喀拉庫勒湖兩株侵染同一宿主黃桿菌低溫噬菌體的分離及生物學特性研究

李明源， 王繼蓮， 張 甜，周 茜， 美合熱阿依·木臺力甫

喀什大學 生命與地理科學學院/葉爾羌綠洲生態與生物資源研究自治區高校重點實驗室，新疆 喀什 844006

低溫噬菌體廣泛分布于極地、冰川、高原湖泊、深海及其他各類低溫生境中，是地球生物圈最豐富多樣的生命形式，同時也是調節各類環境中原核生物群落結構和生態功能最主要的驅動因子之一[1-2]．近年來，超級耐藥細菌的頻繁傳播和化學農藥的濫用，對全世界公共衛生及綠色可持續發展事業造成了日益嚴重的威脅，迫切需要尋找替代或補充抗生素、化學農藥的新技術[3-5]．噬菌體又稱細菌病毒，因其對宿主菌的高度專一性、生物安全性高及在各類環境中廣泛存在和持久的增殖能力，在治療人類和動植物細菌感染方面潛力巨大[6-7]，被認為是21世紀重要的戰略生物資源[8]．

黃桿菌屬(Flavobacterium)細菌是非發酵革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于土壤和水環境中，多為條件致病菌，常引起人和魚類感染，不僅是造成醫院感染的主要病原菌之一，還給水產養殖業造成了重大的經濟損失[9]．當前主要是使用化學藥物對抗由細菌引起的水產病害，這不僅直接導致水產品藥物殘留的安全問題，而且間接造成水體生態系統失衡和耐藥菌株頻現等不良問題．噬菌體的治療或預防方案為水產養殖及生態系統安全提供了新思路[10-14]，如基于噬菌體能夠降解致病菌的噬菌體雞尾酒療法，或噬菌體所編碼裂解蛋白(穿孔素或裂解酶)的開發應用已得到廣泛關注等[6，15]．

高原湖泊作為一類古老的生態系統，低溫菌及其噬菌體是其中主要的生物類群，獨特的基因組成、進化特征及在低溫生境中不可替代的生態功能使其備受關注．挖掘高原湖泊中的低溫菌及噬菌體資源，不僅對了解細菌-噬菌體的協同進化關系有重要意義，而且對發掘新物種和基因資源有重大實踐價值．本文從喀拉庫勒湖分離獲得兩株能侵染同一宿主黃桿菌的低溫噬菌體，對其電鏡形態、生物學特性、基因組酶切圖譜以及理化因素敏感性等進行了分析，以期為后續噬菌體與宿主菌協同進化、噬菌體編碼裂解蛋白開發利用奠定理論基礎．

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018年10月，于東帕米爾高原喀拉庫勒湖(38°25′N，75°02′E；海拔3 618 m)沿湖采集水樣，封裝于50 mL離心管中于低溫下帶回實驗室．采樣點水溫2～4 ℃，pH值為7.8～8.4．

1.2 培養基與主要試劑

宿主菌及噬菌體分離采用PYGV培養基[16]，半固體培養基使用熔點更低的瓊脂糖作凝固劑(終濃度為0.4%)．細菌基因組提取試劑盒、Taq酶、限制性內切酶等均購自寶日醫生物技術(北京)有限公司．

1.3 宿主細菌及噬菌體分離

1.3.1 宿主細菌分離

將不同采樣點湖水樣混勻后10倍序列稀釋，取200 μL不同稀釋度水樣涂布于PYGV平板上，15 ℃培養3～7 d，依據平板上菌落形態特征進行劃線純化，獲得純菌株．

1.3.2 噬菌體分離

采用雙層瓊脂平板法分離噬菌體[16]，依據噬菌斑形態特征挑取單斑純化，待噬菌斑形態一致時刮取上層瓊脂接入PYGV液體培養基中進行增殖培養，培養液經13 000 r/min離心10 min，上清液即噬菌體液．

1.3.3 噬菌體宿主譜分析

將純化的噬菌體液與全部分離菌株分別進行雙層平板實驗，檢驗是否有噬菌斑產生，以確定已分離噬菌體是否存在其他宿主菌．

1.4 宿主菌鑒定與噬菌體電鏡形態

1.4.1 宿主菌16S rDNA基因測序及系統發育分析

采用細菌基因組提取試劑盒提取宿主菌DNA，以通用引物27 F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 541 R(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)[17]擴增16S rRNA基因序列．PCR反應條件參照文獻[16]進行，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，所得16S rRNA基因序列與GenBank數據庫中已知序列進行BLAST比對分析，用ClustalX軟件和MEGA 6.0構建系統發育樹，確定分類地位．

1.4.2 噬菌體形態觀察

取效價約1×108PFU/mL的噬菌體液100 mL，采用超濾離心管(millipore，10 kD)濃縮至1 mL．吸取20 μL滴于銅網上，10 min后用吸水紙吸干多余液體，于銅網上加1滴2%，pH值為4.5的磷鎢酸染色5～10 min，待銅網自然干燥后用透射電子顯微鏡(JEM1200EX)觀察噬菌體的粒子形態．

1.5 宿主菌生長及噬菌體侵染溫度范圍

1.5.1 宿主菌生長溫度范圍測定

將宿主菌接種于PYGV平板上，分別于4，10，15，20，25，30，37和42 ℃培養3 d，定時觀察菌落生長情況．依據菌落生長特征設定培養溫度范圍，在裝液量和接種量都統一的條件下采用液體振蕩培養，以濁度法繪制不同溫度下宿主菌的生長曲線，確定其生長溫度范圍，3次重復．

1.5.2 噬菌體侵染溫度范圍

取100 μL噬菌體液與300 μL對數生長期的宿主菌懸液混合進行雙層平板實驗，分別置于宿主菌各生長溫度下培養3 d，觀察噬菌斑及菌膜生長情況，確定噬菌體侵染宿主菌的溫度范圍，3次重復．

1.6 理化因素對噬菌體的影響

1.6.1 熱穩定性分析

將噬菌體液效價調整為1×105PFU/mL，分別取2 mL于40，50，60和70 ℃水浴處理，自0時起每10 min取樣測定不同溫度下的噬菌體效價．各處理均3次重復，以未處理的噬菌體液作對照，分析不同溫度處理下噬菌體的穩定性．

1.6.2 酸堿耐受性分析

同1.6.1，分別取500 μL噬菌體液加入到4.5 mL不同pH的緩沖液中，室溫處理1 h，12 000 r/min離心5 min，測定上清液中噬菌體效價．各處理均3次重復，以未處理的噬菌體液作對照．

1.6.3 氯仿、蛋白酶K和表面活性劑對噬菌體的影響

氯仿敏感性：同1.6.1，分別取2 mL噬箘體液，加入0.5 mL氯仿(終濃度為20%)，混勻后于室溫下處理10 min，經12 000 r/min離心5 min，取上清液測定噬菌體效價，以未處理的噬菌體液作對照．

蛋白酶K敏感性：同1.6.1，取2 mL噬菌體液至5 mL EP管中，加入蛋白酶K至終濃度為1 mg/mL，在56 ℃水浴處理30 min，經12 000 r/min離心5 min后測定上清液中噬菌體效價，以未處理的噬菌體液作對照．

表面活性劑敏感性：同1.6.1，取2 mL噬菌體液，加入表面活性劑SDS至終濃度為0.1%，于56 ℃處理10 min后離心，測定上清液中噬菌體效價．各取2 mL噬菌體液，加入0.3%的表面活性劑Triton X-100于室溫下處理10 min，離心測定上清液中噬菌體效價．各處理均作3次重復，以未處理的噬菌體液作對照．

1.7 噬菌體主要生物學特征分析

1.7.1 最佳感染復數(Optimal Multiplicity of infection，OMOI)測定

以噬菌體效價(PFU/mL)與宿主菌懸液(CFU/mL)分別為0.001，0.01，0.1，1，10和100的比例混勻，終體積為30 mL，15 ℃，180 r/min振蕩培養4 h，12 000 r/min離心5 min，測定上清液中噬菌體效價．各處理均3次重復，計數噬菌斑形成數量最多的“比例”即為OMOI．

1.7.2 吸附速率測定

將噬菌體KH-sph01和KH-sph02分別以最佳感染復數與對數期宿主菌懸液混勻，于15 ℃下靜置，分別在0，2，4，6，8，10，15，20和30 min時取樣100 μL，12 000 r/min離心5 min，測定上清液中未被吸附的噬菌體粒子數量(PFU/mL)．以取樣時間為橫坐標，測得的噬菌體效價為縱坐標，繪制曲線．

1.7.3 一步生長曲線測定

取對數期宿主菌懸液10 mL，調整吸光度OD600為0.6(活細胞數約1×108CFU/mL)．按最佳感染復數加入噬菌體液混合，15 ℃吸附10 min，以12 000 r/min離心5 min棄上清以去除未被吸附的噬菌體粒子，加入10 mL的PYGV液體重懸沉淀后于15 ℃，180 r/min振蕩培養．自0時起每10 min取樣1次，12 000 r/min離心測定上清液中噬菌體效價．以未加宿主菌的噬菌體液和未加噬菌體的宿主菌懸液作對照，以取樣時間為橫坐標，噬菌體效價的對數值為縱坐標繪制一步生長曲線．

1.8 噬菌體顆粒濃縮、基因組提取與酶切分析

1.8.1 噬菌體顆粒濃縮

將噬菌體KH-sph01和KH-sph02與宿主菌懸液按最佳感染復數混勻接入PYGV培養基，15 ℃，180 r/min振蕩培養2 d．取培養液1 L于12 000 r/min離心10 min，向上清液中加入脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)和核糖核酸酶A(RNase A)至終濃度為1 μg/mL，37 ℃水浴30 min后加入NaCl至終濃度為1 mol/L，冰浴1 h后于4 ℃，12 000 r/min離心10 min．向上清液中加入PEG 8000至終濃度為10%，充分溶解后于4 ℃靜置過夜，經4 ℃，12 000 r/min離心10 min棄上清，用4 mL的SM緩沖液重懸沉淀，加入等體積氯仿渦旋振蕩2 min，8 000 r/min離心10 min收集水相，即得濃縮的噬菌體液．

1.8.2 噬菌體基因組提取

取濃縮的噬菌體液500 μL，加入乙二胺四乙酸(EDTA)至終濃度為20 mmol/mL、蛋白酶K(終濃度為50 μg/mL)和10%SDS(終濃度為50 μL/mL)，56 ℃水浴1 h，以酚-氯仿法抽提噬菌體基因組．12 000 r/min離心5 min收集水相，加入等體積冰冷的異丙醇混勻，12 000 r/min離心10 min，沉淀用1 mL無水乙醇洗滌，12 000 r/min離心10 min，加入50 μL的TE緩沖液溶解沉淀，即得噬菌體DNA．采用微量紫外分光光度計(Nanodrop 2000)檢驗純度和濃度后于-20 ℃保存．

1.8.3 噬菌體基因組酶切

分別用DNaseⅠ和RNase A對噬菌體基因組進行酶切，反應體系為10 μL，即基因組1μL，DNaseⅠ或RNase A酶1 μL，10×buffer 1 μL，ddH2O補至10 μL．37 ℃水浴30 min后采用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以判斷噬菌體基因組的核酸類型．基因組為DNA的，則繼續用EcoRⅠ，BamHⅠ，PstⅠ和XhoⅠ等限制性核酸內切酶酶切分析，以0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測．

2 結 果

2.1 宿主菌分離及其噬菌體初步鑒定

從喀拉庫勒湖水樣中共分離得到低溫細菌43株，以此為宿主，分離得到兩株能侵染同一宿主菌的低溫噬菌體．結合16S rRNA序列比對及系統發育分析(圖1)，發現該宿主菌與Flavobacteriumfrigoris(JQ712371)相似度最高，鑒定其為黃桿菌屬細菌，命名為Flavobacteriumsp.KHhb03，GenBank序列登錄號MT919896．

圖1 宿主菌KHhb03系統發育分析

兩株噬菌體侵染宿主菌后于雙層平板上形成大(直徑約3～5 mm、邊緣不光滑不整齊)、小(直徑約1～2 mm、邊緣整齊光滑)兩種形態的噬菌斑(圖2)．透射電鏡觀察發現兩株噬菌體粒子形態明顯不同，噬菌斑較大的一株頭部呈正多面體對稱，直徑約55～60 nm，尾管細長，約230～250 nm，從形態上初步鑒定為長尾噬菌體科(Siphoviridae)，命名為KH-sph01．噬菌斑略小的一株噬菌體同為頭尾復合結構，正多面體頭部直徑略大，約70～75 nm，尾管粗壯呈針管狀，長約120～150 nm，尾管直徑約20～25 nm，將其鑒定為肌尾噬菌體科(Myoviridae)，命名為KH-sph02．經宿主譜分析，兩株噬菌體僅對宿主菌Flavobacteriumsp.KHhb03敏感，表現為烈性噬菌體．

圖2 噬菌體KH-sph01和KH-sph02顆粒形態及噬菌斑特征

2.2 宿主菌生長及噬菌體侵染溫度范圍

宿主菌Flavobacteriumsp.KHhb03經平板培養，發現可在4～37 ℃生長，40 ℃時菌落生長不明顯．不同溫度下的生長曲線顯示(圖3)，該菌株在37 ℃時生長不明顯，培養8 h后培養液OD600幾乎不再變化；4 ℃和30 ℃時，該菌株生長較緩慢，代時明顯延長．宿主菌Flavobacteriumsp.KHhb03最適生長溫度為15～20 ℃，屬于耐冷菌．

圖3 不同溫度培養下宿主菌Flavobacterium sp.KHhb03的生長曲線

由表1可見，長尾噬菌體KH-sph01在4～25 ℃培養時能于雙層平板上產生清晰的噬菌斑，而肌尾噬菌體KH-sph02侵染溫度范圍為4～30 ℃，但在30 ℃時的噬菌斑數量低于4～25 ℃．

表1 宿主菌KHhb03生長與噬菌體KH-sph01和KH-sph02侵染溫度范圍

2.3 理化因素對噬菌體的影響

2.3.1 熱穩定性分析

兩株噬菌體均表現出一定的熱不穩定性(圖4)．40 ℃處理60 min，KH-sph01和KH-sph02效價仍分別有原效價的82%和79%．50 ℃處理60 min，兩株噬菌體均有超過50%的粒子失活．但隨溫度繼續升高，兩株噬菌體耐熱性顯著降低．70 ℃處理10 min，兩株噬菌體效價僅為原效價的45%和63%；70 ℃處理60 min，兩株噬菌體均基本失活．由此表明，兩株噬菌體均對熱敏感，但具備一定的耐熱性．

圖4 噬菌體KH-sph01和KH-sph02的熱穩定性

2.3.2 酸堿耐受性分析

KH-sph01和KH-sph02在pH值為7～8范圍內均較穩定(圖5)，再侵染能力不受影響．相比而言，KH-sph01比KH-sph02更耐酸，且對pH的耐受范圍更寬，其在pH值為6時侵染能力不受影響，在pH值為5時也有34%的噬菌體存活．而KH-sph02在pH值為7～9范圍內最穩定，在pH值為6和pH值為10時也分別能保持47%和49%的存活率，KH-sph02更能耐受堿性環境．

圖5 噬菌體KH-sph01和KH-sph02酸堿耐受性

2.3.3 氯仿、蛋白酶K和表面活性劑對噬菌體的影響

經氯仿處理后(圖6)，KH-sph01和KH-sph02的效價相比對照組仍有80.6%和85.3%，表明兩株噬菌體均對氯仿不敏感，說明兩株噬菌體衣殼組分中均無脂質包膜成分．

圖6 氯仿、蛋白酶K和表面活性劑對噬菌體KH-sph01和KH-sph02的影響

經蛋白酶K處理后，KH-sph01和KH-sph02效價僅為對照組的10%和17%，說明兩株噬菌體均對蛋白酶K敏感．

KH-sph01和KH-sph02對表面活性劑(SDS和Triton X-100)均表現不敏感，且敏感程度差異無統計學意義，經處理后均能保持85%的侵染活性．

2.4 兩株噬菌體的主要生物學特征

2.4.1 最佳感染復數

由圖7可見，KH-sph01與宿主細胞比例為10時，培養液中所獲子代噬菌體數量最多，而KH-sph02與宿主細胞比例為0.1時，測得培養液中噬菌體效價最高，說明KH-sph01與KH-sph02感染宿主菌Flavobacteriumsp.KHhb03的最佳感染復數分別為10和0.1．

圖7 噬菌體KH-sph01和KH-sph02最佳感染復數

2.4.2 吸附速率

吸附是噬菌體感染宿主細胞的第一步，也是其能否成功感染并實現增殖的必要前提．由圖8可見，兩株噬菌體幾乎都能在10 min內完成對宿主菌的吸附．吸附2 min時，KH-sph01就有超過50%的噬菌體粒子完成吸附，而KH-sph02的吸附速率更強，2 min后有超過55%的噬菌體粒子完成吸附，4 min時有90%的噬菌體粒子吸附到了宿主細胞上，說明兩株噬菌體吸附速率均較強．

圖8 噬菌體KH-sph01和KH-sph02的吸附速率

2.4.3 一步生長曲線

一步生長曲線能反映噬菌體感染宿主細胞到增殖裂解的時間，并由此計算噬菌體的裂解量(B)．KH-sph01感染宿主菌的潛伏期約50 min，裂解期約30 min；KH-sph02感染宿主菌的潛伏期和裂解期分別約30 min和40 min(圖9)．依據公式

圖9 噬菌體KH-sph01和KH-sph02的一步生長曲線

B=P/C

式中，P表示裂解末期噬菌體效價(PFU/mL)，C表示感染初期宿主菌濃度(CFU/min)，可得出KH-sph01和KH-sph02的裂解量分別為3.16個和10.22個．

2.5 噬菌體基因組提取與酶切分析

將KH-sph01和KH-sph02的基因組分別用DNaseⅠ和RNase A酶切(圖10a)，兩株噬菌體均能被DNaseⅠ降解，而RNase A酶解無影響，說明兩株噬菌體核酸類型均為dsDNA．兩株噬菌體均能被4種限制性內切酶切割成大小不同的片段(圖10b和10c)，進一步說明KH-sph01和KH-sph02基因組均為dsDNA．綜合分析不同酶切圖譜，初步估算出KH-sph01的基因組DNA大小為60～65 kb，KH-sph02的基因組DNA大小為40～45 kb．

M1為DNA相對分子質量標準1(10 000 bp)；M2為DNA相對分子質量標準2(15 000 bp)．

3 討 論

噬菌體特別是低溫噬菌體在防治水產病原菌、動植物病害、維持環境生態平衡等方面的應用層出不窮[18-21]，而從環境中分離篩選高效裂解性噬菌體是其開發應用的前提條件．本研究從喀拉庫勒湖分離到的兩株低溫噬菌體KH-sph01和KH-sph02，雖然能侵染同一宿主菌Flavobacteriumsp.KHhb03，但形態各異，在雙層平板上形成大、小兩種不同形態的噬菌斑，分屬于長尾噬菌體科和肌尾噬菌體科．而李建凱[22]分離的侵染同一宿主熒光假單胞菌PseudomonasfluorescensW-6的兩株低溫噬菌體VW-6S和VW-6B均屬于典型的長尾噬菌體科，其頭部直徑和尾部長度分別為66.7/233.3 nm和61.1/166.7 nm，這與本文的發現明顯不同．噬菌體對宿主菌存在高度專一性，一般認為僅有少數形態較為相似的噬菌體才能侵染相同宿主，而本研究KH-sph01和KH-sph02在形態學上卻分屬于兩個不同的噬菌體科，說明自然界中能侵染相同宿主的噬菌體普遍存在，且可能與形態特征無直接關系．

黃桿菌屬細菌作為條件致病菌，常引起水產養殖業中細菌性魚類疾病(如嗜冷黃桿菌Flavobacteriumpsychrophilum，柱狀黃桿菌Flavobacteriumcolumnare等)，對魚類特別是冷水魚類的人工養殖影響巨大．噬菌體療法是近年來由于抗生素濫用及化學農藥、重金屬等污染頻現而產生的一種新型生物防治技術．它是通過定向篩選、純化特定致病細菌的專屬烈性噬菌體，經人工富集培養或改造后添加到致病細菌污染的生態環境介質中，從而定向滅活致病細菌的治療方式[23-24]．分離和篩選特定目標致病細菌的專屬噬菌體是噬菌體療法在不同環境中開展生物防治應用的必要前提．Stenholm等[25]從丹麥一個虹鱒魚養殖場水樣中分離得到22株黃桿菌噬菌體，它們在形態學上和基因組大小上均不盡相同，其中5株(FpV-5，FpV-6，FpV-8，FpV-9和FpV-11)具有較廣的宿主譜，可感染多株本地分離的嗜冷黃桿菌，具有良好的開發應用價值．本研究的宿主菌KHhb03與Flavobacteriumfrigoris(JQ712371)相似度最高，且在前期的研究中發現黃桿菌屬是該區域環境中的優勢菌群[26]，這對作為噬菌體療法在區域環境中靶向滅活致病黃桿菌屬細菌提供了良好的材料．

系統分析新發現噬菌體的生物學特性是認識該噬菌體的基本前提，更是噬菌體資源開發應用的必要基礎．感染復數是研究噬菌體感染宿主細菌與子代個體產出之間的量效關系的重要生物學指標．KH-sph01和KH-sph02侵染宿主菌的最佳感染復數分別為10和0.1，這與噬菌體VW-6S和VW-6B侵染宿主熒光假單胞菌W-6(0.1和0.01)明顯不同，說明即便是不同噬菌體侵染相同宿主菌，其最佳感染復數也可能不盡相同．一步生長曲線可間接反映噬菌體與宿主菌的相互作用及開發應用潛力，KH-sph01和KH-sph02侵染宿主菌KHhb03的潛伏期和裂解期各不相同，裂解量分別為3.16個和10.22個，間接反映了兩株噬菌體與宿主菌相互作用的復雜性．而在實際操作中也發現，KH-sph01在純培養條件下難以獲得較高的效價，推測在純培養條件下，隨著噬菌體效價增加，宿主菌KHhb03極易對KH-sph01產生高水平抗性以避免其重新感染，這可能是因為純培養條件下，噬菌體KH-sph01由烈性轉變成了溫和性，需要進一步驗證．

與眾多已報道的低溫噬菌體一樣，KH-sph01和KH-sph02可以在4 ℃時侵染宿主并產生噬菌斑，但分別在超過25 ℃和30 ℃時失去侵染活性，這也印證了兩株噬菌體的低溫特性．兩株噬菌體均對熱敏感，隨著溫度升高，噬菌體迅速失活．而Wells等[27]在分析低溫噬菌體9A時發現，當溫度超過35 ℃時即可使其瞬時滅活，表明低溫噬菌體對溫度敏感，可因高溫而失去活性．究其原因可能與噬菌體結構蛋白有關，同樣也與其生存環境關系巨大，這與以前關于低溫噬菌體的報道相符[22，27-29]．推測低溫噬菌體普遍存在熱不穩定性，但在進化過程中因環境不同而產生了不同的適應策略．