Meesmann角膜上皮營養不良發病機制及治療的研究進展

薛海娜，王麗媛，鄭濤，趙楚楚，張毅，劉含若，劉平

(1.哈爾濱醫科大學附屬第一醫院眼科，哈爾濱 150001； 2.首都醫科大學附屬北京同仁醫院 北京市眼科研究所，北京 100730)

Meesmann角膜上皮營養不良(meesmann epithelial corneal dystrophy，MECD)是一種以上皮含有細小微囊為主要特征的罕見角膜遺傳性疾病，主要發生在歐洲地區。MECD發病的最小年齡為6個月，但由于疾病進展緩慢且無顯著癥狀，大部分患者直至青春期才被診斷[1]，因此又稱為青少年遺傳性MECD。MECD患者主要表現為流淚、畏光、眩光、異物感以及輕度視力下降，嚴重者可出現反復上皮糜爛，導致角膜出現新生血管并累及角膜前彈力層。1997年，Irvine等[2]發現，角蛋白(keratin，KRT)3基因或KRT12基因錯義突變可改變相應KRT3蛋白和KRT12蛋白的結構，導致MECD患者角膜上皮結構的穩固被破壞。目前，MECD的發病機制主要包括內質網應激、未折疊蛋白反應和凋亡[3]。另外，自噬[4]、晶體蛋白[5]等也可能與MECD的發生發展有關，但目前仍存在爭議。對于癥狀輕微的MECD患者，只需對癥治療，而對于癥狀較重或反復發作的MECD患者目前最有效的治療方式是角膜移植，但仍有一定的復發率。在體外和動物疾病模型中，小干擾RNA、規律間隔成簇短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/CRISPR相關蛋白9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 9，cas9)系統均被證實可有效治療MECD[3,6]?，F就MECD發病機制及治療的研究進展予以綜述。

1 MECD的發病機制

1.1個體表型的表現及影響因素 MECD患者在裂隙燈檢查下可見微囊性上皮混濁，在逆光照射下可觀察到大量透明、細小的微囊分散或局限于眼瞼間區并延伸至角膜緣，裂隙燈下也能觀察到灰色平行線樣改變和無病變區域[7]。透射電鏡下發現，MECD患者上皮細胞胞質中含有大小不等的空泡，在空泡中含有一些類似于溶酶體的膜結合體[8]。利用光學相干斷層成像檢查眼前段發現，除小泡外，慢性炎癥患者的角膜上皮層較正常上皮層厚，且上皮細胞中存在高反射性物質[7]。體內激光共聚焦顯微鏡檢查也發現了與光學相干斷層成像相似的高反射物質表現[9]。既往研究表明，微囊中角膜上皮的高反射性物質為退行性細胞，而基底膜的高反射性物質為增生的基底膜，類似于上皮基底膜營養不良的病理改變[10]。值得注意的是，雖然MECD主要累及角膜上皮，但其病理改變甚至可影響前彈力層。

MECD的表型可能與氨基酸突變類型相關，如攜帶KRT12-L132P基因突變的MECD患者的臨床癥狀及病理損害較KRT12-L132H基因突變的MECD患者更嚴重[3]。KRT12-L132P基因突變的MECD患者角膜含有微囊且上皮纖維化的比例更高，但也并非絕對，相同基因突變的患者在不同地區會出現不同的癥狀。如1例美國KRT12-L132P基因突變的MECD患者無癥狀，而部分日本相同基因突變MECD患者則表現為干眼、異物等癥狀且病理損害更嚴重[7]。

1.2內質網應激和未折疊蛋白反應 KRT12基因錯義突變可破壞內質網穩態，導致未折疊和錯誤折疊蛋白的積累，最終導致內質網應激和未折疊蛋白反應。有研究在攜帶KRT12-L132P基因突變的人源化小鼠角膜上皮中觀察到KRT聚集，提示KRT12-L132P基因突變是MECD的重要致病因素[3]。未折疊蛋白反應首先通過減少蛋白質的生物合成緩解內質網超載，并上調細胞質分子伴侶蛋白(如熱激蛋白)水平，糾正錯誤折疊，緩解內質網應激[11]。免疫球蛋白重鏈結合蛋白可結合未折疊蛋白，使底物蛋白保持易折疊的狀態。適應性反應通過3個分支系統維持細胞穩態，即蛋白激酶R樣內質網激酶、需肌醇酶1、活化轉錄因子6分別與免疫球蛋白重鏈結合蛋白解離后活化[12]。蛋白激酶R樣內質網激酶和需肌醇酶1為內質網Ⅰ型跨膜糖蛋白，活化轉錄因子6為內質網Ⅱ型跨膜糖蛋白。蛋白激酶R樣內質網激酶通過磷酸化翻譯起始因子2α亞單位，使其不能形成翻譯起始復合物而抑制蛋白質合成[12]?；罨D錄因子6可增強內質網分子伴侶編碼的轉錄活性，提高內質網蛋白的轉運、折疊和降解能力；需肌醇酶1可幫助底物剪切、編碼轉錄因子并增強脂質合成基因的活性[13]，而高脂肪酸和高膽固醇可使內質網膜腔擴張，最終緩解內質網應激。

由于錯誤折疊蛋白的持續表達，轉錄因子CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)在活化轉錄因子6和蛋白激酶R樣內質網激酶的誘導下被激活，導致細胞凋亡[14]。CHOP通過激活一系列凋亡反應蛋白，使磷酸化的翻譯起始因子2α亞單位信使RNA去磷酸化，增加蛋白的翻譯和合成[12]。CHOP可在內質網中形成過氧化環境或活化胱天蛋白酶(caspase)，caspase-12是內質網應激誘導的特異性細胞凋亡的調節因子，可通過刺激caspase-9而誘導細胞凋亡。研究顯示，與野生型小鼠相比，攜帶KRT12-L132P基因突變的人源化小鼠角膜上皮凋亡標志物CHOP、caspase-12水平均升高；同時，在MECD患者角膜上皮中也發現了CHOP、caspase-12等促凋亡因子[15]。另有研究顯示，與野生型小鼠相比，KRT12-L132P基因突變小鼠模型角膜上皮凋亡水平增加了17倍[3]。此外，內質網應激還可促進鈣離子釋放進入細胞質，導致線粒體鈣超載、細胞色素釋放，促進凋亡小體形成，最終導致細胞膜破裂和細胞凋亡[16]。

1.3KRT結構的變化 KRT3(Ⅱ型、堿性KRT)和KRT12(Ⅰ型、酸性KRT)為角膜上皮細胞的骨架蛋白，可通過與核膜結合維持表皮的完整性。KRT由N端頭部、α-螺旋桿部和C端尾部組成，α-螺旋桿部由4個螺旋片段(即1A、1B、2A和2B)組成，通過非螺旋樣結構的連接成分(L1、L12、L2)相互連接，而頭部和尾部的非螺旋區域含有大量磷酸化位點[17]。需要注意的是，螺旋起始基序(helix-initiation motif，HIM)和螺旋終止基序(helix-termination motif，HTM)結構保守，HIM和HTM區域的基因突變可引起MECD。研究發現，最常見的KRT12基因突變是p.R135T，且僅在歐洲人中檢測到，推測可能與人種差異有關[18]。另有研究表明，p.L132P基因突變導致的臨床癥狀更嚴重[19]。除p.R84W在頭部發生突變外，KRT3中的所有突變均位于KRT3的HTM區域[3]，見表1。

KRT3和KRT12組裝成平行二聚體后，將兩個平行二聚體的桿部N端半部分重疊形成反向平行的四聚體，隨后組裝成“60 nm絲”，這些納米纖維在體外組裝形成厚度為10 nm的繩索狀納米絲[36]。

由于KRT3或KRT12基因突變，相應的KRT3或KRT12蛋白結構改變，形成不穩定的平行二聚體，使細胞脆性增加。MECD患者角膜上皮中的KRT6和KRT6a表達上調可減少角質形成細胞的遷移，幫助上皮修復[3]。同時，KRT6還具有抗菌作用，而KRT16作為免疫調節的一員，一般在正常角膜上皮中無表達，但在MECD患者角膜上皮細胞中可觀察到KRT16的表達[37]。綜上，KRT6和KRT16在應激反應中表達上調，包括紫外線應激、切口愈合和氧化應激。

在胚胎早期，KRT5和KRT14以異源二聚體的形式在基底層、角膜和角膜上皮中表達，隨著外周層中KRT12表達的增加，KRT14的表達逐漸減少[38]。相反，在無KRT12的情況下，其他KRT(如KRT14)可上調[5]。穩定的細胞內聚不僅需要KRT中間絲的表達，還需要橋粒與中間絲的相互作用。既往研究發現，KRT5/KRT14(主要是KRT5)支持穩定且高度黏附的橋粒，而KRT6/KRT7則通過減少細胞間黏附增強橋粒的活性[39]。研究顯示，與正常角膜相比，MECD患者上皮細胞中的KRT5、KRT14、KRT6和KRT16蛋白豐度均顯著增加[3]。以上研究均提示，橋粒并不是MECD主要的致病機制。

1.4晶體蛋白在MECD中的作用 晶體蛋白是晶狀體的主要蛋白，可保持晶狀體的透明度。α晶體蛋白對晶狀體的細胞質具有保護作用，包括抑制細胞凋亡、增強晶狀體細胞的抗應激性、維持細胞骨架的完整性等；當視網膜上皮細胞發生嚴重應激時，細胞內的β晶體蛋白、γ晶體蛋白也具有保護作用，其既可保護視網膜細胞，又可抑制細胞凋亡[40]。因此，晶體蛋白在抑制角膜上皮細胞凋亡方面具有重要意義。同時，晶體蛋白與細胞骨架的相互作用可以防止中間絲的異常聚集。因此，與小熱激蛋白一樣，晶體蛋白在角膜上皮中作為分子伴侶識別變性蛋白，并主動與變性蛋白結合形成小熱激蛋白底物復合物，阻止變性蛋白的積累[41]。在KRT12-L132P基因突變的純合子小鼠模型的角膜上皮細胞中也發現了晶體蛋白基因的上調[3]，但具體作用機制仍需進一步探索。綜上可知，晶體蛋白對MECD也有保護作用，不僅可防止異常的蛋白質堆積，還可抑制MECD患者角膜上皮細胞凋亡。

1.5自噬 自噬是一種主要的細胞內降解系統，可將非天然蛋白(如錯誤折疊蛋白)放置在蛋白酶體和溶酶體的腔室中進行降解[42]。自噬參與多種由KRT基因突變引起的疾病，如年齡相關性黃斑變性。KRT8可促進年齡相關性黃斑變性模型視網膜色素上皮細胞氧化應激后自噬體和溶酶體的融合[4]。同樣，KRT5的自噬作用對于正常的包皮腺體分化也至關重要[43]。另外，KRT18的自噬作用也被證實[43]。共聚焦檢查發現，MECD患者角膜上皮可見溶酶體樣空泡，病理上可見胞質內囊樣包涵體[44]。由于KRT的異常聚集，包裹體被蛋白酶體降解形成溶酶體樣空泡。自噬異常也是包涵體形成的原因之一。

2 治 療

目前MECD尚無有效的臨床藥物治療，若患者癥狀輕微(如畏光、流淚、眼干、異物感以及角膜上皮點狀缺損)只需對癥治療，如利用人工淚液、護目鏡、睫狀肌麻痹劑、角膜繃帶鏡等緩解癥狀。對于癥狀嚴重或反復發作的患者則需手術治療。目前的手術方式主要包括激光消融和角膜移植，但術后仍可能復發。

2.1激光消融治療 攜帶KRT12-L132P基因突變的MECD患者可出現復發性角膜上皮侵蝕和上皮下纖維化等嚴重癥狀，需要行上皮清創術、準分子激光治療性角膜切削術[3]等，其中準分子激光治療性角膜切削術是首選的治療方式。準分子激光治療性角膜切削術可有效去除角膜上皮或前彈力層的病變區域，局部絲裂霉素C與準分子激光治療性角膜切削術聯合治療可降低MECD患者的復發率[45-46]，但聯合治療后仍可能復發。如1例34歲女性MECD患者接受激光治療性角膜切削術后3個月角膜上皮微囊再次出現，且1年后出現視力下降[47]。另外，1例 33歲的白人男性MECD患者在接受激光治療性角膜切削術聯合絲裂霉素C治療后也出現了復發且視力下降[1]。

2.2角膜移植手術治療 隨著科技的進步和手術方式的改進，角膜移植已不再是首選治療方式。但對于癥狀嚴重且反復發作的MECD患者，板層角膜移植或穿透性角膜移植仍是最有效的治療方式[3]。穿透性角膜移植雖然是MECD最有效的治療方式，但角膜排異導致其風險增大，無法達到良好的預后效果。板層角膜移植術是近年的主流術式，主要優點為創傷小，可以替換病變角膜上皮及前彈力層，且對角膜內皮的影響較小，因此并發癥及術后的風險相對較低，術后恢復快。但也有研究報道了MECD患者出現板層角膜移植術后復發或穿透性角膜移植術后復發的案例[2,47]。

2.3基因治療 目前關于MECD的治療研究主要集中于穩定角膜上皮的小分子療法方面。一項應用小干擾RNA治療KRT12基因突變小鼠模型的研究顯示，小干擾RNA治療的一個嚴重不良反應為脫靶效應，雖然可最小化MECD小鼠模型不必要的脫靶效應，但未來還需在臨床試驗中對患者是否存在脫靶效應進行全面評估[19]。CRISPR是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御系統，可有效防止病毒或質粒DNA的入侵，CRISPR/cas9技術是目前醫療領域中最先進的基因編輯方式，可通過靶向基因修飾矯正疾病基因的突變[6]。Courtney等[48]發現，在MECD患者的角膜中，KRT12-L132P基因突變可產生一個新的原間隔序列鄰近基序，為研究者提供了可設計的向導RNA與原間隔序列鄰近基序的相鄰序列互補，最終使致病基因不再表達；另外，CRISPR/cas9技術不僅在體外細胞中可顯著降低致病基因相關蛋白的表達，在攜帶KRT12-L132P基因的小鼠模型中也可觀察到KRT12-L132P基因內的移碼缺失，為顯性錯義突變的治療提供了新方向。

3 小 結

由于KRT12基因中的雜合突變導致KRT蛋白不能折疊成正確的二級或三級結構，錯誤折疊蛋白質沉積在內質網中，引起內質網應激，繼而引起未折疊蛋白反應緩解應激狀態。此外，自噬和一些KRT上調也可幫助蛋白質正確折疊來緩解應激狀態。然而,未折疊蛋白反應時間過長會進一步加重內質網應激,最終導致細胞凋亡，形成微囊。當細胞微囊向上移動、破裂并形成上皮點狀缺損時，常被誤診為干眼的癥狀。此外,微囊的形成可能是由異常的平行二聚體增加了細胞脆性，使上皮細胞無法抵抗機械應力所致。未折疊蛋白反應和細胞凋亡機制仍需進一步驗證，包括晶體蛋白和自噬的作用以及KRT的改變等。未來基因治療前景廣闊，但仍需大量研究驗證。