丁香水提物的抑菌效應及對兔標本保存效果的研究

祖文軒,侯文瀚，王銀燕,林 娜，桂 航，張倩楠，陳士文

在解剖教學及各類動植物標本保存的過程中，保存液浸泡保存是最經濟、便攜的處理方式。而目前廣泛應用的保存液成分主要是甲醛、乙醇、醋酸等化學試劑[1-2]。但這類保存液易揮發，伴有刺激性氣味，長期使用甚至會損傷操作人員的呼吸系統及血液系統[3]。新型環保試劑已經成為業界研究的熱點，研發一種兼顧組織保存和無毒無刺激氣味的保存液對本學科的發展有著重要的貢獻及意義。辛香料在食品保存產業中應用十分廣泛，其中不乏一些具有防腐抗菌作用的品種。然而，辛香料作為主要成分的保存液研發及應用仍不多見，本研究選取丁香作為實驗辛香料，與傳統甲醛保存液相比較，探究其提取液的抑菌和保存時間，為辛香料為主要成分保存液的開發提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與分組 將保存液分為陰性對照組(蒸餾水)，實驗組(丁香水提原液)，陽性對照組(10%甲醛)。實驗組丁香藥材購于蚌埠市豐原大藥房中草藥專柜，蒸餾水及10%甲醛由蚌埠醫學院實驗中心解剖教研室實驗室提供。

1.2 水提法制備丁香水提物 稱取10 g丁香放入三角燒瓶,加入100 mL蒸餾水，靜置2.5 h。用組裝好的蒸餾儀器80 ℃下蒸餾提取6 h[4]，將蒸餾完畢的提取液進行旋轉蒸發：將提取液放入旋轉燒瓶內，調整旋轉蒸發儀轉速為50 r/min，將提取液蒸發至10 mL，濃度為1 g/mL，裝入試管內保存待用。

1.3 體外抑菌實驗 采用金黃色葡萄球菌及大腸埃希菌兩種常見細菌，均由蚌埠醫學院微生物實驗室提供。分別取100 μL菌液加入0.9%氯化鈉溶液，用麥氏比濁法確定兩種菌的濃度，將菌液濃度調整為1.0×107CFU/mL，于瓊脂板涂布。取打孔器將濾紙裁剪成直徑6 mm的圓形濾紙片，蒸汽滅菌烘干。將無菌濾紙片浸泡于3組保存液中，1 h后取出晾干。將含菌瓊脂板等面劃分3個區域，再將各組濾紙片分別等距貼放于區域內，標記，每組重復3次。將瓊脂板放置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，測量各組抑菌圈直徑。

1.4 最小抑菌濃度測定 采用雙倍稀釋法。(1)細菌懸液的備制：將2種細菌接種于冷涼肉湯培養基中，放入37 ℃溫箱中培養24 h，使生長濁度達到9.0×108CFU/mL。(2)丁香水提抑菌液的稀釋：取26支無菌試管，標記編號，分成2組，每組13支。將菌液作1∶10 000倍稀釋，第一號試管中加入稀釋后菌液1.0 mL，余下12支試管加入1.0 mL。于第1號試管中加入1 g/mL丁香水提抑菌液1.0 mL，混合后吸出1 mL加入第2號試管，以此類推直至第12號試管，棄去12號試管中1 mL混合液，此時每只試管中液體量相同，第13號管為對照管。(3)將2組試管放入37 ℃溫箱中培養24 h后送檢，無細菌生長管次中最高藥物稀釋度為最小抑菌濃度。

1.5 保存效果的對比試驗 取新鮮新西蘭兔標本，備皮，于深筋膜淺層完整剝離皮膚及皮下組織。用組織剪備制成1 cm×1 cm 大小組織方塊。分別取3組液體20 mL，將組織方塊完全浸泡于液體后，封管，每組重復6次。比較3組保存液液體顏色，并取樣送細菌培養，檢測有無細菌生長。

2 結果

2.1 體外抑菌實驗 實驗組及陽性對照組對革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌及革蘭氏陰性大腸埃希菌均有抑菌作用，其中丁香水提物對2種細菌的抑菌圈直徑分別為(8.67±0.58)mm和(10.27 ±0.83)mm(見表1)。

表1 3組保存液的抑菌圈直徑

2.2 丁香水提液的最小抑菌濃度 記錄2組菌落培養液中細菌生長的最大藥物稀釋倍數，即最小藥物濃度，并計算丁香水提液的最小抑菌濃度，金黃色葡萄球菌及大腸埃希菌的最小抑菌濃度分別125 mg/mL和62.5 mg/mL(見表2)。

表2 丁香水提液的最小抑菌濃度測定

2.3 保存效果的比較 每周觀察并取樣一次，陰性對照組于第1周即被檢出細菌產生，且兔皮膚組織軟化，潰爛，試管內液體出現渾濁，伴有氣味。陽性對照組無細菌檢出，兔皮膚組織硬化，彈性差，試管內液體呈透明狀，無沉淀及霉菌孢子，保存液刺激性強。實驗組于第12周開始陸續檢出細菌，6組重復試驗中最長無細菌檢出時間可達15周，最短為12周。該段時間內，兔皮膚組織彈性較陽性實驗組佳，無明顯刺激性及異味，隨著細菌的檢出，試管內液體逐漸渾濁，出現腐敗氣味(見圖1)。

3 討論

甲醛在室溫時易揮發,并且隨著溫度的上升會加快揮發速度，產生很強的刺激性氣味，對人體皮膚和黏膜刺激性大，眼結膜和呼吸道的刺激尤為強烈，在我國有毒化學品優先控制名單上甲醛高居第二位，并且已經被世界衛生組織確定為致癌和致畸形物質[5]，危害人體健康。因此,探求無刺激性保存液取代甲醛液,長期以來為解剖學界所普遍關注，并提出了很多改良方法。例如異噻唑啉酮類混合防腐液、苯甲酸乙醇保存液等[6],但效果并不滿意，存在標本質地硬、易撕裂，液體易霉變、渾濁，消耗量大等問題。低溫保存技術可以較好保存人體標本，但使用技術要求高，標本反復升降溫會滋生細菌，且成本高昂[7]。生物塑化技術自二十世紀80年代發明以來，在人體解剖學標本制作中得到廣泛應用，雖然其固定效果好，但固定后的標本理化性質完全改變，僅適用于標本陳列，并不適合實驗教學和科學研究。國內關于離子保存液研究較少，且制作難度大，使用成本高[8]。近些年來，隨著化學技術發展，將新型防腐組分引入人體標本保存技術已成為可能[1,9]。利用新型防腐組分用于人體標本保存，對于提高人體標本保存效果方面具有較樂觀的前景。

辛香料作為防腐制品最早可以追溯到原始時代，當時人們發現剩余的食物如果和一些植物的莖葉一起儲藏，可以抑制食品的腐敗，遮蓋異味。而我國辛香料作為防腐增味劑在食品加工儲藏運輸中已經廣泛應用[3,10]。本課題組在前期預實驗中篩選了26種辛香料材，采用水提法得到提取液，初次實驗觀察到丁香有較好的防霉作用，在本研究中進行了進一步的驗證。

植物的提純方法包括水提法、鹽提法、醇提法和堿提法[11]等。本實驗主要檢測提取物的抑菌作用，為了排除溶劑本身對細菌的抑制作用，降低實驗結果的偏移，本實驗采用水提法提取丁香活性液。丁香屬木樨科植物，含紫丁香醇、苯乙醇、芳樟醇、大茴香醛等，在我國華北、東北、西北、華東等地區有著廣泛的種植與栽培，購置成本低，提取物無明顯的刺激性氣味。進一步的實驗發現，丁香水提物對金黃色葡萄球菌及大腸埃希菌的抑菌圈大小相較于10%甲醛無明顯差異。且在12周內對兔皮膚組織有著較好的保存作用。

綜上，丁香水提物具有一定的抑菌作用，在一定時間內有較好的組織保存作用，為新型環保保存液的研究提供一定的實驗基礎。但其有效抑菌成分的純化及長效保存能力的保證仍需進一步的探索。