膠質細胞源性神經營養因子在聽覺相關系統中作用的研究進展*

周爽 廖華

1 武漢大學人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科(武漢 430060)

神經營養因子是影響神經元發育和維持神經可塑性的重要因子，膠質細胞源性神經營養因子(glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF)是由膠質細胞衍生的神經營養因子，是一種糖基化、二硫鍵結合的同型二聚體蛋白，是轉化生長因子-β超家族的成員，具有支持神經元的生長，助于神經元的存活和分化，并抑制細胞死亡的作用，可以保護聽覺系統的感覺細胞免受噪聲的破壞等[1]。因GDNF對多巴胺能神經元、運動神經元、感覺神經元等明顯的神經營養作用，目前已經成為治療帕金森病、腫瘤等疾病的研究熱點[2,3]。在胚胎發育和成熟動物的耳蝸神經元及毛細胞內均檢測到GDNF的mRNA和蛋白的表達，而GDNF的表達量在噪聲損傷和缺血等情況下升高，證明其潛在的內源性神經營養因子保護作用[4]。GDNF在與聽覺系統相關的組織中均有表達，如下丘、海馬、上橄欖復合體等，目前關于GDNF在聽覺系統等神經營養作用的研究成為熱點，并可能有助于臨床治療內耳疾病，本文對GDNF在聽覺系統相關組織中的作用進行綜述。

1 GDNF概述

GDNF在細胞內信號傳導過程中，首先結合錨定的糖基磷脂酰肌醇GDNF家族受體α1(GDNFRα1，GFRα1)，隨后與跨膜酪氨酸激酶受體(rearranged during transfection，RET)和神經細胞粘附分子(nerve cell adhesion factor, NCAM)結合，誘導細胞內信號傳導[5]。GDNF通過與RET和細胞表面結合共受體發出信號，形成GDNF/GFRα/RET復合物，使RET活化，引起RET蛋白受體磷酸化并使RET進入激活狀態，被激活的RET將磷酸化其底物，造成下游信號通路的激活。RET蛋白參與的信號通路包括PI3K-AKT-mTOR途徑及RAS-RAF-MEK-ERK途徑。PI3K-AKT-mTOR途徑參與細胞存活和多巴胺能神經元促生長和分化作用， RAS-RAF-MEK-ERK途徑參與細胞增殖和促神經元存活和突觸生長作用，因此，RET蛋白在細胞存活、遷移、增殖上均有一定的作用[6]。在早期發育中，GDNF-RET信號通路促進神經細胞的增殖和遷移，從而促進神經內分泌器官的生長，并促進神經系統和周圍神經系統的發展。研究顯示，在噪聲或耳毒性藥物損傷后，應用外源性重組或病毒表達的GDNF對于內耳具有保護作用并可保存一定的聽力，證明GDNF在聽覺系統具有明顯的神經營養作用[7]。

2 GDNF在聽覺系統中的作用

2.1GDNF在耳蝸中的作用 在大多數聽力損失病例中，毛細胞受損或缺失，嚴重損害了聲音感知[8]。耳蝸螺旋神經節神經元(spiral ganglion neuron,SGN)是傳導聽覺信息的一級神經元, 噪聲、感染、耳毒性藥物和衰老等諸多因素直接或者間接使螺旋神經節神經元受損,導致感音神經性聽力損失,而哺乳動物螺旋神經元的再生能力非常低,因此保護螺旋神經元或者修復受損的螺旋神經元對恢復聽力有關鍵性的作用。神經營養因子是神經細胞存活的依賴因子,是成熟神經元功能的調控因子,也是神經元受損和病變損傷時保護和促進其再生的必需因子[9]。Euteneuer等[10]通過對體外新生和圍生期大鼠聽覺系統主要神經元即螺旋神經節細胞的研究，發現發育中小鼠螺旋器中RET和NCAM 傳入樹突神經支配增加，GDNF/GFRα1信號通路刺激激活細胞內PI3K/AKT和MEK/ERK信號級聯反應，外源性GFRα1增強GDNF對大鼠圍生期神經突觸數量的刺激作用，GDNF/GFRα刺激大鼠螺旋神經節外植體誘導AKT和ERK磷酸化，抑制這些信號傳導途徑減少了GDNF/GFRα1誘導的軸突生長，GDNF/GFRα1均在體外刺激SGN軸突數。GDNF/GFRα1刺激激活AKT和MEK/EEK信號傳導，同時抑制這兩個信號傳導級聯也會抑制GDNF的體外作用。此實驗證明GDNF信號通路通過與其受體NACM結合，對于出生后螺旋神經節(spiral ganglion, SG)具有明顯的神經營養作用。

Akil等[11]通過新生小鼠的圓窗膜將編碼腺相關病毒載體血清5(adeno-associated virus vector serotype 5, AAV-5)載體轉導入內耳后，在內毛細胞和SGN中觀察到強烈的GDNF受體的表達；GDNF表達出神經營養蛋白，用于轉導毛細胞和SGN。而高濃度AVV-5注射的新生小鼠觀察到嚴重的神經系統損傷(震顫、協調不良、共濟失調、尾巴畸形等)和重度聽力損失，而應用1:10和1:20稀釋的AVV-5注射液后未出現上述癥狀；14日齡小鼠在注射高濃度AAV-5后未引起上述變化，說明GDNF在小鼠幼年期作用明顯。該研究顯示，GDNF可以在創傷后長達6周的實驗性聾大鼠耳蝸內顯著減少螺旋神經節神經元的繼發性退化[11]。GDNF的干預導致螺旋神經節神經元維持電響應性，表現為電誘發聽性腦干反應的刺激閾值明顯降低；在沒有GDNF干預的情況下，耳聾大鼠螺旋神經節細胞持續丟失，伴隨著電反應性的降低，表明螺旋神經節細胞密度與電反應閾值之間存在很強的相關性。

Harasztosi等[12]使用lacZ敲入等位基因，證實了GDNF在小鼠耳蝸中的表達，包括在發育過程中的感覺區域。通過基因敲除抑制小鼠毛細胞和/或聽覺神經元中GDNF的表達，發現GDNF表達對于維持聽覺系統不同水平的功能性聽力具有重要作用。為驗證GDNF對失神經支配的SGN的神經保護作用，有學者通過對豚鼠注射耳毒性藥物，造成毛細胞失活，然后通過耳蝸內注射5 μl AdGDNF，飼養1到2月后對其內耳SG細胞進行計數，結果顯示注射GDNF的豚鼠相對未注射者SG細胞存活率明顯增加。運用GDNF加電刺激對全聾豚鼠的SG神經元存活率較單種處理方式更高，并推測GDNF和電刺激的運用有助于人工耳蝸植入患者的聽覺恢復[13]。

聽覺器官中的內、外毛細胞以及螺旋神經節神經元對于維持正常的聽力都是必不可少的，人工耳蝸的開發和臨床應用表明，單獨的螺旋神經節神經元在與電刺激結合時可能起重要作用。因此，人工耳蝸植入者保持適當功能的螺旋神經節神經元群非常重要；然而，人類螺旋神經節神經元的繼發性變性發生在毛細胞受損后的數年之內，因此，到最終選擇人工耳蝸可能需要相當長的時間；而豚鼠神經變性的過程要快得多，在感覺性毛細胞丟失的幾周內就可以檢測到電反應性明顯降低，這使得豚鼠模型可用于關于增強螺旋神經節神經元的存活和功能并因此改善人工耳蝸植入的功效的研究[11]。

綜上所述，GDNF對于維持SGN的功能進而維持聽覺系統的功能具有重要的支持及營養作用，尤其是幼年期，對于耳蝸疾病的治療可能存在巨大的應用前景。

2.2GDNF在下丘中的作用 下丘是聽覺信息突觸傳遞的重要部位，它代表特定的聽覺處理區域，向聽覺丘腦和聽覺皮層提供所有腦干預處理的聽覺信息，它還代表了一個感官信息分析站點，輸入大量下行信息[14]。既往有研究顯示噪聲刺激下耳蝸內多巴胺降低,長時間強噪聲暴露下大鼠腦內多巴胺的含量也是降低的[15,16]。GDNF能夠支持多巴胺能神經元的生長和存活，可通過激活RET的多組分受體復合物和GDNF家族來促進多巴胺能神經元的生存和分化。研究表明，顱內輸注GDNF和腺相關病毒編碼的GDNF均增加了18氟-多巴胺的攝取，提示GDNF在治療帕金森病患者時對多巴胺能神經元具有明顯的營養作用[17]。

Wissel等[18]運用氨基糖苷誘導大鼠耳聾后，發現耳聾大鼠下丘中GDNF家族的所有成員及其受體的基因表達模式受到低水平調控，但無統計學意義，而耳聾大鼠聽覺神經中GDNF及其受體GFRα1和RET表達量明顯增加，證明GDNF在毛細胞受損后對聽覺神經具有重要的保護作用；作者推測GDNF表達量增加的原因為剝奪性上調從而形成對聽覺神經細胞的保護作用,內源性的GDNF通過過表達來維持聽覺神經的穩定，但內源性神經營養因子的過表達無法滿足長期維持聽覺神經穩定的需要，說明神經營養因子通過復雜的信號通路影響細胞存活和凋亡的平衡。

王蘋等[19]將脂肪間質干細胞與胚胎中腦細胞共培養7 d后，通過酪氨酸羥化酶免疫熒光染色確定多巴胺能神經元的存活，發現脂肪間質干細胞共培養組酪氨酸羥化酶陽性細胞明顯多于單純多巴胺能神經元培養組，說明脂肪間質干細胞本身可能分泌某些營養神經的因子，抑制了多巴胺能神經元的延遲性死亡。其通過進一步實驗，將脂肪間質干細胞經GDNF基因修飾后，再與多巴胺能神經元共培養，發現多巴胺能神經元存活率更高，說明GDNF對于多巴胺能神經元的存活具有重要的營養支持作用。

GDNF不僅對多巴胺能神經元具有營養、支持及保護作用，對于神經前體細胞向多巴胺能神經元的分化也具有促進作用。因此，對GDNF在下丘內多巴胺能神經元的營養、支持作用的研究，對于臨床上治療下丘相關的聽覺系統疾病等具有一定的應用前景。

2.3GDNF在上橄欖復合體(superior olivary complex，SOC)中的作用 上橄欖復合體是接受耳蝸核聽覺上行傳導通路纖維的腦干初級聽覺中樞，由四個亞核組成：外側上橄欖核、內側上橄欖核、橄欖周核和斜方體核，其與腦干其他核團，如：外側丘系核、內側膝狀體、下丘、耳蝸核等都有復雜的聯系，上橄欖內側核和外側核細胞可識別雙耳傳來的信號中的強度差和時間差[20,21]。研究顯示，射頻暴露可造成海馬、小腦內神經元的神經損傷。Maskey等[22]通過對小鼠進行835 MHz射頻輻射3個月后，發現GDNF作為保護因子，其免疫反應性在SOC中明顯降低，表明GDNF在射頻暴露后其神經營養支持作用發生了改變，可能會影響中樞聽覺系統的功能。因此，GDNF對于SOC這一初級聽覺中樞亦具有神經營養作用。

3 GDNF在耳鳴中的作用

耳鳴是指在沒有外界聲音刺激下的聲音感知，其發生機制不明確且錯綜復雜。越來越多的研究證明，對耳鳴的適應高度依賴于神經可塑性和功能失調的聽覺通路恢復。研究顯示聽覺通路的任何部位異常，包括蝸神經、聽神經或中樞聽覺傳導通路等均可導致耳鳴[23]。對人體的神經影像學研究顯示邊緣系統可能在耳鳴的非中樞聽覺傳導通路其他區域起主要作用。在動物模型中，耳鳴伴有進行性再生的神經回路的重塑，對耳鳴的反應與神經營養因子的表達相關，這激發了人們對使用這些因子治療耳鳴的興趣[24]。神經心理學研究顯示壓力和負面情緒可能增加對耳鳴的感知，邊緣系統在慢性耳鳴的病理生理學機制中不可或缺；海馬和海馬旁區域的記憶/認知機制在耳鳴持續感知、焦慮、困擾中有重要作用。研究顯示，在邊緣系統參與耳鳴的進程中，可產生負面認知和情緒，并將患者的注意力聚集到耳鳴上，從而形成了耳鳴和負面情緒的惡性循環[25]。

成年的顆粒細胞(granular cell， GC)在正常生理條件下有助于認知過程，例如學習記憶和認知等。有研究證明神經系統疾病和情緒障礙對成年海馬神經元具有有害作用，因聽覺系統和邊緣系統是相通的，耳鳴的聲音會影響邊緣系統的情緒和認知功能。杏仁核和海馬是兩個主要的直接或間接接收從中樞聽覺系統輸入神經元的區域[26]；反過來，從邊緣系統到聽覺腦區有直接或間接的能夠影響神經元活動或調控突觸可塑性的映射。Bonafina等[27]研究表明GFRα1是新生GC成熟所必需的，這對于空間記憶至關重要，并且會觸發內源性GDNF表達。因此，GDNF/GFRa1復合體代表了一種關鍵介體，它將運行活動與空間記憶所需的結構可塑性和突觸整合的控制聯系在一起。GFRα的缺乏導致小鼠的空間記憶處理能力下降，而GDNF/GFRα復合物介導活動誘導成人GC的重塑；可見，GDNF對于耳鳴的情緒和認知是一種重要營養因子。

γ-氨基丁酸(GABA)及其受體介導了中樞神經系統大多數突觸抑制，GABA受體的正常數量和功能對于維持興奮性和抑制性神經傳遞之間的平衡至關重要[28]。耳科疾病，尤其是耳鳴，伴隨著GABA能系統的紊亂，小樣本臨床研究表明，GABA受體激動劑苯二氮卓類藥物可有效降低耳鳴評分，證明GABA受體異?？赡苁嵌Q發展的基礎[29]。Wu等[30]通過水楊酸鈉注射致大鼠耳鳴，研究大鼠中樞神經系統GABAA受體結合和代謝活性的影響，結果發現， GABAA受體結合增強，代謝活性增加，且聽覺和邊緣系統都參與了水楊酸鈉誘導的耳鳴，增加的神經活動可能是耳鳴形成的基礎，而增加的GABAA受體結合可能涉及耳鳴的環節。Koelsch等[31]發現胸腰部脊髓傷2小時后，脊髓注入編碼GDNF的皰疹病毒基載體可在傷后5周內持續改善運動功能，體外向初級脊髓神經元中添加重組GDNF蛋白可通過MEK-ERK途徑增強神經突生長、突觸連接和GABA能神經傳遞。

Martin和Raphael等[32]研究發現，GDNF基因過表達可對耳鳴進行相對有效的治療。Orenay-Boyacioglu等[33]研究慢性耳鳴與GDNF多態性(rs884344，rs3812047和rs1110149)之間的關系，以確定它們在耳鳴的病理生理作用，通過對耳鳴患者GDNF基因rs1110149多態性的研究顯示，其雜合性相對于正常人顯著降低；而由于樣本量較小，尚無法檢測到耳鳴與GDNF多態性之間的相關性，說明GDNF基因在不同的組織和病理中具有可變的表達模式。Sand等[34]研究耳鳴患者中編碼GDNF基因的遺傳變異，結果顯示，GDNF和BDNF基因多態性與耳鳴嚴重程度有關，且GDNF變體可能有助于評估明確定義的耳鳴亞群中癥狀控制的潛力。目前因耳鳴機制的不確定性導致耳鳴的治療成為難題，GDNF在耳鳴機制中的作用研究有可能對治療耳鳴取得進一步進展。

GDNF存在于中樞與外周聽覺系統中各個部位，對于突觸可塑性具有重要的保護作用，而對于GDNF在耳鳴發生發展中作用的研究將有助于提高對耳鳴的認知并發現可能的治療方案。

4 總結

GDNF是重要的神經營養因子，具有廣闊的神經營養作用，能夠支持神經元的存活，影響神經元的發育和分化，且對多巴胺能神經元有高度的親和力并能促進其存活。目前研究證明GDNF在聽覺系統中耳蝸毛細胞、下丘、上橄欖復合體、聽神經等都有表達且具有重要的營養保護作用，GDNF在海馬的記憶認知功能中也有重要作用，其對于耳鳴的發病機制研究具有廣闊的前景。然而，目前對于GDNF在聽力學相關疾病中的具體作用機制和未來的治療前景仍需要進一步探究。