甜蕎FePG1基因克隆及表達分析

方小梅， 羅近瑜， 黃科慧， 劉 洋，徐 鑫， 張 建， 易澤林

1. 西南大學 農學與生物科技學院，重慶 400715；2. 古浪縣防沙治沙技術推廣中心，甘肅 武威 733100

多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)是一種參與多種植物發育過程的果膠消化酶．果膠是一種雜多糖，它是雙子葉植物體細胞初生細胞壁的主要成分，同時也是花粉內壁和花粉管壁的主要成分，因此，參與果膠代謝相關酶和蛋白對植物的生長和生殖發育至關重要[1]．PG基因屬于植物中的大基因家族，在擬南芥[2]、楊樹[3]、蘋果[4]、葡萄[5]和玉米[6]等物種中均進行了PG家族基因的鑒定和表達模式研究．PG基因參與植物發育的不同階段，如種子萌發，器官脫落，莢和花藥開裂，花粉粒成熟，花粉管生長，和木質部細胞形成[7]．在水稻中的超表達PG基因降低了果膠組分和細胞粘著力，同時，還增加了對非生物逆境的敏感性[8]；而在蘋果中PG基因的超表達導致葉片形態發育不正常，果實脫落等表型[9]．PG基因的表達水平在不同器官和組織中顯著不同[10]，超過50%的擬南芥PG基因在花卉組織中高度表達[11]．擬南芥中的PGX1參與細胞的伸長、膨脹和花的生長和發育；PGX2能夠促進擬南芥子葉下胚軸的伸長、葉的擴張、莖的木質化等；QRT2、ADPG1和ADPG2對擬南芥生殖發育過程中花粉粒等不同的細胞分裂具有很重要的作用[12-14]．

目前，栽培甜蕎均為自交不親和的兩型花作物，包括長柱花和短柱花，長柱花(L-morph Flower)也稱“Pin”型花，具有長花柱和短雄蕊；短柱花(S-morph Flower)也稱“Thrum”型花，具有短花柱和長雄蕊．這種花粉的互位方式減少了花粉的浪費，促進了異花授粉，提供了花粉的適應性[15]，同時，也極易受到環境影響，開花期出現陰雨天則會導致結實率降低而影響產量．國內外多個研究團隊已利用自交可育野生蕎麥Fagopyrumhomotropicum[16]，通過種間雜交的方式(Fagopyrumesculentum和F.homotropicum)培育出自交可育的等柱花甜蕎，即花柱與雄蕊等長，且自交可育．依據實驗室前期對甜蕎長、短和等柱花雌雄蕊轉錄組數據，獲得一個PG基因編碼序列，命名為FePG1，本研究擬對FePG1基因進行基因克隆，系統進化分析，亞細胞定位及表達模式分析，以期為今后驗證甜蕎PG基因家族成員調控甜蕎花柱異長及作用機理提供理論參考．

1 材料與方法

1.1 供試材料

以花柱異長的自交不親和甜蕎品種烏克蘭大粒蕎和酉蕎2號，花柱等長的自交親和甜蕎品種甜自21和貴甜2號為試驗材料．種植于西南大學科研基地，于盛花期采集開花當日長勢一致的花朵收集其雌雄蕊，置于-80 ℃冰箱中保存備用．此外，于盛花期取烏克蘭大粒蕎短柱花的根、莖、葉、花和幼嫩籽粒，置于-80 ℃冰箱中保存備用．

利用Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(博日，杭州)提取RNA，再經瓊脂糖電泳檢測RNA降解和污染情況．用RNA Nano 6000 Assay Kit of the Agilent 生物分析儀 2100 system (Agilent Technologies，CA，USA)檢測RNA完整性，用NanoPhotometer?分光光度計(IMPLEN，CA，USA)檢測RNA的純度，用Qubit?RNA Assay Kit in Qubit?2.0熒光計(Life Technologies，CA，USA)檢測RNA的濃度．利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(TaKaRa，北京)試劑盒進行cDNA的合成，于-80 ℃冰箱中保存備用．

1.2 甜蕎FePG1基因克隆

實驗室前期已利用烏克蘭大粒蕎長柱花、短柱花和甜自21等柱花雌雄蕊總RNA進行了轉錄組測序，分析測序結果發現FePG1基因在烏克蘭大粒蕎短柱花中高表達、在等柱花中不表達．本研究以烏克蘭大粒蕎短柱花雌雄蕊cDNA為模板，引物序列FePG1-F(5’-ATGGCCACGTTTTGGATTTGTATG-3’)和FePG1-R(5’-TAGCAGTGAACAGGAGGAAGC-3’)，利用PrimeSTAR Max Premix(2X)聚合酶(TaKaRa，北京)進行PCR擴增．擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用SanPrep柱式DNA凝膠回收試劑盒(Sangon Biotech，上海)對擴增的目的片段進行回收．將目的基因導入到pMD19-T(TaKaRa，北京)中，經藍白斑篩選，挑取白色單菌落到100 μg/mL的LB(Luria-Bertani)液體培養基中培養后，送至北京華大基因進行測序．

1.3 甜蕎FePG1基因生物信息學分析

將測序正確的甜蕎FePG1基因序列翻譯成氨基酸，通過ExPASy-prosite (http//www.expasy.org)分析甜蕎FePG1基因的CDS序列保守結構域．編碼蛋白理化性質分析和蛋白親水性預測利用在線工具ProtParam(https：//web.expasy.org/protparam/)進行分析和預測；編碼蛋白的跨膜結構分析通過TMpred工具(https：//embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)進行分析；編碼蛋白信號肽預測利用在線工具SignalP(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行預測．FePG1基因的蛋白序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information)數據庫中執行BlastP搜索(https：//blast.ncbi．nlm．nih．gov /Blast．cgi)．選取來源于30個不同被子植物的PG同源蛋白，采用 MEGA 7.0軟件的鄰接法(NJ)構建蛋白序列的系統發育樹．

1.4 甜蕎FePG1基因的表達分析

分別以兩個自交不親和甜蕎品種烏克蘭大粒蕎和酉蕎2號長柱花、短柱花雌雄蕊cDNA及兩個自交親和甜蕎品種甜自21和貴甜2號等柱花雌雄蕊cDNA為模板，用Primer Primer 5.0軟件設計基因特異性引物FePG1-F(5’-CCGGAATTCATGGCCACGTTTTGGATTTG-3’)和FePG1-R(5’-TGCTCTAGATTAGCAGTGAACAGGAGGAAGC-3’)．使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa，北京)檢測甜蕎FePG1基因在不同花柱類型中的表達差異．以烏克蘭大粒蕎短柱花的根、莖、葉、花和幼嫩籽粒cDNA為模板(PCR反應體系和循環參數同上)，檢測甜蕎FePG1基因的組織表達情況．

1.5 甜蕎FePG1基因的亞細胞定位

將本實驗室保存的煙草種子播種至裝滿基質土的花盆(15 cm×15 cm×12 cm)中，花盆置于光照培養箱中培養，培養條件為光周期16/8(光照/黑暗) h、溫度25 ℃、濕度60%，待培養4周后備用．根據目的基因FePG1的序列設計帶有StuI酶切位點的引物FePG1-F(5’-AAAAGGCCTATGGCCACGTTTTGGATTTG-3’)和FePG1-R(5’-TTTTCCGGATTAGCAGTGAACAGGAGGAAGC-3’)，擴增FePG1基因的ORF(開放閱讀框)區域，擴增產物經切膠回收．用限制性內切酶StuI對pH=7 LIC5.0-TET2rc-N-eGFP進行單酶切．酶切產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，回收純化目的條帶，用T4連接酶將擴增產物和酶切產物經12 h連接，而后轉化大腸桿菌DH5α，12 h培養，挑取陽性克隆進行菌液PCR驗證，驗證成功的單克隆子擴大培養，提取重組質粒并進行酶切驗證．依據pH=7 LIC5.0-TET2rc-N-eGFP的StuI酶切骨架設計引物F(5’- ACGTCTATATCATGGCCGACA-3’)和R(5’-GTGACTCCCTTAATTCTCATGTATGATA-3’)，將得到重組質粒pH=7 LIC5.0-N-eGFP-FePG1測序驗證．將重組質粒pH=7 LIC5.0-N-eGFP-FePG1和對照質粒pH=7 LIC5.0-TET2rc-N-eGFP分別轉化農桿菌感受態GV3101．將菌液進行PCR檢測后再注射到煙草葉片背面，經過常溫黑暗處理12 h后觀察葉片信號．切取侵染3 d后的煙草葉片進行制片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光在煙草下表皮細胞內的分布情況．

2 結果與分析

2.1 FePG1基因克隆

利用前期的轉錄組數據，以花柱異長的自交不親和甜蕎品種烏克蘭大粒蕎短柱花雌雄蕊cDNA為模板，通過PCR擴增得到FePG1基因(圖1a)．分析FePG1基因的CDS片段，全長1 215 bp，編碼404個氨基酸(圖1b)．相對分子質量為4.3×104，化學分子式為C1895H3018N508O596S18，等電點為5.19.其中包括30個親水性氨基酸(Arg+Lys)、42個酸性氨基酸(Asp+Glu)、39個堿性氨基酸(Arg+Lys+His)和132個疏水性氨基酸(Ala，Lle，Leu，Met，Val)．使用NCBI中Conserved Domains對FePG1蛋白序列進行功能結構域分析，結果表明該蛋白含有一個典型PL-6(多糖裂解酶，大多與果膠的形成及功能關系密切)超家族結構域(圖1c)，占該基因序列的90%以上．

圖1 甜蕎FePG1基因克隆(a)、cDNA序列和氨基酸序列(b)和PL-6超家族結構域(c)

2.2 甜蕎FePG1蛋白序列及分子系統發育分析

利用ProtParam預測得到FePG1蛋白親水性平均系數為+0.058，脂肪族氨基酸指數為95.30，再利用ProtScal進一步分析疏水性氨基酸多于親水性氨基酸，疏水性最大值為3.189(第10位和第12位的氨基酸)，最小值為-2.467(第259位的氨基酸)(圖2a)，推測FePG1基因編碼的蛋白為疏水性蛋白．

通過信號肽預測在線工具SignalP分析得出，FePG1蛋白為信號肽的可能性為0.999，其他類型僅0.001(圖2b)．因此，該蛋白存在信號肽，屬于分泌性蛋白．

系統發育分析表明(圖2c)，甜蕎FePG1蛋白與石竹目藜科作物甜菜、菠菜同源蛋白的親緣關系較近，其次為大戟科的橡膠樹、木薯，以及楊柳科的楊樹、柳樹等；與擬南芥親緣關系較遠．

圖2 FePG1蛋白序列、空間結構分析及系統發育進化樹

2.3 FePG1基因的表達驗證及表達模式分析

在課題組前期轉錄組數據基礎上，為了驗證FePG1基因在甜蕎中的表達情況，本研究分別提取了盛花期烏克蘭大粒蕎長柱和短柱花雌雄蕊、甜自21等柱花雌雄蕊、酉蕎2號長柱和短柱花雌雄蕊、貴甜2號等柱花雌雄蕊進行驗證．通過qRT-PCR技術分析，結果表明FePG1基因在自交親和甜蕎品種貴甜2號和甜自21的雌雄蕊中幾乎不表達，在自交不親和甜蕎烏克蘭大粒蕎和酉蕎2號中高表達，且在短柱花雌雄蕊表達量均顯著高于長柱花雌雄蕊(圖3a)．

為了進一步分析FePG1基因的組織表達特異性，提取盛花期烏克蘭大粒蕎的根、莖、葉、花和幼嫩籽粒通過qRT-PCR進行表達驗證，結果表明FePG1基因只在花中高表達，在根、莖、葉和幼嫩籽粒中基本不表達(圖3b)，在甜蕎花中特異性表達．

GT和TZ分別表示自交親和等柱花甜蕎品種貴甜2號(GT)和甜自21(TZ)，WC和WD分別表示自交不親和甜蕎烏克蘭大粒蕎長柱花和短柱花，YQC和YQD分別表示自交不親和甜蕎酉蕎2號長柱花和短柱花．圖a和圖b中不同小寫字母表示差異具有統計學意義(p<0.05)．

2.4 FePG1基因的亞細胞定位分析

FePG1基因注釋為轉錄因子，為了在亞細胞水平上研究FePG1基因的表達情況，利用注射法侵染煙草下表皮觀察FePG1-eGFP融合蛋白和eGFP空載蛋白．以eGFP空載蛋白為對照，由于其在細胞中的定位沒有特異性，所以在細胞膜和細胞核中觀察到熒光信號(圖4a)．在煙草葉片細胞中檢測到FePG1-eGFP分布較多，主要集中于細胞膜和細胞質中(圖4b)．

從左至右，分別為GFP熒光、明場、GFP熒光信號和明場疊加圖．

3 結論與討論

甜蕎屬于蓼科蕎麥屬作物．前人對蕎麥屬作物甜蕎、苦蕎和金蕎麥籽粒轉錄組測序結果表明，與蕎麥屬同源基因最多的物種是甜蕎(23%)、葡萄(11.3%)[17]．對甜蕎花序[18]、籽粒[19]轉錄組測序結果表明甜蕎與葡萄、碧桃、蓖麻、毛果楊親緣關系較近．本研究從甜蕎雌雄蕊中克隆到的FePG1 蛋白，經系統發育分析，與石竹目藜科作物甜菜、菠菜，以及大戟科和楊柳科同源蛋白的親緣關系較近，與前人研究結果一致．

多聚半乳糖醛酸酶在細胞分離的生命周期過程中起著重要作用，對擬南芥細胞壁修飾、脫落和開裂均有重要影響[12]．50%以上擬南芥的PG基因在花組織中高表達[11]．本文研究基于前期轉錄組測序克隆了一個FePG1基因，利用兩個自交親和甜蕎和兩個自交不親和甜蕎為材料，qRT-PCR實驗表明FePG1基因在自交親和甜蕎雌雄蕊中不表達，在自交不親和甜蕎中表達，且其表達量在短柱花雌雄蕊中顯著高于長柱花，表明FePG1基因可能與甜蕎自交不親和有關，且與花柱異長發育有關．

多聚半乳糖醛酸酶是GH28家族的果膠降解糖苷水解酶的重要成員之一，GH28亞細胞定位顯示存在針對分泌途徑的信號序列[7]．本研究通過亞細胞定位證明FePG1蛋白為存在于細胞膜和細胞質的跨膜蛋白，與本實驗FePG1蛋白的跨膜結構預測結果相吻合．據此，我們推斷FePG1基因編碼是一種存在于細胞膜和細胞質中的跨膜蛋白，但是否與分泌途徑有關系需進一步探究．