食品加工環境脅迫因素對單核細胞增生李斯特菌生物膜形成的影響研究進展

王 園，孫琳珺，程 穎，王 翔，劉陽泰，林玉海，董慶利,*

（1.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093；2.上海中僑職業技術大學食品藥品學院，上海 201514；3.荷美爾食品公司，上海 200436）

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）（以下簡稱單增李斯特菌）是一種兼性厭氧、無芽孢的革蘭氏陽性短桿菌，廣泛分布于自然環境中，被世界衛生組織列為20世紀90年代食品中四大致病菌之一[1]。食物是單增李斯特菌傳播的主要載體，肉類、蛋類、禽類、海產品、乳制品、蔬菜等都是單增李斯特菌污染較高的食物[2]。攝入被單增李斯特菌污染的食物可使人患李斯特菌病，甚至引起疾病暴發，致死率高達20%～30%[3]。

生物膜是細菌在生長過程中為了適應生存環境，分泌黏性胞外聚合物吸附于物質表面，并增殖而形成的具有一定結構的細胞群體[4]。據調查，約80%的細菌感染均與生物膜的形成有關[5]，60%的食源性食物中毒暴發事件是由食源性致病菌生物膜引起[6]。單增李斯特菌可黏附在各種接觸物表面上并形成生物膜，從而導致產品的持續污染。

細菌生物膜形成是一個動態演變過程，生物膜形成能力會因許多因素而變化。在食品加工儲藏過程中，微生物所處的環境復雜多變，諸多因素均會對生物膜的形成產生影響，生物膜的成熟也可能因環境條件而異[7]，例如短期的營養缺乏可增強單增李斯特菌的菌體黏附，而長期營養缺乏時則會阻礙生物膜成熟[8]。當胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soy broth，TSB）培養基中NaCl含量增加時，單增李斯特菌生物量顯著增加[9]。單增李斯特菌在惡劣環境中能長時間生存（持久性）也可能與生物膜的形成有關，形成生物膜可能是對脅迫環境的適應性反應[10]。實際上，在食品加工及儲藏過程中，冷藏、高鹽度、干燥、酸處理以及消毒劑等處理使微生物長期處于脅迫環境下。環境脅迫是指在自然界或食品加工和保藏過程中，環境條件對微生物的生長和存在產生了一定程度的威脅和制約[11]。值得注意的是，經各種處理后，生物膜仍可在設備表面殘留，并在環境適宜時脫落出細菌菌體，成為潛在污染源，進一步造成交叉污染，引發嚴重的食品安全問題。環境條件對生物膜的影響極其復雜，不同的環境因子組合下形成的生物膜差異較大。此外，細菌暴露于脅迫條件下，可能提高其對其他脅迫條件的抗性[12]。生物膜的形成使細菌菌體對環境壓力的抵抗能力大大增強，常規方法難以清除生物膜，殘留的生物膜可發展形成新的生物膜，生物膜形成處成為交叉污染的中心，進而對食品安全產生極大威脅。因此十分有必要研究不利條件下單增李斯特菌在設備表面附著和生物膜形成的情況。

本文針對不同脅迫條件對單增李斯特菌生物膜形成的影響進行全面綜述，同時深入探討脅迫環境下生物膜的變化機制，并對未來的研究方向作出展望，有助于針對性地制定預防和控制生物膜的策略。

1 單增李斯特菌生物膜形成能力

不同分離源、不同譜系以及血清型的單增李斯特菌生物膜形成能力有所不同。根據遺傳指紋圖譜和致病潛力，單增李斯特菌可分為4 個不同的譜系?；诰w/鞭毛抗原（O/H）血清學反應，單增李斯特菌被分為13 種血清型，其中血清型1/2a、1/2b、1/2c和4b經常分離于食品及患者標本中。血清型或譜系與生物膜形成能力之間的關聯一直存在爭議。已報道的我國食源性單增李斯特菌中，1/2c血清型居多，且不同壓力條件下1/2c血清型生物膜形成能力強于其他血清型[13]，這可能是1/2c血清型在我國分離率較高的原因。1/2a和/或1/2c菌株（譜系II）的生物膜形成能力強于4b菌株（譜系I）[14-15]，然而Djordjevic等[16]研究發現譜系I菌株的生物膜形成能力強于譜系II。研究結果的差異性可能是由于菌株差異、研究條件以及培養介質不同。Kadam等[17]研究了143 株不同血清型、不同分離源的單增李斯特菌生物膜的形成情況，結果顯示，血清型對生物膜的形成有顯著影響，而菌株的分離源對生物膜的形成水平沒有顯著影響。目前，評估生物膜表型的種內多樣性的研究集中于將表型與菌株的譜系、血清型或來源相關聯，而這些評估方式可能無法反映生物膜形成的種內多樣性。

基于特定基因型的研究，如多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）定義的基因型，可能揭示出與生物膜表型更緊密的聯系。近來，Maury等[18]發現低毒力型單增李斯特菌克隆CC121和CC9在亞致死濃度苯扎氯銨處理下的生物膜生成量更高；10 ℃下，CC26型菌株的生物膜形成能力明顯高于其他CC型，低溫能增強CC26菌株的生物膜形成能力，而CC7型的菌株在所有條件下均表現出較弱的生物膜形成能力[8]，這意味著某些基因型在特定條件下具有適應性優勢。MLST分型與生物膜形成能力和生物膜結構相關性仍需進一步研究。

單增李斯特菌的生物膜形成能力具有較強的菌株特異性。Weiler等[19]研究表明單增李斯特菌生物膜的形成和附著與血清型無關，而是具有菌株特異性。純培養條件下，單增李斯特菌菌株之間生物膜形成能力差異很大[20]，且形成生物膜的結構也因菌株而異。一些系統發育密切相關的菌株（包括相同基因型的分離株）之間生物膜形成能力存在較大差異，較小的遺傳變異可能會影響生物膜表型。有些菌株能更有效地附著在表面，而隨后不一定形成更多的生物膜，甚至相似來源的菌株也表現出不同的生物膜行為[21]。屬于同一脈沖電泳型的分離株生物膜形成能力不同，這表明生物膜形成能力取決于菌株[22]。而同一株單增李斯特菌在不同條件下的生物膜形成量顯著不同，表明菌株的表型變化可能取決于環境條件[23]。為更準確地開展生物膜形成的種內多樣性研究，應充分掌握單增李斯特菌的種內變異性和環境因素對種內變異性影響的信息。

2 食品加工環境脅迫因子對單增李斯特菌生物膜形成的影響

單增李斯特菌生物膜的形成除受以上微生物內在因素的影響，還受食品加工儲藏過程中冷藏、干燥、酸處理、消毒劑等環境因素的影響。

2.1 冷脅迫

冷脅迫包括0～12 ℃之間的冷脅迫和0 ℃以下的冷凍脅迫。4 ℃下單增李斯特菌可在3 h內附著在食物接觸物表面[24]，并在24 h后形成稀疏細胞簇組成的生物膜[25]。研究表明單增李斯特菌在玻璃表面的生物膜形成顯著依賴于培養溫度和時間，4 ℃下單增李斯特菌在不銹鋼、玻璃表面均可形成生物膜，且隨著培養時間的延長，生物膜數量逐漸增加[26]。I?iguez-Moreno等[27]也得到了同樣的研究結果，9 ℃下單增李斯特菌數量在生物膜形成的過程中呈線性增長，細胞間相互作用形成復雜且高度結構化的生物膜。然而，di Bonaventura等[25]研究表明，4、12 ℃下單增李斯特菌僅形成由稀疏細胞簇和少量胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）組成的基礎生物膜結構，可能是低溫下細菌存活率降低導致的。當前研究主要比較了常見溫度范圍4～37 ℃對單增李斯特菌生物膜形成的影響，盡管研究結果存在爭議，但均表明單增李斯特菌可在低溫下存活并形成生物膜。

單增李斯特菌是一種嗜冷菌，不僅能在0～4 ℃的低溫環境下生存，甚至當溫度低于0 ℃條件下仍可繁殖。研究表明冷應激會導致單增李斯特菌對食品接觸表面的黏附力增強，增加了食品污染的幾率[28]。Miladi等[29]研究發現，經過-20 ℃的冷凍脅迫后，單增李斯特菌的黏附能力增強，并能夠產生黏液。單增李斯特菌生物膜存在的時間與其低溫環境下的生長繁殖能力有關。低溫下單增李斯特菌仍可形成生物膜黏附在各種表面，降低各種殺菌清洗手段的效率，其可在食品工業設備和環境中持續存在數月甚至數年。

2.2 營養脅迫

饑餓生存被定義為“微生物在產能底物缺乏時的生存過程”[30]。在加工處理食品的過程中，通常會按照特定的程序對食品原料或產品進行數次清洗、消毒，使微生物暴露于消毒劑、脫水及營養物質缺乏的條件下。

黏附是生物膜形成的第一步，Lee等[28]觀察到無論培養溫度如何，營養缺乏都會對單增李斯特菌的黏附產生積極影響，然而并未促進生物膜的成熟，營養水平對不同階段生物膜的影響可能不同[30]。如細菌與基質之間的疏水性和界面力等理化特性會影響細胞附著，且營養脅迫可能會引發細胞表面特性改變，從而導致黏附力增加。營養缺乏可能刺激單增李斯特菌和沙門氏菌形成生物膜[31-32]。Folsom等[33]研究了營養水平對不同菌株生物膜形成能力的影響，11 種菌株在TSB培養基和稀釋的TSB（diluted TSB，DTSB）培養基中具有相同的生物膜形成能力，14 種菌株在TSB培養基中比在DTSB培養基中形成更多的生物膜，5 種菌株在DTSB培養基中比在TSB培養基中形成更多生物膜，可見營養水平和菌株的交互作用對生物膜的形成有顯著影響。營養缺乏脅迫時，常觀察到細菌尺寸減小，同時細胞形狀從桿狀變為球狀[30]，這種形態上的收縮變圓可能增加細胞吸收營養的能力。實際上，細菌適應惡劣環境的一種常見方法是其形態發生改變。

2.3 酸脅迫

食品加工過程中常形成低pH值環境，如使用酸性洗液和酸性食品添加劑等。單增李斯特菌生物膜形成能力也受pH值的影響，其疏水性和表面黏附力隨著環境pH值降低而增加[34]。然而Barbosa等[35]研究發現單增李斯特菌1592/2暴露于酸性亞致死條件后，其在37 ℃條件下形成生物膜的能力下降。不同來源單增李斯特菌在pH 4.2、5.5、6.5下均可形成生物膜，然而隨著pH值的降低，生物膜的生成量逐漸減少[36]。研究表明短期弱酸脅迫可以增強腸炎沙門氏菌的附著力，而長期強酸脅迫能夠顯著降低細胞的附著力；與對照組相比，長期弱酸和強酸脅迫均顯著抑制了腸炎沙門氏菌生物膜的形成[37]。王嫻靜等[38]的研究表明，酸性條件對大腸桿菌O157:H7的生物膜形成過程具有抑制作用。這一發現可通過細胞與環境pH值動態作用來解釋，當環境pH值降低時導致膜質子泵活性增加，從而將H+從細胞質中排出，因此細胞內能量消耗主要是用于避免內部酸化，進而降低黏附和生物膜形成過程中涉及的生理過程的速率。

通過MOSA求解面向廣義能耗的調度優化問題的初始解，包括采用隨機方式選取子批量的加工批量、工藝路線、工序選擇的加工機床、刀具和搬運設備，以及通過先到先服務(First Come First Served, FCFS)規則選取工序選擇的夾具和安排子批量在機床上的加工順序。根據上述方式生成調度方案的初始解R0，并通過廣義能耗和完工時間目標函數計算柔性作業車間廣義能耗F1(R0)和完工時間F2(R0)。

值得關注的是，當微生物暴露于酸性應激條件之后其對該脅迫條件或其他脅迫條件的抗性會提高，從而導致“交叉保護”。酸適應增強了單增李斯特菌對不銹鋼表面的附著能力，同時還能提高附著細胞對極端酸處理[39]和次氯酸鈉[40]的抵抗力。因此，在應用酸性去污劑清除單增李斯特菌黏附體時應考慮“脅迫強化”。

2.4 滲透脅迫

鹽是使用最廣泛的天然防腐劑，單增李斯特菌在許多食品中生存均必須克服由食鹽產生的滲透脅迫。單增李斯特菌能適應周圍環境中水分活度的變化，NaCl能誘導生物膜的形成。在不同溫度[41]、不同培養基[42]條件下，當培養基中補充NaCl時，可促進生物膜的形成，并導致單增李斯特菌聚集程度急劇增加。Lee等[28]的研究結果表明在營養豐富或營養缺乏條件下增加鹽濃度均能導致生物膜形成量顯著增加，表明鹽分添加和營養缺乏可促進生物的膜形成，且營養物質的缺乏會增強氯化鈉對生物膜成熟的積極作用。而在Barbosa等[35]研究發現，5 株單增李斯特菌菌株在遭遇亞致死滲透壓脅迫后，生物膜形成能力沒有發生顯著變化，研究結果的不同可能是由于所使用的NaCl濃度差別以及所選擇的菌株差異性較大。

在高鹽條件下，單增李斯特菌的生物膜中細胞呈長鏈狀[43]。當單增李斯特菌培養液中NaCl質量分數高于5%時，觀察到菌體細胞在較低水分活度脅迫下不能分裂，這些伸長的細胞實際上接近分裂狀態，當轉移到更有利的條件下，就會分裂成單個細胞并開始生長[44]。對于食品加工環境中的滲透脅迫，單增李斯特菌已進化出多種應對機制，包括拉伸激活或由拉伸激活介導細胞質溶質和水由細胞膜通道流出，可避免在滲透脅迫下大量水流入細胞質而引起的細胞裂解。

2.5 干燥脅迫

在食品工業中，在日常清潔消毒后常伴隨風干處理，其目的是干燥食品表面，避免由于食品接觸表面水凝結導致微生物凝聚而引起污染。單增李斯特菌在可在相對濕度43%的條件下存活長達3 個月[45]，食鹽、有機物質殘留和相對濕度的增加可提高單增李斯特菌在干燥條件下的存活率。生物膜可經受一段時間的干燥并適應周圍環境。

干燥對不同生長階段單增李斯特菌生物膜的影響不同。成熟生物膜細胞與未成熟生物膜細胞相比在干燥環境中的存活率顯著提高，且當生物膜發育至一定階段后，進一步成熟導致的結構復雜性增加并不會提高單增李斯特菌的存活率[43]。此外，單增李斯特菌的抗干燥性受遺傳因素的影響。對分離自水、食品和血液的不同單增李斯特菌生物膜形成能力及其干燥抗性進行研究時，依據干燥后菌株生物膜的活菌數減少量，將菌株分為干燥敏感型菌株、中等敏感型菌株以及耐干燥菌株[46]。生物膜細胞干燥抗性的提高可能是通過細胞代謝、細胞膜組成改變、生物膜基質的保護作用實現。

2.6 消毒劑脅迫

在食品加工環境中，不同的消毒劑，例如季銨化合物、過氧化氫、過氧乙酸和次氯酸鈉廣泛用于食品接觸表面清潔。生物膜對消毒劑抗性的評估是當下研究者廣泛關注的熱點。

另一方面，消毒劑對細菌生物膜作用效果受其他環境因素的影響（表1）。Moorman等[50]研究了應激處理后英諾克李斯特菌對季銨鹽消毒劑敏感性的變化，結果表明酸脅迫和饑餓脅迫提高了該菌的存活率，而熱脅迫和冷脅迫降低了其存活率。饑餓的單增李斯特菌對季銨鹽類消毒劑的敏感性降低[51]。饑餓脅迫使細胞膜的流動性和滲透性降低，增加了表面疏水性。細胞疏水性等表面特性與細胞黏附特性及生物膜的形成有密切關系。生物膜態的細胞對殺菌劑的響應不僅與胞外多糖和周圍營養物質的機械保護作用有關，同時與生物膜細胞對脅迫適應性等內在生理因素有關。Belessi等[52]發現低溫下形成的單增李斯特菌生物膜對過氧乙酸更敏感，Barroso等[53]也發現了類似的結果。然而Pang Xinyi等[54]發現單增李斯特菌在4 ℃下培養14 d時產生的生物膜對消毒劑的抗性與15 ℃下無顯著差異，上述研究結果的差異可能是不同溫度下附著的細胞數量不同所引起的。然而目前消毒劑的功效通常取決于對理想條件下培養的浮游微生物的殺滅效果。因此，食品生產者在制定清潔消毒方案時，不僅需要構建消毒劑對浮游細菌和相關生物膜清除的綜合控制方案，還應充分考慮環境因素設定清潔、消毒標準。

表1 不同條件下消毒劑對單增李斯特菌的作用效果Table 1 Effect of disinfectants on Listeria monocytogenes under different conditions

3 環境脅迫條件對單增李斯特菌生物膜形成影響的機制

細菌生物膜的抗脅迫機制不同于游離態細菌的抗脅迫機制。研究生物膜的形成機制須與其環境因子密切聯系起來，不同環境條件下生物膜形成的機制與途徑不相同[57]。單增李斯特菌生物膜的形成是一個復雜的過程，為了適應外界環境變化，單增李斯特菌可通過膜流動性改變、轉錄調控、群體感應系統調控、鞭毛及胞外分泌物合成等途徑使其在不利條件下仍可存活。當微生物應對不良或壓力條件時，多種遺傳和生理機制改變。

3.1 膜流動性相關的適應機制

當微生物暴露于各種環境壓力時，包括細胞膜流動性、細胞疏水性在內的細胞表面特性會發生改變。細胞膜流動性在營養運輸、細胞形態、抵御外部不利環境侵害等多種細胞生理功能中發揮重要作用。此外，細胞膜流動性與其適應各種環境壓力密切相關[58]，細胞膜脂質雙層流動性主要通過調節膜脂肪酸組成來改變。在不利環境下，革蘭氏陰性菌主要通過調節不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例、環丙烷脂肪酸合成或通過順/反異構化來改變其膜流動性；革蘭氏陽性菌通過改變脂肪?；滈L度或形成支鏈脂肪酸（branched chain fatty acid，BCFAs）、改變不飽和/飽和脂肪酸比例來改變其膜流動性[59]。在不利條件下微生物能夠通過膜流動性相關的適應性策略繼續生存。

單增李斯特菌細胞膜由不常見的脂肪酸組成，尤其支鏈脂肪酸的比例較高[60]。當單增李斯特菌在低于10 ℃下生長時，細胞中的反異-支鏈脂肪酸（anteiso-BCFAs）尤其是anteiso-C15:0含量增加，從而保證適當的膜流動性[61]。同樣，在堿性條件下，主要是由于BCFAs含量增加導致膜流動性提高，從而有助于菌體存活。相反，在酸性條件下，BCFAs含量下降，膜流動性降低，從而產生對酸脅迫的抗性[62]。而當病原體反復暴露于亞致死水平的消毒劑時，膜脂肪酸中飽和脂肪酸含量增加，使膜的流動性下降，導致單增李斯特菌在消毒劑存在時得以生長[63]，盡管流動性降低會減少初始表面附著量，但在后期仍有較多生物膜形成。最新研究表明，生物膜內細胞的脂肪酸含量與浮游細胞的脂肪酸含量不同，生物膜細胞中飽和脂肪酸含量比浮游細胞高，而BCFAs含量明顯低于浮游細胞，從而導致更高的相變溫度、堆積密度和雙層穩定性[64]。生物膜的這些生理變化使其能適應各種應激條件，從而提高細菌存活率和對抗菌藥物的抵抗力。

3.2 生物膜相關蛋白表達的調控機制

分泌蛋白作為連接細胞與周圍環境的功能決定因子，可參與單增李斯特菌在非生物和生物表面的定植過程。Combrouse等[65]定量分析了單增李斯特菌生物膜胞外成分，發現胞外物質中蛋白質的含量最高。采用蛋白酶處理生物膜能夠抑制生物膜的發育或誘導細胞的擴散[66-67]，表明蛋白質在生物膜發育和維持中具有重要作用。

生物膜內部蛋白——內化素A（internalin A，InlA）和生物膜相關蛋白L（biofilm-associated protein L，BapL）都是細胞外基質的一部分[68]。InlA是細胞壁結合蛋白，也是參與宿主細胞黏附和侵襲的主要成分之一。一些單增李斯特菌菌株分泌截短的非功能形式的InlA。與表達全長InlA的菌株相比，表達截短InlA的菌株生物膜形成能力顯著增強[68]。這種截短的分子完全釋放在細胞外介質中，可能成為生物膜基質的一部分。生物膜相關蛋白Bap在金黃色葡萄球菌的生物膜形成中具有重要作用，BapL是一種細胞壁錨定蛋白，與Bap相似，可促進一些單增李斯特菌菌株的黏附，參與其生物膜形成過程[69]。BapL可促進某些單增李斯特菌的附著，但其在生物膜形成過程中的作用尚未明確。最近又發現了一類內部蛋白——內化素L（internalin L，InlL）參與了單增李斯特菌EGD-e的初始細菌黏附和固著發育[70]?？紤]到生物膜形成受多因素影響，當對編碼結構蛋白的單個基因進行突變時，通?？梢鹨欢ǖ谋硇妥兓?，因此，在對單增李斯特菌中負責調節生物膜形成的基因決定簇的特性分析仍然是一個關鍵的挑戰。

3.3 基于基因調控表達的機制

單增李斯特菌的環境適應能力依賴于其具有的環境適應因子和環境適應調節因子[71]。表2總結了單增李斯特菌生物膜形成過程中相關功能基因。

表2 單增李斯特菌生物膜形成過程中相關功能基因/蛋白Table 2 Functional genes/proteins related to the formation of Listeria monocytogenes biofilm

在單增李斯特菌中已鑒定出許多對應激反應和毒力基因調控很重要的轉錄調節因子，如SigB、HrcA、PrfA等。已有研究表明在單增李斯特菌中，SigB介導特定基因的表達，使其能在低pH值、氧化、乙醇、高滲透壓、高溫、低溫等環境脅迫壓力下生存[81]。Becker等[82]研究表明轉錄因子SigB參與了單增李斯特菌在低溫環境下的適應過程。研究表明在相同的培養條件下，sigB缺失菌株生物膜的形成能力低于EGD株，添加0.3%膽汁酸鹽可以在一定程度上促進EGD株生物被膜形成，而使sigB缺失菌株生物被膜形成能力略有降低[72]。應激反應基因ltrC也參與了單增李斯特菌在低溫下的生長和適應過程，ltrC受SigB調控，其在1/2a血清型的單增李斯特菌中轉錄水平高于ΔsigB突變株[73]。低溫等脅迫因素可誘導SigB產生活性。SigB在單增李斯特菌環境適應和生物膜形成過程中具有重要作用。

SigB正調控II類應激反應基因，而HrcA負調控I類應激反應基因[83]。hrcA及dnaK對于單增李斯特菌靜態生物膜形成以及消毒劑抗性具有重要作用[74]，與野生型菌株相比，ΔhrcA突變株生物膜形成量增加，提示此突變體中I類熱休克反應的激活對靜態生物膜的形成有利。

此外，細菌的毒力和環境適應能力密切相關。SigB對眾多的毒力因子具有調節作用，并且與重要的毒力調節因子PrfA關系密切[84]。研究表明ΔprfA突變菌株的生物膜形成能力變弱[75]，表明毒力調節因子PrfA對單增李斯特菌生物膜的形成具有促進作用。prfA及受其控制的其他毒力基因，如hly、mpl、plcA、plcB和actA等在37 ℃條件下轉錄更加高效[76]。然而，prfA也可在低溫下轉錄，轉錄因子PrfA可以根據生長溫度在活性和非活性之間切換[85]。溶血素基因hly是單增李斯特菌所必需的毒力基因，其在7 ℃和37 ℃下培養的不同血清型單增李斯特菌中均可很好地轉錄[86]。sigB和prfA會根據環境條件進行轉錄，其活性受pH值、溫度和細菌生長條件的影響。

鞭毛對單增李斯特菌的初始黏附具有重要作用。參與單增李斯特菌附著的主要基因包括鞭毛合成和運動相關的基因flaA、fliP、fliG、flgE、motA、motB和mogR[87]。一旦細菌細胞附著后，生物膜的進一步成熟需要依靠細菌細胞之間的群體感應效應。有兩部分系統參與細菌的群體感應和生物膜形成的調控[88]，一部分為多效響應調節因子DegU，可以調節單增李斯特菌生物膜的形成。單增李斯特菌鞭毛合成及細菌運動性都受到DegU的調控，DegU可以使細菌在高溫下黏附于塑料表面生長繁殖并形成生物膜[78]，此外，DegU與單增李斯特菌致病性、耐藥性以及持久性有關；另一部分為依賴Agr調節的群體感應系統，其在單增李斯特菌生物膜的發展過程中也起關鍵作用[89]。Agr操縱子可以調控毒力因子的表達，正向調控單增李斯特菌生物被膜的形成，并參與早期生物膜形成的黏附過程。與野生菌株相比，ΔagrA和ΔagrD突變菌株在聚苯乙烯表面上形成生物被膜的能力明顯降低[79]。Agr可以直接調控單增李斯特菌生物膜形成，還可通過調控單增李斯特菌毒力因子的表達間接調控生物膜的形成。

EPS包括蛋白質、多糖及核酸等物質，是生物膜的主要組成成分，在生物膜形成過程中EPS參與細菌的黏附過程，其形成量和性質與生物膜結構有重要的關系[90]。磷壁酸是李斯特菌生物膜基質的主要成分。革蘭氏陽性菌的dlt操縱子包括dltA、dltB、dltC、dltD4 個基因，它們催化D-丙氨酸殘基并入細胞外脂磷壁酸[91]。研究表明dltA、dltB、dltC、dltD和phoPR突變體的生物膜形成能力降低，脂磷壁酸的D-丙氨酸化作用的喪失會改變細菌細胞表面電荷，減少單增李斯特菌的附著和生物膜形成[80]。環境中營養缺乏時，低濃度的無機磷酸鹽信號可被雙組分系統phoPR感應，從而調節生物膜形成。

綜上所述，以往的研究多集中在與單增李斯特菌生物膜形成有關的已知功能的單個或多個基因上。然而，功能未知基因通常代表生物膜中30%～50%的差異表達基因[92]，而與生物膜相關的全新功能基因的解析仍較少。Stanley等[93]研究發現生物膜和浮游培養物中55%以上差異表達基因僅在一個時間點表達。上述機制突出了參與生物膜細胞形成因素的多樣性?？偠灾?，微生物在壓力條件下能夠激活多種遺傳機制，使其可在不利環境中保持活力和致病性。

4 結 語

單增李斯特菌可在脅迫條件下形成生物膜黏附于物體表面，抵抗不利環境，從而引起食品持續污染。單增李斯特菌生物膜的形成受菌體自身和外界環境因素的雙重影響。然而隨著對脅迫反應逐漸深入了解，發現其具有復雜性，因此，研究各種條件下單增李斯特菌生物膜的形成和變化機制對于食品加工中微生物的安全控制具有重要意義，將來可從以下3 個方面開展。

第一，從整個系統的角度開展分析單增李斯特菌與共存微生物間相互作用對菌群動態及脅迫耐受性影響的研究。食品加工環境影響食品相關的微生物群落組成，在真實環境條件下，單增李斯特菌往往以多菌株狀態形成混合生物膜，僅研究某一種菌在脅迫條件下的變化不能真實地反映其在食品加工環境中所處狀態。

第二，在了解生物膜空間復雜性的同時，對生物膜內基因和蛋白質表達的動態維度研究有助于揭示生物膜形成及變化的真實規律。對功能未知基因以及轉錄組學和蛋白組學的動態變化進行研究將有助于破譯生物膜形成的復雜機制。

第三，多重脅迫通常發生在食品加工和儲藏過程中，例如低pH值和高鹽濃度的處理組合，充分研究各種脅迫在時空上的綜合效應，設計更為嚴格的綜合控制方案將是未來控制單增李斯特菌污染的主要研究方向。此外，開發環境友好型抗菌方法，包括利用酶溶液、噬菌體或微生物分泌的抗菌化合物來進行微生物控制，仍然是一個有吸引力的挑戰。對脅迫反應的研究有助于全面了解微生物生理活性以及開發新的抗微生物制劑和制定新的食品安全措施。