聚苯乙烯微塑料長期暴露對海水青鳉(Oryzias melastigma)親代生長、繁殖及子代發育的影響

靳非，田淼，穆景利，王瑩，叢藝，王菊英,*

1. 國家海洋環境監測中心，大連 116023 2. 大連海洋大學，大連 116023 3. 閩江學院，福州 350108

微塑料污染是近年來受到國際社會廣泛關注的海洋環境問題之一。過去幾十年，全球塑料產量急劇增長，2018年已達3.59億t[1]。據估計，到2050年時，塑料產量將達到330億t[2]。高密度聚乙烯(high density polyethylene, HDPE)、低密度聚乙烯(low density polyethylene, LDPE)、聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)、聚苯乙烯(polystyrene, PS)、聚丙烯(polypropylene, PP)和聚對苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene glycol terephthalate, PET)是最常見的塑料，它們加起來約占全球塑料總產量的90%[3]。塑料生產和使用的持續增長導致了越來越多的塑料垃圾被釋放到環境中。塑料很難降解，但經過長時間機械、化學和生物作用，它們破碎成各種大小和形狀的碎片[4]。據估計，每年大約產生245 t微塑料顆粒，這些微塑料顆粒最終進入全球水域[5]。在海洋環境中，微塑料廣泛分布在近海、大洋和極地的表層水、不同深度的水柱、海底沉積物，甚至極地冰核中[6]。多項研究表明，微塑料能被各種水生生物攝入[2,7]，分布于不同組織中[8-9]，產生多種毒性效應[10-16]，并能通過食物鏈進行傳遞[17-18]。因此，由微塑料引起的生態效應和人類健康風險不容小覷。

微塑料在生物體內的富集與分布規律主要取決于粒徑，當粒徑小到一定程度時微塑料可從消化系統進入循環系統。如20 μm的微塑料顆?？筛患谫O貝(Mytilusedulis)的鰓表面和消化道內[9]，而10 μm的微塑料則足以進入貽貝的循環系統[19]；5 μm和20 μm的微塑料可在斑馬魚鰓和腸道中富集，5 μm可進入斑馬魚(Daniorerio)肝臟，而20 μm則不能進入[20]；10 μm的微塑料可在海水青鳉(Oryziasmelastigma)的腮、腸道中富集并進入肝臟[21]。目前，針對微塑料的毒性研究，多為微塑料對濾食性動物所造成的物理性損傷，集中于短期效應。但從科學評估其生態影響的角度看，低含量、長時間的慢性結果才是評估其危害性的關鍵內容，而現有關于微塑料是否影響個體的生長、發育和繁殖等還存在很大爭議[22]，急需相關數據的跟進與證實。我們前期研究發現，海水青鳉仔魚(4 dph)可攝入微塑料顆粒(10 μm)，在24 h時體內含量達到高值，隨后呈緩慢下降趨勢，且在96 h時死亡率上升[23]。但這一過程是否會產生長期影響，是否具有生殖毒性和對子代產生影響有待進一步證實。

海水青鳉是一種與淡水模式生物日本青鳉(Oryziaslatipes)親緣關系較近的海水種，因其具有個體小、世代周期短、雌雄易分辨、能夠終年繁殖、胚胎及仔魚透明易觀察、易于實驗室大規模培養、溫度和鹽度適應范圍廣、對污染物反應敏感等特點，近年來被廣泛應用于生態毒理學和環境研究[24-32]。過去十幾年，通過對海水青鳉轉錄組和基因組進行大量研究，使其成為亞洲地區生態毒理學和環境研究的一種理想的海洋模式生物[33]。本研究以海水青鳉為受試生物，選取10 μm PS顆粒為研究對象，通過分析長期暴露后的海水青鳉體長和體質量變化、產卵量和受精率、胚胎發育狀況等，評估2種濃度下PS對海水青鳉親代生長、繁殖和子代發育的影響。相關研究結果可為評估微塑料對海洋魚類的毒性效應和生態風險提供重要參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

實驗用鹽為天然人工海鹽(珊瑚礁級)，購自中鹽工程技術研究院有限公司。魚類養殖和實驗用水的鹽度均為28±1。魚類養殖和實驗期間投喂的豐年蟲購自天津海友佳音生物科技股份有限公司，投喂的補充飼料為日清丸紅C1飼料，購自日本日清丸紅飼料株式會社。PS微塑料顆粒(4210A，直徑10 μm±0.08 μm)購自美國Thermo Fisher Scientific公司，PS顆粒不含添加劑，懸浮于含微量表面活性劑(<0.5%，V∶V)的水中。實驗儲備液濃度為4×108particles·L-1。

1.2 實驗生物

海水青鳉培養于流水循環式養殖系統(美國Aquatic HabitatsTM公司，Stand-Alone System AH2030)，培養條件為溫度28℃±1℃、鹽度28±1、pH 8.0±0.1、光暗比14 h∶10 h(光照∶黑暗)。幼魚、成魚每日用鹵蟲無節幼體投喂3次，仔魚、稚魚每日用日清丸紅C1飼料投喂2次。成魚階段每日收集魚卵，用清潔人工海水沖洗干凈后，放入3 L魚缸，于養殖系統內流水孵化。隨機挑選60 dph(days post hatching)的健壯幼魚(體長2.11 cm±0.13 cm、體質量0.07 g±0.02 g)進行暴露實驗。

1.3 慢性毒性實驗暴露設計

參考課題組前期研究結果[23]，PS顆粒的加標濃度分別設置為1×104particles·L-1和1×105particles·L-1，根據PS顆粒密度，1×104particles·L-1和1×105particles·L-1對應的質量濃度分別為5.5 μg·L-1和55 μg·L-1。同時設置對照組，對照組和每個處理組分別設置3個平行。暴露容器為1 L玻璃燒杯，每個燒杯含500 mL經0.45 μm濾膜過濾的人工海水，放入10尾隨機挑選的健壯幼魚(雌雄比6∶4)，加入對應體積提前用超聲處理并分散均勻的PS顆粒儲備液。燒杯置于搖床80 r·min-1震蕩，以使PS顆粒盡可能均勻分散。暴露周期為50 d，每24 h更換實驗溶液1次，室溫25 ℃，光暗比14 h∶10 h(光照∶黑暗)。每日早、晚用滴管各投喂2滴鹵蟲無節幼體。

1.4 體長和體質量

暴露開始前和暴露結束后，分別用直尺測量親魚吻端至尾鰭基部的長度，用天平(Sartorius BSA3202S，瑞士)稱量親魚體質量。計算親代體長和體質量增量，以評價親代生長情況。

1.5 產卵量和受精率

對照組和處理組的幼魚達到性成熟并開始產卵后，記錄產卵時間及每日產卵量。將當日所產魚卵于熒光倒置顯微鏡(Leica DMI4000B，德國)下觀察受精情況。受精卵外觀透明，由絨毛膜包裹，卵與絨毛膜間形成均勻間隙。受精卵于清潔人工海水中孵化。連續收集7 d魚卵，統計7 d累計產卵量，計算受精率。

1.6 子代胚胎心率

胚胎孵化至第11天，熒光倒置顯微鏡下觀察，詳細記錄全部存活胚胎30 s內的心跳次數，心跳次數乘以2即為胚胎心率。

1.7 子代胚胎畸形評價和畸形率

胚胎畸形評價與胚胎心率測定同步進行。熒光倒置顯微鏡下將胚胎調整至統一體位，觀察胚胎身體右側，對胚胎心臟、圍心囊和卵黃囊發育情況進行分析，評價胚胎畸形情況。所有胚胎觀察完畢后統計胚胎畸形數量，計算畸形率。

1.8 子代胚胎孵化時間和孵化率

當有仔魚孵化出膜后，記錄從受精卵至仔魚出膜所經歷的孵化時間。胚胎孵化21 d后，孵化結束，統計孵化出膜的仔魚數量，計算胚胎孵化率。

1.9 數據處理

實驗數據用IBM SPSS Statistics 19.0軟件進行處理。PS處理組與對照組間的顯著性差異檢驗采用單因素方差分析(ANVOA)，組間比較用LSD檢驗(P<0.05)。

2 結果(Results)

2.1 對海水青鳉親代生長的影響

暴露50 d后，海水青鳉體長和體質量增量如表1所示，不同濃度PS處理組在暴露持續期間體長和體質量增量與對照組相比無顯著差異。

2.2 對海水青鳉親代繁殖的影響

暴露11 d后，對照組和各濃度PS處理組海水青鳉開始同步產卵。海水青鳉性成熟后7 d累計產卵量和受精率如表2所示，PS處理組與對照組相比產卵量有較大程度的增加，并且暴露濃度越高產卵量越大，但三者之間無顯著差異，對照組和各濃度PS處理組親魚所產魚卵的受精率均為100%。

2.3 對海水青鳉子代胚胎發育的影響

子代胚胎發育至第11天的心率和胚胎平均孵化時間如圖1所示，各濃度PS處理組胚胎的心率和平均孵化時間與對照組相比無顯著差異。與對照組相比，PS暴露顯著降低了胚胎孵化率，且暴露濃度越高胚胎孵化率越低(圖2)。隨暴露濃度的增加，胚胎畸形率略有升高(表3)，但與對照組相比無顯著差異，畸形特征包括心臟拉長和圍心囊水腫，典型畸形特征如圖3所示。

3 討論(Discussion)

微塑料已成為國際社會廣泛關注的環境熱點問題之一。近年來關于微塑料研究的報道逐年增多，但主要集中于微塑料在不同地區的各種環境介質中的分布、豐度和特征以及不同種類的水生生物對微塑料的攝入和積累等方面，而關于微塑料對海洋生物尤其是魚類毒性效應的研究還相對較少。相關數據的缺乏導致很難有效評估海洋微塑料污染對海洋魚類個體、種群甚至整個生態系統產生的環境風險。本研究發現，經50 d暴露后，PS處理組體長和體質量的增量與對照組相比均無顯著差異，表明PS并未對海水青鳉的生長產生影響，這與先前的部分研究結論相似。Sun等[34]研究發現，15～80 μm粒徑的HDPE對黃海馬(Hippocampuskuda)暴露45 d后，黃海馬的體長、體質量、肥滿度和比生長速率與對照相比均無顯著差異；Jakubowska等[35]將海鱒(Salmotrutta)幼魚暴露于環境相關濃度(沉積物干質量0.1%)的粒徑為3 000 μm的PS、PET和PE 3種微塑料中113 d，發現暴露均未對幼魚的生長速率產生不利影響；Mazurais等[36]使用10～45 μm粒徑的PE微珠對歐洲鱸魚(Dicentrarchuslabrax)幼魚進行長達36 d的食物相暴露后，發現含PE濃度為10 000 particles·g-1和100 000 particles·g-1的惰性飼料并未對幼魚的生長產生影響。然而，另一些研究則得出了不同的結論。Li等[37]同樣以海水青鳉為受試生物，研究了10 μm PS對海水青鳉早期發育階段的影響，從受精卵開始經28 d暴露后，20 μg·L-1和200 μg·L-1的PS抑制了仔魚的生長。這可能與受試生物所處的生活階段有關，本研究采取孵化后60 d的幼魚為受試生物，而Li等[37]采用魚類更為敏感的早期發育階段。此外，Li等[37]的研究暴露濃度也高于本研究，這可能是得出與本文不同結論的主要原因。Naidoo和Glassom[38]研究發現，使用由9份HDPE薄膜、5份PVC碎片、1份HDPE球和1份PS混合而成的250～1 000 μm粒徑的微塑料，對玻璃魚(Ambassisdussumieri)幼魚進行長達95 d的暴露后，微塑料處理組體長的增長比對照組要少，體質量也比對照組輕。在一項關于微塑料對許氏平鮋(Sebastesschlegelii)行為及代謝影響的研究中，Yin等[39]分別用190 μg·L-1粒徑為15 μm的PS微塑料和粒徑為0.5 μm的PS納米塑料對許氏平鮋進行了14 d的暴露和7 d的恢復，魚的體質量增長率顯著降低，并且微塑料對生長的抑制強于納米塑料。上述研究在所采用的微塑料材質、暴露濃度、粒徑、暴露時間、魚類物種和所處生命階段等方面存在差異，導致魚類對微塑料的攝入、積累和排泄能力不同，可能是相關研究產生不同研究結果的原因。

表1 海水青鳉親代體長和體質量增量(n=3)Table 1 Body length and body mass increment of marine medaka parental fish (n=3)

表2 海水青鳉親代產卵量和受精率(n=3)Table 2 Spawning amount and fertilization rate of marine medaka parental fish (n=3)

圖1 海水青鳉子代11 d胚胎心率(a)和平均孵化時間(b)Fig. 1 Heart rate after 11 d exposure (a) and mean hatching time (b) of marine medaka filial embryos

圖2 海水青鳉子代胚胎孵化率注：*表示P<0.05，與對照組相比。Fig. 2 Hatching rate of marine medaka filial embryosNote: *represents P<0.05, compared with the control.

表3 海水青鳉子代胚胎畸形率(n=3)Table 3 Deformity rate of marine medaka filial embryos (n=3)

在繁殖方面，以產卵量和受精率為考察目標，評估微塑料暴露對海水青鳉親代繁殖的影響。海水青鳉從受精卵至性成熟約需90 d，從受精卵至仔魚孵化出膜平均約需14 d。因此，暴露開始時，海水青鳉尚處于幼魚階段，仍未達到性成熟。經一段時間的暴露，對照組和PS處理組開始同步產卵，表明各組海水青鳉雌魚同步達到性成熟，PS暴露并未對海水青鳉雌魚的性成熟進程產生影響。對照組和PS處理組魚卵的受精率均為100%，表明PS暴露并未對受精過程產生影響。目前已有PS對日本青鳉和海水青鳉繁殖影響的文獻報道。Assas等[40]報道了日本青鳉(Oryziaslatipes)在濃度為107particles·L-1的2 μm PS中暴露21 d后，產卵量未受到顯著影響。該研究比較了日本青鳉和另一種海水魚類爪哇青鳉(Oryziasjavanicus)對PS的生物富集因子，爪哇青鳉的生物富集因子約為4×102，而日本青鳉的生物富集因子僅約為1×102，表明爪哇青鳉對PS顆粒的富集能力更強。該作者認為造成這種差異的原因可能是淡水魚類和海水魚類不同的滲透平衡，爪哇青鳉因滲透壓高需要飲用更多的水，而日本青鳉則僅需飲用少量水來維持液體量，導致爪哇青鳉通過大量飲水攝入更多PS。因此，盡管未就PS對爪哇青鳉繁殖的影響開展相關研究，但上述結果似乎表明PS對爪哇青鳉產生繁殖風險的可能性比日本青鳉更高。海水青鳉作為海水魚類，滲透平衡的調節方式更近似于爪哇青鳉，因此所面臨的繁殖風險可能也高于日本青鳉。在另一項研究中，Wang等[21]報道了海水青鳉暴露于10 μm PS顆粒60 d后，2、20和200 μg·L-1濃度均會延遲性腺的成熟，降低雌性的繁殖力；基因轉錄分析結果顯示，PS暴露對雌性下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸有顯著的負調控作用，而與雌性類固醇生成通路相關基因的轉錄也被下調，導致雌性血漿中17β-雌二醇(E2)和睪酮(T)的濃度下降。該研究的結論與本文不一致，對繁殖的考察階段不同可能是造成結論不一致的重要原因。該研究考察的是PS暴露成魚60 d后的繁殖情況，此時海水青鳉已不處于繁殖初期，而本文研究的則是PS對海水青鳉繁殖初期的影響。PS暴露未對繁殖初期產生負面影響的原因可能有2點：(1)暴露開始至親代產卵所經歷的暴露時間較短，PS尚未對繁殖產生不利影響；(2)在不同的繁殖階段，PS對HPG軸的影響可能不同。此外，本文中微塑料處理組7 d累計產卵量數據離散程度較大，這是由于不同平行間產卵量差異較大造成的，可能與微塑料的性質有關。微塑料與傳統污染物不同，根據其自身密度的差異，或沉入水底，或漂浮于水面[5]，其在暴露水體中的分布是不均勻的，這種不均勻的暴露可能會導致受試生物對污染物響應的個體差異被放大。

圖3 海水青鳉子代胚胎典型畸形特征注：(a)正常胚胎；(b)畸形胚胎(心臟拉長、圍心囊水腫)。Fig. 3 Typical deformity characteristics of marine medaka filial embryoNote: (a) normal embryo; (b) deformity embryo (stretched heart and pericardial sac edema).

在子代胚胎發育方面，以胚胎心率、胚胎平均孵化時間、胚胎畸形率和胚胎孵化率為效應指標，評估海水青鳉親代暴露于PS中對子代發育的影響。結果顯示，親代的PS暴露不會對子代胚胎心率和平均孵化時間產生影響，但會顯著降低子代胚胎孵化率，并造成少量胚胎畸形，主要表現為心臟拉長和圍心囊水腫。上述結果表明，親代的PS暴露不會影響子代胚胎心臟功能和胚胎發育的進程，但會影響胚胎發育的質量。目前，多數關于微塑料對海洋魚類胚胎發育影響的報道，采用的是微塑料直接對胚胎進行暴露的方式。Jakubowska等[35]用3 000 μm粒徑的PS、PET和PE 3種微塑料對海鱒胚胎進行直接暴露，發現并未影響胚胎孵化率和孵化時間。Li等[37]使用10 μm PS對海水青鳉受精卵進行直接暴露，發現20 μg·L-1和200 μg·L-1高濃度PS降低了胚胎孵化能力并延遲了孵化時間。Chen等[41]研究發現，水相暴露于濃度為1×106particles·mL-1的6 μm PS顯著延遲了海水青鳉的胚胎孵化時間，改變了心率，并降低了胚胎孵化率。上述結果只能反映微塑料對魚類早期發育階段的直接影響，而不能反映微塑料對親代暴露而對子代產生的間接影響。Wang等[21]則采用了與本文類似的策略，考察了親代暴露對子代發育的間接影響，不同的是暴露時親代所處的繁殖階段與本文不一致。該研究同樣發現PS降低了胚胎孵化率，并認為親代性腺抗氧化酶受PS顯著影響而導致的胚胎抗氧化系統受損可能是微塑料產生代際影響的主要原因。心臟是魚類胚胎器官發生過程中最先產生功能的器官[32]，通過血液循環為其他身體部位供氧，對化學物質敏感[42]。本研究發現PS對親代暴露會導致部分子代胚胎心臟和圍心囊發育異常，這一現象在相關研究中尚未見報道，具體原因有待進一步探究。

總體上，現有實驗室暴露實驗已不斷證實微塑料對水生生物的危害受其粒徑、暴露濃度和材質等因素影響[43]，但目前有關微塑料的生態毒理學研究仍面臨著多項挑戰，主要體現在：(1)尚未形成相對標準的毒性暴露方法，不同實驗間暴露濃度的單位不統一(particles·L-1或μg·L-1)導致毒性結果可比性不強；(2)實驗暴露濃度遠高于環境中的實際濃度，且生態風險評估中所涉及的長期效應閾值(如NOEC、LOEC)等信息非常欠缺；(3)微塑料作為一種特殊的污染物，與傳統的化學物質存在本質區別，且其作為一種介質載體如何影響環境中污染物的有效性及毒性尚無定論。在真實環境中PS微塑料可能來源于大塊PS塑料垃圾的破碎或人為添加至工業、醫藥以及生活用品中的PS顆粒。本研究選取1×104particles·L-1和1×105particles·L-1的10 μm PS顆粒對海水青鳉開展了長期效應研究，結果顯示，高濃度、小粒徑的PS顆粒并未影響海水青鳉親代的生長、繁殖和子代胚胎的發育進程，但會對青鳉子代胚胎發育的質量產生不利影響，其原因還有待進一步揭示。深入評估微塑料在環境污染物毒性過程中所扮演的角色是亟待關注的重要方向，將有助于科學評估微塑料的生態危害。