柯薩奇病毒B3產生的2B蛋白影響鈣信號轉導并抑制細胞凋亡的研究進展

楊陽，劉文秀，王丹，鄭詩悅，趙德超

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院心血管內科，哈爾濱 150001)

心肌炎是一種由多種原因引起的心臟炎癥，與病毒感染密切相關，即病毒性心肌炎[1]。病毒性心肌炎患者的臨床表現輕重不一，輕者導致呼吸困難，重者可出現急性心力衰竭，患者的臨床結果由病毒毒力、免疫反應以及治療干預間相互作用共同決定，而細胞凋亡在其中發揮重要作用[2-3]。細胞凋亡包括內源性凋亡和外源性凋亡，內源性凋亡又分為內質網途徑凋亡和線粒體途徑凋亡，因此在病毒性心肌炎的研究中心肌細胞凋亡的機制至關重要。與人類心肌炎相關的病毒包括腸道病毒、腺病毒、皰疹病毒以及人類免疫缺陷病毒等，而腸道病毒中的柯薩奇病毒(coxsackievirus，CV)B3是患者心肌活檢中最常見的病原體之一[4-5]。2B蛋白是CVB3產生的一種關鍵非結構蛋白，具有Viroporin樣活性，可插入細胞膜及細胞器膜中，影響宿主細胞膜的生物學功能、破壞宿主細胞內鈣離子(Ca2+)的穩態，進而參與細胞凋亡的調節[6]。作為細胞內重要的細胞器，內質網和線粒體共同維持細胞內的Ca2+穩態，同時也參與細胞內源性凋亡的過程[7]?，F就CVB3產生的2B蛋白影響鈣信號轉導并抑制細胞凋亡的研究進展予以綜述。

1 小RNA病毒CVB3

1.1CVB3的結構特點 小RNA病毒科包括腸道病毒(如CV和脊髓灰質炎病毒)、鼻病毒(如人鼻病毒)等[5]。小RNA病毒均具有相似的基因組結構，其RNA基因組為6.7～10.1 kb，通常由7 500～8 000個核苷酸正鏈RNA分子組成，包含1個長的開放閱讀框、1個5′非翻譯區、1個3′非翻譯區和1個多聚腺苷酸尾[8]。開放閱讀框翻譯的RNA基因組會產生1個約2 200個氨基酸的多聚蛋白，該多聚蛋白分為P1、P2和P3區域，P1區域是包裹病毒RNA的結構性蛋白，P2和 P3區域是參與病毒RNA復制的非結構性蛋白[8-10]。

CVB3的遺傳信息存儲在1個長7.4 kb的小型單鏈RNA中，CVB3進入細胞后，首先將小型單鏈RNA翻譯成1個單一的多聚蛋白，然后多聚蛋白被蛋白酶切割成單一的病毒蛋白[9]。CVB3可編碼產生4個結構蛋白和7個非結構蛋白，其中結構蛋白以正確的方式聚集在一起，形成病毒衣殼，而非結構蛋白具有協同作用，可使病毒接管宿主細胞，確保宿主細胞產生病毒RNA，同時使細胞膜裂解，將組裝好的CVB3顆粒釋放到細胞外液中，因此非結構蛋白及其前體在宿主細胞內具有多樣而各異的功能[9-10]。

1.2CVB3感染及損傷途徑 CV通過糞口途徑傳播導致人類或小鼠的心肌炎癥，特別是CVB3。首先CVB3通過宿主腸黏膜感染并在派爾集合淋巴結、脾臟的淋巴細胞和巨噬細胞中復制，然后CVB3被釋放到血液中并傳播至各器官(如心臟和胰腺)[4]。目標細胞對病毒的內化是通過其與2個表面因子的相互作用完成，首先衰變加速因子將病毒顆粒錨定到細胞表面，然后人類和小鼠共有的CV-腺病毒受體介導CVB3進入細胞，而心肌細胞將病毒內化是CVB3誘導心肌炎發生的前提條件[11]。在感染的宿主細胞中可以看到細胞質中膜囊泡的大量增殖和積累，這些囊泡即是病毒RNA復制的部位[12]。

病毒感染可誘發宿主細胞內源性和外源性的凋亡途徑以及先天性免疫和獲得性免疫反應。大多數病毒在長期共同進化的宿主關系中獲得了調節感染、限制宿主免疫反應的能力。CVB3通過編碼多功能蛋白調控病毒繁殖以及逃避宿主細胞的免疫反應，這些非結構蛋白不僅可影響宿主細胞膜運輸系統和蛋白運輸過程，還參與破壞宿主細胞的形狀并干擾其正常生理功能，以確保整個病毒生命周期的順利完成[9-10,13]。

2 2B蛋白

2.12B蛋白的結構 2B蛋白是CVB3產生的關鍵非結構蛋白，也是具有99個氨基酸殘基的跨膜蛋白，由2個疏水區域(hydrophobic region，HR)組成，即HR1和HR2。HR1是兩親性的α-螺旋，HR2則形成完全疏水的螺旋；HR1和HR2與連接的莖環相互作用形成“螺旋-角-螺旋”結構，而這樣的結構可以在脂質雙分子層中以四聚體的形式組裝成親水性孔[6,13]。研究表明，2B蛋白與細胞器膜或細胞膜的正確結合及改變膜通透活性均需要HR1和HR2的共同存在，2B蛋白在CVB3的生命周期中起關鍵作用，可通過誘導一系列宿主細胞反應，促進CVB3的復制和釋放[14]。

2B蛋白是病毒孔蛋白Viroporins家族的一員，而Viroporins是低分子量跨膜蛋白家族，包含50～120個氨基酸，其作用方式是單體聚合形成親水孔后嵌入宿主細胞膜發揮功能[14]。Viroporins分為ⅠA、ⅠB、ⅡA和ⅡB 4種亞型，其中ⅡA型的C端和N端延伸至細胞器腔，而2B蛋白在結構上即屬于ⅡA型，即C端和N端均位于細胞器的腔內[14-15]。病毒編碼的Viroporins不僅與病毒致病性相關，還參與調節宿主細胞的電化學平衡，并影響病毒的復制，因此Viroporins家族有望成為抗病毒治療的潛在靶點[16-17]。

2.22B蛋白的膜定位和功能 2B蛋白的特定結構決定了其膜定位，特別是在細胞膜、高爾基體膜和內質網膜中。2B蛋白在細胞膜、高爾基體膜和內質網膜中形成孔隙，破壞了膜的完整性，可誘導膜重塑并阻滯蛋白的運輸[6,9]。已有研究證明，2B蛋白單獨表達即可誘導Ca2+穩態的改變，免疫組織化學染色顯示，2B蛋白通過影響質膜通透性使細胞外Ca2+流入，導致胞質內Ca2+水平升高；同時還可導致內質網內的Ca2+外流，內質網Ca2+外流可破壞內質網的穩態，誘導形成內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，促進細胞凋亡并導致線粒體Ca2+吸收減少[6,18]。以上研究均表明，CVB3產生的2B蛋白單獨表達即可導致質膜通透性增強。

3 正常情況下內質網與線粒體間的鈣信號轉導

內質網是細胞內最大的Ca2+儲存庫和鈣信號轉導的主要部位[19-20]。內質網通過特定的Ca2+通道保證攝取和釋放之間的平衡。其中，內質網的Ca2+攝取僅通過心肌肌質網Ca2+-ATP酶以ATP依賴性方式將Ca2+主動泵入內質網內，而內質網的Ca2+釋放受蘭尼堿受體和肌醇1，4，5-三磷酸受體(inositol 1，4，5-trisphosphate receptors，IP3Rs)控制，Ca2+本身對蘭尼堿受體和IP3Rs有雙相調節作用，低水平Ca2+可激活Ca2+攝取通道，而高水平Ca2+可抑制Ca2+攝取通道開放[7，10，19]。

正常情況下，線粒體通過調節鈣信號轉導調控ATP生成的關鍵酶，從而為細胞提供能量[20]。線粒體膜分為線粒體內膜和線粒體外膜，而線粒體外膜上具有電壓依賴性陰離子通道受體。研究表明，電壓依賴性陰離子通道與IP3Rs間存在物理連接，Ca2+通過電壓依賴性陰離子通道進入線粒體外膜，在線粒體外膜與線粒體內膜的接觸位點富集著線粒體鈣單向轉運蛋白完整復合物，該復合物同樣參與Ca2+的攝取[7,20]。

線粒體基質中的Ca2+積累主要通過線粒體鈣單向轉運蛋白和線粒體內膜上存在的膜電位完成。在靜息生理條件下，線粒體鈣單向轉運蛋白對于細胞質內Ca2+的親和力較低，因此Ca2+的吸收速率非常慢，但內質網-線粒體連接可以克服Ca2+攝取系統的低親和力，由內質網釋放的Ca2+在局部即可達到較高水平[7]。因此，高水平的“Ca2+熱點”可以在內質網膜與線粒膜之間緊密靠近的區域內短暫形成，在內質網與線粒體緊密結合位點間形成的這個具有高Ca2+水平的微域被稱為線粒體相關膜[7,21-22]。線粒體相關膜允許線粒體基質內大量Ca2+的快速吸收，導致線粒體代謝快速調節以滿足細胞的需求[23]。內質網與線粒體可通過多種方式影響細胞生物功能，因此，內質網-線粒體連接的正常穩態與細胞存活直接相關，維持內質網與線粒體間的適當間隔和離子轉運對細胞正常功能至關重要[23-24]。

4 2B蛋白通過影響內質網-線粒體的鈣信號轉導抑制細胞凋亡

4.1Ca2+與細胞凋亡的關系 細胞凋亡是由各種刺激引起的細胞死亡過程，該過程通過兩個途徑實現：①外源性途徑，激活細胞表面的死亡受體Fas或CD95；②內源性途徑，包括線粒體膜通透性增加和ERS的發生。傳統觀點認為，CVB3感染后直接觸發細胞凋亡反應，導致細胞膜被破壞，使細胞外Ca2+大量涌入致線粒體內Ca2+超載，進而導致細胞凋亡[9,14]。從生理功能控制到死亡程序的轉換均涉及Ca2+的嚴格調控或細胞器Ca2+水平的改變，因此破壞細胞質和細胞器內的Ca2+穩態即可通過凋亡或壞死途徑導致細胞死亡[25]。

4.22B蛋白通過激活ERS影響內質網途徑的凋亡 在CVB3感染的細胞中，2B蛋白與Ca2+水平變化密切相關。CVB3產生的2B蛋白可使被感染細胞內質網腔內的Ca2+外流，進而導致內質網腔內的Ca2+水平降低，同時導致線粒體攝取Ca2+減少[6,9-10]。2B蛋白是通過內源性途徑調節細胞凋亡，這種途徑包括ERS和線粒體途徑[6]。多種內外環境刺激(如內質網內Ca2+代謝紊亂)均可引起ERS并激活未折疊蛋白反應，進而啟動一系列下游信號，對蛋白合成與降解比例進行適應性調整，以恢復內質網的正常功能，維持細胞內的穩態；但持續或過度的Ca2+從內質網中被釋放入細胞質則會刺激內質網附近的鈣調蛋白分解酶作用于胱天蛋白酶12，使之活化并釋放入細胞質，激活相關的凋亡信號通路[26-27]。

4.32B蛋白通過減少線粒體Ca2+吸收影響線粒體途徑的凋亡 線粒體內Ca2+水平過度升高是高細胞毒性的，過量的Ca2+負荷可導致線粒體膜通透性轉換孔打開、線粒體滲透腫脹和外膜破裂以及細胞色素C等促凋亡因子釋放，這也是導致線粒體途徑細胞凋亡的關鍵原因[6,28]。有研究提出了一種可能機制，即宿主細胞凋亡信號經促分裂原活化的蛋白激酶通路傳遞給線粒體，導致細胞色素C被釋放并作用于內質網的IP3Rs，使內質網釋放入線粒體的Ca2+增加，直至達到線粒體內的Ca2+超載，但當2B蛋白插入內質網后，內質網腔內的Ca2+大量外流入細胞質，通過IP3Rs通路進入線粒體的Ca2+反而減少，從而抑制線粒體通路的細胞凋亡[28]。CVB3感染后，凋亡程序立即在細胞中啟動，但在病毒感染的中期，細胞凋亡突然停止，表明細胞凋亡被部分抑制或延遲[25]。2B蛋白抑制線粒體途徑的凋亡反應，為病毒基因組的復制提供了所需的時間，保證了病毒的成功復制與繁衍，由此可見，2B蛋白抑制細胞凋亡在CVB3的繁殖性感染中占有主導地位[9,25]。

4.42B蛋白通過抑制細胞凋亡為病毒復制提供時間 2B蛋白的主要功能就是為病毒的復制提供時間。①2B蛋白可導致內質網和高爾基體中的Ca2+水平降低，進而影響內質網與高爾基體產生的囊泡的轉運功能，抑制宿主細胞的抗病毒免疫應答；同時，也可導致囊泡積聚在細胞質中，為病毒RNA復制提供場所[6,18]。②2B蛋白可暫時性阻斷線粒體凋亡途徑，為病毒RNA復制提供時間，但CVB3感染晚期，宿主細胞的凋亡依然會恢復，因此在宿主細胞中會出現成熟的凋亡信號，這是由于線粒體膜的通透性或勢能受到破壞，最終導致被感染的細胞死亡，從而使病毒后代能夠離開宿主細胞，釋放已組裝好的病毒，進行下一輪的感染[14,28]。

2B蛋白一方面可激活ERS，引起內質網途徑凋亡，另一方面可抑制線粒體途徑凋亡，但這兩者間的復雜關系目前尚未完全明確。2B蛋白在病毒感染早期可抑制線粒體途徑的細胞凋亡，還可破壞Ca2+穩態造成ERS，而長期或過度的ERS可進一步誘導細胞凋亡[6]。在ERS的早期階段，內質網與線粒體接觸的數量增加，以此來調節線粒體的代謝以幫助細胞度過應激狀態，因此2B蛋白對內質網與線粒體的不同影響可能在感染時間方面存在差異[7,26]。有研究者在海拉細胞和感染CVB3的小鼠中轉染2B蛋白的短發夾RNA，結果發現，2B蛋白的短發夾RNA對海拉細胞中的病毒具有顯著的抑制作用，同時小鼠的存活率顯著提高、病毒組織的滴度降低、組織損傷減輕[29]?？梢?，2B蛋白對于宿主細胞更多的是一種負性作用，因此沉默CVB3 2B蛋白的基因是治療CVB3感染的有效靶點。

5 靶向2B蛋白的潛在治療方向

目前，針對2B蛋白的治療思路主要包括：①2B蛋白的基因與結構特點均已明確，因此對其進行特異性標志與檢測可作為病毒性心肌炎的一種篩查手段[6]。②在靶向病毒孔蛋白的藥物中篩選抗小RNA病毒藥物是一種可行的方法，目前有4種類型的病毒孔蛋白抑制劑具有活性，包括金剛烷、阿米洛利、烷基亞胺糖和螺旋胺，但還需進一步的詳細調查和藥物篩選[6,30]。③對互補信使RNA的特異性降解可被小干擾RNA或折疊的短發夾RNA觸發，該技術已應用于多種疾病的治療及藥物研發中[6,29,31]。④2B蛋白是腸道病毒屬共有的一類非結構蛋白，因此針對2B蛋白的有效治療可能擴大抗病毒治療策略的范圍[8,10]。

6 小 結

CVB3感染宿主心肌細胞后，作為一種病毒蛋白2B蛋白可干擾宿主細胞膜的穩定、擾亂細胞器離子穩態、損害細胞正常生理功能，最重要的是其可通過控制宿主細胞凋亡的進程支持病毒生命周期的順利完成。因此，2B蛋白可作為CVB3心肌炎的一個潛在治療靶點。雖然目前對2B蛋白的研究相對較少，但2B蛋白疏水性和膜拓撲的多樣化以及特殊的Viroporin活性，均可為抗CVB3感染的病毒性心肌炎的干擾治療提供新思路[6,8,30]。目前2B蛋白在心肌炎細胞凋亡中的作用和具體機制已逐漸清晰，未來可通過對2B蛋白的干擾實現對CVB3感染進程的控制，從而減輕CVB3對病毒性心肌炎患者心肌細胞的直接損傷。