增生性瘢痕的分子生物學研究進展

李俊杰 劉凱

【提要】 盡管目前臨床上針對增生性瘢痕已有了一些較為有效的治療措施，在治療效果上也取得了長足的進步，但因其發病機制尚未完全明確，因此仍存在較多問題。本文就增生性瘢痕的基礎分子生物學研究進展進行綜述，旨在為進一步認識、治療增生性瘢痕提供參考。

傷口愈合是一個復雜的過程，包括止血、炎癥、細胞增殖與再上皮化、組織重塑4個階段[1]。受傷后，人體的血液凝固系統被激活，血小板與膠原蛋白相關的級聯反應開始止血[2]。炎癥階段中，受損組織與活化的血小板一起通過募集免疫細胞(如嗜中性粒細胞和巨噬細胞)引起炎癥反應[3]。這些免疫細胞的主要作用是清除傷口的細菌與碎屑。當炎癥逐漸消退時，出現新的血管和結締組織，標志著增殖階段的開始。在該階段，傷口面積由于傷口收縮而縮小。同時有光澤的深紅色肉芽組織形成，并逐漸形成新的血管。再上皮化這一過程在該階段起著至關重要的作用，上皮細胞從傷口床或傷口邊緣逐漸延展并最終覆蓋傷口。之后，就進入了組織重塑階段。該階段主要涉及新生血管的衰退與細胞外基質的重建。傷口愈合的每個階段都需要復雜的協同作用及多個細胞群體的調節。干擾其中任一過程都可能導致傷口愈合的失敗，造成傷口的不愈合或過度的瘢痕組織形成[4-5]。

瘢痕與正常皮膚不同，主要由結構異常和過度密集堆積的膠原纖維組成，并且伴有毛囊與腺體的缺失[6]。病理性瘢痕分為增生性瘢痕和瘢痕疙瘩[7-8]。增生性瘢痕是在皮膚受到物理損傷的部位產生過多的膠原組織，這些組織仍保留在原始病變的邊界內。增生性瘢痕又可以分為線性增生性瘢痕和廣泛增生性瘢痕。線性增生性瘢痕通常是由于手術或局部創傷而引起的，而廣泛增生性瘢痕可能是大面積燒傷或軟組織感染的結果。與增生性瘢痕不同，瘢痕疙瘩涉及過度增生的瘢痕組織，其特點是瘢痕擴展超出了初始病變的范圍。瘢痕疙瘩在治療后消退的機會很小，復發的機會很高。瘢痕疙瘩又可以分為小型瘢痕疙瘩(瘢痕超出初始病灶邊界的距離小于0.5 cm)和嚴重型瘢痕疙瘩(瘢痕超出初始病灶邊界的距離超過0.5 cm)[5]。增生性瘢痕和瘢痕疙瘩在組織學上也存在著差異，增生性瘢痕內Ⅲ型膠原纖維結構良好，而瘢痕疙瘩中則存在Ⅰ型和Ⅲ型膠原束的紊亂。鑒于瘢痕疙瘩動物模型的缺乏[9]，關于病理性瘢痕的基礎研究主要集中在增生性瘢痕上。

增生性瘢痕的研究主要聚焦在成纖維細胞以及肌成纖維細胞上，前期的研究已確認這兩種細胞是增生性瘢痕病理形成過程中主要的效應細胞[10-11]。其生物學行為的改變，如增殖、遷移、收縮等能力的變化，都可以在創傷愈合中對細胞外基質的形成與重塑產生重要的影響，從而導致增生性瘢痕的形成[12-14]。長期以來，關于增生性瘢痕的研究局限在成纖維細胞、肌成纖維細胞中TGF-β/Smad信號通路、Wnt/β-catenin信號通路、PI3K/AKT/mTOR信號通路、Hippo信號通路、Notch信號通路和 Hedgehog信號通路等經典作用通路上[15-16]。近期開展的一些關于增生性瘢痕的研究，不僅將之前的基礎研究進行了深入與拓展，還將目光聚焦在了其他細胞對增生性瘢痕的機制研究上。本文將主要針對這兩部分研究進行綜述，以期為增生性瘢痕的臨床治療提供新思路。

1 成纖維細胞相關基礎研究進展

1.1 表觀遺傳對成纖維細胞的影響

成纖維細胞活化成肌成纖維細胞是增生性瘢痕發展過程中不可缺少的步驟。研究表明，在體外培養數代后，增生性瘢痕或瘢痕疙瘩組織中提取的原代肌成纖維細胞的特定特征仍然可以保持，這表明肌成纖維細胞具有“記憶力”，這可能是由表觀遺傳修飾所介導，這些表觀遺傳修飾的存在維持了肌成纖維細胞的活化表型。表觀遺傳學通常通過DNA甲基化、組蛋白修飾和miRNA調控等來調節基因表達。

DNA的CpG島區域的甲基化修飾是導致基因沉默的重要機制之一，關于成纖維細胞的研究發現，與纖維化密切相關的α-SMA蛋白的調控基因ACTA也受到該過程的調控[17-19]。在Ⅱ型肺泡上皮細胞中，ACTA基因調控區和內含子區的3個CpG島高度甲基化，α-SMA表達受到抑制。在肺成纖維細胞中，用甲基化抑制劑5'-硫唑嘌呤-2'-脫氧胞苷處理后，ACTA基因的甲基化水平被下調，基因轉錄被激活[20]。在纖維化期間，除ACTA基因外，DNA甲基化還可以修飾多種基因。在源自硬皮病的成纖維細胞中，Smad7或FLI-1(ECM合成抑制基因)也被高甲基化沉默，這表明DNA甲基化可能使抑制ECM合成的基因沉默，從而導致皮膚纖維化[18,21]。研究發現，使用小分子干擾RNA技術抑制成纖維細胞中DNA甲基化轉移酶的表達，可導致ACTA基因的轉錄激活[19,22-23]。上述研究提示，有可能通過特異性控制纖維化和抗纖維化基因的甲基化水平來治療增生性瘢痕及其他纖維化相關疾病。

組蛋白修飾發生在整個增生性瘢痕形成過程中。通常，組蛋白修飾對于增生性瘢痕相關基因如ACTA等的調控是間接性的[24-25]。組蛋白去乙?；?、6和8(HDAC 4、6和8)是組蛋白修飾的重要調控因子。研究發現，HDAC4可能會影響TGF-β1誘導的成纖維細胞分化信號通路中AKT蛋白的激活，但是這些組蛋白去乙?；笇w維化相關靶基因的直接作用尚未闡明[26]。研究表明，組蛋白乙?；ǔＥc增生性瘢痕相關靶基因的激活有關。因此，研究認為可以通過增加一些ACTA抑制基因啟動子區域的乙?；?，來實現對ACTA基因表達的抑制[27]。除組蛋白乙?；?，研究還發現組蛋白甲基化也參與了成纖維細胞的激活以及纖維化的形成過程[28]。目前，在皮膚傷口愈合模型中，在再生性和非再生性傷口之間檢測到不同的組蛋白乙?；Ｊ?，探索組蛋白乙?；龠M傷口愈合與皮膚再生、抑制增生性瘢痕形成的具體機制，可能是今后研究的方向。

近年來的研究發現，各種miRNA能通過調節TGF-β/ Smads等經典增生性瘢痕進展相關通路，干擾上皮間充質轉化、細胞外基質的合成和降解等過程[29-30]。研究還發現，瘢痕組織中的miRNA表達模式與正常組織中的不同。miR-132參與纖維化并通過抑制MeCP2[31]表達和降低PPARγ表達間接增強了成纖維細胞中ACTA基因的表達。let7和miR-21也可分別通過激活HMGA2和Smad7間接影響成纖維細胞的激活，即肌成纖維細胞的形成[32-33]。miR-143-3p和miR-27b均可通過抑制細胞外基質的表達，起到預防增生性瘢痕的發生與發展的作用[34-36]。此外，研究發現，一些miRNA可以通過影響經典的增生性瘢痕相關信號通路來促進纖維化。大量研究表明，成纖維細胞中的miR‐29是影響纖維化的核心miRNA。在硬皮病患者皮膚活檢樣本提取且體外培養的成纖維細胞中，miR‐29表達顯著降低。同時，肺成纖維細胞中miR-29的敲低或下調可以在體外激活纖維化相關基因。更多證據表明，心臟成纖維細胞中miR-29的下調可以在體內和體外誘導纖維化相關基因的表達，而其高表達可以抑制纖維化[30,37]。同時，大量的研究也證實，miRNA能通過干擾TGF-β信號通路影響增生性瘢痕的進程[38-39]。如miR-140-5p能下調TGF-β II受體的活性，而miR-23b和let-7 g則上調TGF-β II受體的活性。臨床數據證實，miR-17-5p和miR-20對TGF-β II受體活性的調節還影響著增生性瘢痕的進程[40-41]。除了這些核心miRNA，還有miR-4269、miR-27、miR-203、miR-205、miR-150和miR-196a等多種miRNA被認為會影響TGF-β1信號通路對膠原蛋白合成的調節過程[35,42-44]?；蛐酒治鲲@示，相較于正常皮膚組織，增生性瘢痕組織中有152個miRNA有明顯表達差異，其中包括82個上調的miRNA和70個下調的miRNA。這些研究結果均表明，miRNA可能成為治療增生性瘢痕的新分子靶標[45]。

1.2 不同成纖維細胞分型對增生性瘢痕的作用

研究發現，皮膚成纖維細胞起源于胚胎的不同位置，特定的位置來源具有同一性。例如，面部的成纖維細胞是由神經嵴產生的，而背側皮膚則不是[46]。人體不同部位皮膚的成纖維細胞在蛋白質合成和對細胞因子的反應上存在差異。近年來，隨著空間轉錄組及單細胞測序等技術的發展，通過結合空間和單細胞轉錄譜，證實了成年人類皮膚中不同成纖維細胞亞群的存在[47]。這些真皮成纖維細胞群體在正常和創傷狀態下的細胞分裂、分化、收縮、蛋白酶和細胞因子/生長因子的分泌，及其對這些因子的反應等各種生物學行為上都表現出根本的差異。

乳頭狀成纖維細胞位于真皮乳頭層中。這些細胞表達更高水平的FAP、CD36、CD39、Netrin1和Podoplanin，且不能直接分化為脂肪細胞[48]。與網狀成纖維細胞相比，乳頭狀成纖維細胞顯示出較低的收縮性。細胞中蛋白聚糖、核心蛋白聚糖和血小板反應蛋白合成較多，膠原蛋白合成較少[49]。乳頭狀成纖維細胞能夠支持表皮干細胞生長，并促進器官3D培養中表皮的形成和存活。在傷口愈合期間，乳頭狀成纖維細胞主要參與免疫反應、傷口重塑和新的毛囊形成。乳頭狀成纖維細胞僅在創傷愈合中再上皮的形成期間被募集。這些細胞產生一個松散的細胞外基質網絡，該網絡支持毛囊和其他皮膚附件的形成，并允許上皮-間質之間的相互作用，該過程對于無瘢痕愈合至關重要。因此有研究認為乳頭狀成纖維細胞具有抗纖維化的特性[47,50]。

網狀成纖維細胞位于真皮網狀層中，具有特定的表達標記物，包括MGP、TGM2、MFAP5、CD26、CD36、CD90等。此外，網狀成纖維細胞膠原VIA5表達陰性[50]。與乳頭狀成纖維細胞相比，這些細胞具有較強的收縮性，并且能夠成脂分化。在培養中，與乳頭狀細胞相比，網狀成纖維細胞產生更多的膠原蛋白、蛋白聚糖、TGF-β1和α-SMA，較少的核纖維調節蛋白、膠原酶和TGF-β3[51]。在網狀成纖維細胞上培養的角質形成細胞具有不規則形狀，并且不能形成完全分層的表皮。網狀成纖維細胞是參與人類皮膚傷口愈合的主要成纖維細胞。研究顯示，在傷口床上，最豐富的間充質干細胞是表達CD26的脂肪細胞前體細胞，其次是皮膚傷口愈合過程中的網狀成纖維細胞CD29+亞群[52]，并共同介導傷口修復的早期階段，包括肉芽形成和傷口收縮。這些成纖維細胞細胞顯示出形成瘢痕的能力，這種能力由涉及皮膚深處的損傷所證實，常常導致增生性瘢痕或瘢痕疙瘩的形成。

1.3 成纖維細胞與炎癥

由于傷口床上活化的成纖維細胞是細胞外基質的主要生產者[53]，因此之前的研究主要就成纖維細胞在組織修復的增殖和重塑階段的作用進行了廣泛的論證。最近的發現表明，成纖維細胞在組織炎癥中也起著重要的作用。損傷后，成纖維細胞會分泌炎癥因子導致早期炎癥并在多種組織(如皮膚、肺、肝、腸、心臟、結膜、泌尿生殖道和脂肪組織等)中引起損傷反應[54-56]。這些促炎性的成纖維細胞通常通過募集和激活髓樣細胞來刺激免疫反應。炎癥消退后，成纖維細胞主要介導細胞外基質沉積。這些研究表明，成纖維細胞具有類似于巨噬細胞和角質形成細胞的促炎作用。雖然直接研究體內真皮成纖維細胞與免疫細胞之間的相互作用尚處于初期階段，但成纖維細胞所具有的炎性本質在其他組織中得到了證明。

來自多個器官的小鼠成纖維細胞的多組學測序表明，這種之前所認為的結構細胞的免疫功能尚未得到充分認識[54]。真皮成纖維細胞的轉錄組及隨后的轉座酶可及性染色質分析(ATAC)證明了真皮成纖維細胞中多個免疫基因位點的轉錄潛能，其中就包括干擾素γ受體。此外，另一項研究針對健康人皮膚的成纖維細胞和炎性疾病(痤瘡、斑禿、環形肉芽腫、麻風病和牛皮癬)的樣品進行了單細胞測序(scRNA-seq)，結果表明成纖維細胞中許多免疫基因在多個簇群中上調，例如CCL2、CCL19、CXCL12、CXCL14、IL6和IL8/CXCL8等[57]。這些研究突出了皮膚成纖維細胞的促炎能力。更有趣的是，來自銀屑病患者的成纖維細胞的蛋白質組學分析證實，其炎癥相關蛋白(如TNFα)的水平更高[58]，來自銀屑病成纖維細胞的上清液誘導了炎性巨噬細胞表型[59]。另外，來自特應性皮炎患者的成纖維細胞在培養的皮膚等同物中誘導炎癥基因表達。同樣，在創傷后的小鼠和人皮膚中，在真皮網狀層的成纖維細胞內觀察到促炎基因的表達譜，這說明特定成纖維細胞群可能存在炎性傾向[60]。這些發現不僅暗示了成纖維細胞作為損傷反應的早期響應者的促炎作用，而且還突顯了細胞多樣性在傷口愈合過程中推動差異性炎癥反應的可能性。

2 其他細胞相關基礎研究進展

盡管傷口愈合的潛在機制十分復雜，但研究發現炎癥是其決定因素之一。炎癥除了傳統的抗傷口感染的作用外，還對病理性瘢痕的發病機理產生了巨大的影響。增生性瘢痕的特征之一在于持續的局部炎癥和過多的膠原蛋白沉積。因此，越來越多的研究聚焦于炎癥細胞與增生性瘢痕相關的研究上。了解炎癥細胞在創傷修復中的作用與機制，將有助于深入了解增生性瘢痕形成的機理，并促進開發有效的治療方法。

2.1 肥大細胞與增生性瘢痕

肥大細胞被認為是一種促進成纖維細胞活化和過度膠原沉積的炎癥細胞類型。肥大細胞參與傷口修復過程。關于動物和人類傷口的研究表明，肥大細胞會因皮膚損傷而發生脫顆粒作用，并且在創傷修復過程中肥大細胞數量會增加，這很可能是由于循環中募集了肥大細胞前體所致。研究表明，肥大細胞在傷口修復過程的每個階段都起作用，包括炎癥、增殖和肉芽組織形成/重塑階段。

近期的研究表明，與正常皮膚相比，增生性瘢痕組織中的組胺含量明顯增加，表明增生性瘢痕組織中存在活躍的肥大細胞[61]。與對照組相比，增生性瘢痕患者中過敏癥狀的發生率也有所增加。與沒有瘙癢性疾病的患者相比，有瘙癢性皮炎的燒傷患者的肥大細胞和瘢痕嚴重程度更高[62]，這表明肥大細胞的活化在瘢痕形成中起著一定的作用。與正常皮膚、肉芽組織或成熟的瘢痕組織相比，增生性瘢痕組織中的肥大細胞數量更多[63-64]。此外，研究表明，各種減少增生性瘢痕真皮厚度的治療方法會導致真皮層肥大細胞數量的減少[61]。動物模型研究發現，與正常皮膚相比，豬的增生性瘢痕組織顯示出更多的肥大細胞染色[65]。同時，肥大細胞穩定劑酮替芬治療可減少豬傷口收縮和膠原蛋白沉積，形成更薄和密度較小的膠原蛋白原纖維[66]。關于小鼠力學負荷誘導的增生性瘢痕模型，以及裸鼠人增生性瘢痕皮膚移植誘導模型的研究均表明，肥大細胞在增生性瘢痕病變組織中明顯增加[65,67-68]。

此外，之前的研究發現，胎兒的皮膚能夠在發育的3個月內實現無瘢痕愈合，大量研究表明，無瘢痕愈合的胎兒傷口幾乎沒有炎癥；隨著胎兒皮膚系統變得更加完善，其無瘢痕愈合的能力逐漸喪失。據報道，與成熟皮膚(成人)相比，妊娠中期胎兒皮膚(18～22周)含有更少的肥大細胞[69]。除了在發育過程中肥大細胞密度增加外，肥大細胞在大小、顆粒密度和顆粒的生化組成方面也變得更加成熟[62,69]?？傊?，肥大細胞數量的改變、肥大細胞成熟度的改變、肥大細胞脫顆粒程度的改變，均是影響增生性瘢痕形成的重要因素。

2.2 巨噬細胞與增生性瘢痕

大量研究表明，巨噬細胞能夠參與整個創傷愈合的過程，并且在增生性瘢痕發展過程中起著重要的作用。目前，關于巨噬細胞與增生性瘢痕的進展研究主要集中在巨噬細胞的極化領域。研究發現，在不同的微環境作用下，巨噬細胞可以極化為兩種主要的表型，即M1型與M2型巨噬細胞。在傷口愈合的過程中，M1巨噬細胞通過殺死病原體和清除細胞碎片來啟動炎癥期，M2型巨噬細胞則主要參與增殖和重塑階段[70]。

在IFN-γ、TNF-α、DAMP和LPS的存在下，單核細胞極化成經典的M1型巨噬細胞。這些具有促炎作用的M1型巨噬細胞能夠分泌細胞因子，例如IL-1β、IL-6和TNF-α[71]，它們不僅參與傷口周圍的免疫反應，而且還能夠刺激成纖維細胞和角質形成細胞的增殖。這些M1型巨噬細胞的主要功能是清除傷口上的細胞碎片[72]。在正常組織修復過程中，早期以M1型巨噬細胞分泌的細胞因子高表達為標志。研究表明，M1型巨噬細胞的數量在傷后0～2 d開始增加，在傷后7～14 d達到峰值，并在傷后14～28 d顯著下降。研究發現，傷口愈合過程中巨噬細胞極化的不平衡會導致增生性瘢痕的形成[73]。增生性瘢痕中，包括IL-6和CCL2在內的M1型巨噬細胞分泌的炎癥蛋白水平，明顯低于正常瘢痕組織。此外，相對于正常組織而言，增生性瘢痕中促炎細胞因子的水平，例如TNF-α、CCL-2和IL-1β都很低[74]。因此，早期M1型巨噬細胞極化的減少及炎癥階段的減弱，可能導致增生性瘢痕的形成。

研究發現，與正常瘢痕相比，增生性瘢痕的進展與M2型巨噬細胞及其產生的抗炎細胞因子的延遲和延長表達有關。通常，M2型巨噬細胞在損傷后第4周顯著增加，并在第8周恢復基線水平[75]。如果M2型巨噬細胞的數量保持較高水平，則會導致增生性瘢痕。Van den Broek等[74]研究發現，形成增生性瘢痕的患者在損傷后第4～6周才能檢測到CD163+的M2型巨噬細胞，而形成正常瘢痕的患者則僅僅需要2周即可檢測到。將人類增生性瘢痕皮膚移植到裸鼠上建立增生性瘢痕移植模型，發現M2型巨噬細胞(F4/80+和Arg-1+)和特定的細胞因子IL-10、IL-1α顯示出延遲的表達[76]。更深入的研究表明，M2型巨噬細胞可進一步細分為M2a、M2b、M2c和M2d型[77]。雖然目前關于增生性瘢痕中巨噬細胞的研究仍主要集中在巨噬細胞的分布和數量上，但是上述這些開拓性的新進展提示我們，對巨噬細胞極化及亞型的進一步探索或可找到新的針對增生性瘢痕的有效治療方法。

3 小結與展望

增生性瘢痕一直是臨床上亟待解決的難點與重點。但由于其發展過程錯綜復雜，參與其中的細胞類型繁多，其發病機制還未完全闡明。本文回顧了近期開展的一些關于增生性瘢痕的新研究，將成纖維細胞相關的基礎研究進行了更深入細致的探討，并且還闡述了肥大細胞、巨噬細胞與增生性瘢痕相關的新進展。這些影響增生性瘢痕形成的細胞之間的相互作用還有待進一步研究。希望能夠隨著基礎研究的深入與進步，減少病理性瘢痕的形成，最終實現臨床上皮膚無瘢痕愈合的最終目標。