傳變化。Plath等[12]研究發現，X染色體的失活是由標志性的lncRNA Xist（X-inactive specific transcript）介導的。Xist位點內的非編碼轉錄本RepA招募了染色質重構復合體PRC2，以此沉默X染色體。由相應的lncRNA引導的染色質重構復合物是一種廣泛的染色質修飾模式。（2）招募并整合RNA結合蛋白的功能到轉錄程序中[13]。（3）充當調節轉錄因子、催化蛋白活性的輔助因子[14]。（4）調節RNA聚合酶：研究發現lncRNA-LEENE的轉錄可增強RNA聚合酶II（RNA Pol II）結合內皮型一氧化氮合酶（eNOS）啟動子，因此增強eNOS轉錄[15]。（5）識別互補序列并充當分子海綿，與mRNA互作，調控mRNA轉錄后處理的各個步驟[16]。

2 lncRNA在HCC發生發展中的作用

2.1 lncRNA調節HCC細胞的增殖和侵襲能力

研究發現，一些lncRNA可影響HCC細胞體內外增殖和侵襲能力。2007年，Kartin等[17]首次報道了在HCC中高度特異性上調的非編碼RNA，并將其命名為HULC（highly up-regulated in liver cancer）。有研究發現，HULC可以通過“海綿結合”miR-377-5p促進HepG2 細胞的增殖和侵襲；敲低HULC后，小鼠體內成瘤也明顯縮小[18]。MALAT1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1）是一個位于11q13 的8.5 kb的保守的核保留lncRNA，其在HCC細胞中顯著高表達[19]。Huang等[20]學者的研究顯示，MALAT1可將染色質重塑復合物SWI/SNF（switching/sucrose non-fermentable）的催化亞基BRG1（brahmarelated gene 1）招募至促炎因子IL-6和CXCL8基因的啟動子，激活轉錄因子NF-κB后增加兩種促炎因子的表達，從而促進QGY-7701/7703 細胞增殖和侵襲能力。MEG3（maternally expressed gene 3）定位于染色體14q32.3，長度約為1.6 kb[21]。研究發現，HCC組織和細胞系中的MEG3 水平顯著降低，特別是在晚期HCC患者中，敲除MEG3可顯著促進肝癌細胞的增殖和侵襲，加速細胞周期，其機制可能與抑制AP1G1表達和激活PI3K/AKT通路有關[22]。Duan等[23]的研究顯示：HOTAIR（HOX transcript antisense intergenic RNA）在HCC細胞系中高表達，敲低后可上調miR-34a的表達，抑制HepG2和SMMC7721細胞的增殖和侵襲，促進凋亡?？偠灾?，多種lncRNA的異常表達促進了HCC的惡性表型，作用模式可為染色質修飾或結合下游miRNA、蛋白質等，提示lncRNA是人為抑制腫瘤進程的新靶點。

2.2 lncRNA調節HCC上皮-間充質轉化

上皮-間充質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）對包括HCC在內的多種癌癥的進展非常重要，可以賦予細胞轉移和侵襲的能力，減少凋亡與衰老，促進免疫抑制。lncRNA HOXA-AS3在HCC細胞中高表達，在細胞系SMMC-7721、HepG2、Huh7 和HCC-LM3中將其敲除可以降低N鈣黏蛋白（N cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表達，增加E鈣黏蛋白（E cadherin）的表達，表明lncRNA HOXAAS3能促進HCC的EMT過程[24]。有學者認為，癌細胞可以獲得一種雜交上皮/間充質（E/M）表型。具有混合E/M表型的細胞混合上皮和間充質特性，它們對治療更具耐藥性，也更有能力啟動轉移性病變。HCC中，過表達HOTAIR通過調控Caveolin-1的表達和激活，抑制c-Met的表達和激活，為E/M表型提供了生存優勢，促進了HCC的發展[25]。另有研究指出，在HCC中，MALAT1促進了zeste同源物2（EZH2）在miR-22和E-cadherin啟動子區域的富集，抑制miR-22和E-cadherin的表達，正向調控SNAI1，在EMT中發揮重要作用[26]。

2.3 lncRNA調節HCC組織血管生成

血管生成是包括HCC在內的實體腫瘤的顯著特征[27]。Lu等[28]研究發現，在HCC中HULC作為分子海綿靶向結合miR-107，導致轉錄因子E2F1的上調，后者結合并激活SPHK1啟動子，而SPHK1/S1P/S1PR1/3信號通路在腫瘤血管生成中起重要作用。lncRNA HABON（hypoxia-activated BNIP3 overlapping non-coding RNA）是一種由缺氧激活的lncRNA，該lncRNA不僅受到缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）的調控，而且在肝癌細胞缺氧時其表達水平顯著升高。在缺氧細胞中，HABON可被HIF-1α轉錄激活，并與HIF-1α相互作用，促進其蛋白降解，最終通過影響HIF-1α靶基因的轉錄而發揮作用。HIF-1α的靶基因包括EPO編碼基因和VEGF編碼基因等，在腫瘤血管生成中有著重要作用[29]。

2.4 lncRNA調節HCC腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）特性

CSC為腫瘤中具有自我更新能力并能產生異質性腫瘤細胞的一類細胞。CSC通過自我更新和無限增殖維持著腫瘤細胞群的生命力，其運動和遷徙能力又使腫瘤細胞的轉移成為可能，因此腫瘤干細胞對腫瘤的存活、增殖、轉移及復發有著重要作用。有研究表明，在穩定感染HBV的HepG2 X細胞中，lncRNA MALAT1 的表達上升，其形成克隆及在裸鼠體內成瘤的能力均較HepG2細胞增強。敲減MALAT1降低CD44、CD133、EpCAM等CSC標志物的基因表達，提示MALAT1能夠促進HepG2 X細胞的CSC分化和腫瘤發生[30]。Wang等[31]學者的研究顯示，HULC加速了依賴CyclinD1的人肝癌干細胞的進展。Jiang等[32]研究發現，MEG3通過阻斷維持端粒長度的復合物（POT1-Exo1-TRF2-SNM1B）的形成，并通過增加p53和HULC之間的相互作用，減少復合物與端粒的結合，從而減少端粒長度。最終，MEG3通過降低端粒酶活性和減弱端粒重復結合因子2（TRF2），抑制人肝癌腫瘤干細胞的生長。

2.5 lncRNA增強HCC對藥物的敏感性

晚期肝癌目前最主要的治療方式是化療、靶向治療、免疫治療。腫瘤耐藥是藥物治療的一大阻礙。有研究表明，lncRNA HOTAIR可以通過抑制miR-217來增加肝癌患者對索拉非尼（sorafenib）的耐藥性[33]，另一方面也可通過調節Akt磷酸化和Wnt/β-catenin信號與miR-34a相互作用，削弱HCC對于紫杉醇的耐藥[23]。另有研究發現，lncRNA-MT1JP與miR-24-3p的海綿結合釋放了BCL2L2（Bcl-2 like 2），從而形成了一個正反饋回路，降低了肝癌細胞在體內外對侖伐替尼（lenvatinib）的敏感性[34]。Li等[35]研究證明，BANCR（BRAF lncRNA）在HCC細胞系Huh7中過表達，其下調抑制了Huh7細胞的活力，促進了凋亡，并抑制了肝癌細胞的遷移和侵襲。伴有BRAF突變的晚期HCC患者對TKI的耐藥更顯著，抑制BRAF可能成為治療肝癌的一種策略，而BANCR可能是介導肝癌細胞增殖和TKI逃逸的重要分子[36]。

3 lncRNA作為HCC腫瘤標志物

某些lncRNA在HCC的異常表達及組織特異性，使其有望成為新的腫瘤標志物[37]，幫助判斷HCC的發生及預后。HCC患者血漿中HULC轉錄產物顯著升高[38]。此外，與來自健康個體的血清相比，在乙型肝炎病毒陽性患者的血清中發現了更高水平的HULC轉錄本[39]。這意味著HULC可能成為合適的診斷標志物[40]。在Yuan等[41]的研究中，通過對血清樣本的qRT-PCR檢測，篩選并驗證出LINC00152、RP11-160H22.5和XLOC014172可能是HCC與慢性肝炎患者的診斷標志物。一些lncRNA可能與肝癌預后密切相關。Lee等[42]的研究表明，高表達PLEKHA8P1的原發性肝癌患者，總生存期和無病生存期均有降低趨勢；同時，PLEKHA8P1的表達與原發性肝臟腫瘤的組織學分級呈正相關。Wu等[43]學者的研究表明，HOTTIP（HOXA transcript at the distal tip）表達是HCC肝移植術后腫瘤復發和總生存時間較低的獨立預后因素。UCA1（urothelial cancer associated 1）在HCC細胞中異常高表達[44]。有薈萃分析發現，UCA1 上調與腫瘤體積較大、TNM晚期密切相關，而UCA1過表達與更短的總生存期顯著相關[45]。目前對于HCC的診斷多以甲胎蛋白等傳統的分子標志物為主，診斷存在腫瘤初期升高不顯著的弊端，且難以判斷預后，lncRNA因此有望成為早期診斷并預測疾病結局的新的分子標志物。但lncRNA普遍表達量極低，雖然有二代測序等新方法，但仍缺乏經濟有效的能夠普遍開展的檢測方法。

4 lncRNA導入HCC組織實現治療的可行性

如前所述，眾多lncRNA在細胞試驗和動物試驗中表現出了對HCC細胞惡性程度的抑制，且能夠逆轉腫瘤耐藥，提示lncRNA可能成為新的靶向治療位點。肝臟作為主要的代謝器官，具有顯著的吸收外界治療藥物的能力，如有高效的干預方法，則有可行性。反義寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASO）包括雙鏈形式的小干擾RNA（siRNA）和單鏈形式的RNA，可在不同部位實現對目標RNA的剪切[46]，將其靶向導入腫瘤組織有多種方式。（1）將化學基團與ASO偶聯，如膽固醇分子與ASO結合可增強肝細胞對其的吸收[47]。（2）通過脂質體介導：Sato等[48]利用維生素A偶聯脂質體系統將靶向膠原伴侶gp46的ASO引入大鼠肝星狀細胞，以抑制肝硬化。（3）類脂納米顆粒[49]。（4）細胞外囊泡[50]。還有一種思路是將抑制腫瘤發展的lncRNA導入細胞使其過表達?；贏AV的核酸輸送方法被譽為目前模式生物組織輸送核酸的金標準，但也存在受限于lncRNA分子大小和病毒安全性的缺點，這方面的研究仍在起步階段[51]。lncRNA的生物學作用已得到證實，目前對lncRNA的干預多停留在實驗室水平，開發出更加高效的給藥方法是實現治療目的關鍵。

5 小結與展望

目前，早期肝癌的治療以外科手術為主，進展期多無法手術而采取綜合治療，肝癌患者總體的生存時間仍很短。lncRNA是近年來的研究熱點，可通過染色質修飾、結合并調節下游的RNA聚合酶、蛋白、miRNA等多種方法發揮生物學作用。本文闡述了lncRNA的基本作用方式及其對HCC的影響和機制。一些在HCC中特異性表達的lncRNA，能夠參與調控腫瘤的增殖和侵襲能力以及血管生成能力，也能夠調節腫瘤耐藥性和干細胞特性。這種生物學作用使得lncRNA有望成為新型的腫瘤標志物以及治療靶點，但仍需要大規模的臨床研究加以驗證。實現臨床轉化是最終目標，目前亟待解決的問題是明確靈敏度和特異度均合適的lncRNA以及發掘更好的RNA測序方法實現高效檢驗。同時在治療層面，需要發掘靶向性強、效率高、相對安全的導入ASO的辦法?？偠灾?，lncRNA是應對包括肝癌在內的多種惡性腫瘤的可能解決方案。