超高壓對西瓜汁香氣相關酶的活性影響研究

包洪亮 ，馬永杰，王瑞杰，胡慧杰，杜詠芳，胡雪靜，高雪楠

（1.洛陽師范學院數學科學學院，河南洛陽 471934；2.洛陽師范學院食品與藥品學院，河南洛陽 471934）

西瓜汁是很有潛力的果汁飲品，具有生津止咳、清熱解暑、減輕浮腫、利尿等作用，深受人們的喜愛。但西瓜汁屬于熱敏性物料，在加工過程中容易出現不良氣味、口感下降、營養損失等問題，從而影響產品質量。大量試驗研究表明，果蔬香氣物質由果蔬中各種關鍵酶作用于亞麻酸、亞油酸等香氣前體物質而生成，尤其是果蔬汁在貯藏過程中，其風味的變化主要是由果蔬汁中的脂氧合酶、過氧化物酶及醇?；D移酶等引起的[1-3]。作為非熱加工技術，超高壓處理在保證食品安全性的基礎上，可使酶被激活或者鈍化，不破壞食物的原始風味與營養物質，能在低溫或室溫條件下達到商業無菌，最大程度地保留食品原有的色、香、味，對保持食物品質起到很好的作用[4]。此外，超高壓還具有施壓過程均勻、滅菌均勻、安全系數高、耗能相對較少等優點[5]，適用于富含芳香物質的熱敏性果蔬的加工與處理，并且原料的香味揮發及營養物質損失較少。目前，超高壓技術在草莓、蘋果、柿子、獼猴桃、芒果、杏汁及橙汁等食品加工方面都有一定的應用研究[5-8]，而在西瓜汁方面的研究較少。

研究表明，脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）、氫過氧化物裂解酶（hydroperoxide lyase，HPL）和醇?；D移酶（acyltransferase，AAT），普遍存在于高等植物中，在植物脂肪酸代謝過程中發揮著較大作用[9-12]。這些酶在西瓜冷藏過程中，如果被激活，會使一些風味物質如己醛、反-2-壬烯醛、順-2-壬烯醇、6,10-二甲基-5,9-十一雙烯-2-酮等的質量濃度降低，從而降低西瓜香氣品質[3]。因此，要采取相應技術來控制這三種酶的活性，保留西瓜汁貯藏期內的香氣成分。本文從改變西瓜汁的殺菌技術、避免高溫處理過程入手，結合處理溫度、時間、壓力參數，旨在探求適宜的西瓜汁加工工藝，解決傳統熱處理帶來的問題，使西瓜汁各指標達到市場標準并延長產品貨架期，降低加工難度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高壓設備，BDS200FL，英國STANSTED 公司；紫外分光光度儀，UV-1800，日本島津有限公司；氣相色譜串聯質譜，GC-MS-QP2010，日本島津有限公司；離心機，Sigma-18K，Sartorius 儀器有限公司；單道移液槍，VP，德國Eppendorf 艾本德股份公司；手持式打漿機，HD2069/01，飛利浦電子有限公司。

冰醋酸、無水醋酸鈉、十二水磷酸氫二鈉、二水磷酸二氫鈉、鹽酸、硼酸、亞油酸（LA）、吐溫20、氫氧化鈉、ADH（醇脫氫酶）、Acetyl-CoA（乙酰輔酶A），均購于上海博湖生物有限公司；Tris 堿、MES-TRIS 緩沖液、40%乙醛、Triton-X100（聚乙二醇辛基苯基醚）、PVPP（交聯聚乙烯吡咯烷酮）、氯化鎂、丁醇、DTNB（二硝基苯甲酸），以上所用試劑全部為分析純；實驗用水為二次蒸餾水；順-2-壬烯醇、壬醛、正己醛、反-2-壬烯醛、反,順-2,6-壬二烯醇、鄰苯二甲酸二乙酯、6,10-二甲基-5,9-十一雙烯-2-酮、2-戊基呋喃、十一酸甲酯，分析純，美國Sigma 公司；色譜級乙醇，含量95%，天津市彪仕奇有限公司。

選取新鮮成熟、無機械損傷的‘鄭抗無籽1 號’無籽西瓜作為實驗材料，購于洛陽盛德美超市。

1.2 試驗方法

1.2.1 西瓜汁的制備

選取新鮮成熟、品質優良、無病蟲害、無機械損傷的無籽西瓜，取中心部分瓜瓤榨汁。西瓜汁用單層濾布過濾，然后將過濾后的西瓜汁分裝于鋁箔紙制成的包裝袋中，每袋裝20～30 mL，用塑料薄膜封口機封口。

1.2.2 超高壓處理及貯藏期試驗

將密封好的西瓜汁置于超高壓壓力釜中，調整壓力釜內水至合適的高度，溫度為45 ℃，設定壓力開始施壓即可。

通過查閱文獻[3]，根據消費習慣，對于鮮榨果汁，通常在7 d 之內被消費完，而通過600 MPa、60 min 超高壓處理西瓜汁，其保質期遠超過7 d。因此，結合實際生產，從節約能源和提高效率方面考慮，試驗處理條件設定為200 MPa、20 min，400 MPa、10 min，400 MPa、20 min，400 MPa、30 min，600 MPa、20 min，對照組為用鋁箔紙密封包裝后未經高壓處理的西瓜汁。將處理后的樣品和對照組置于4 ℃冰箱內，貯藏0、1、2、3、5、10 d，隨機抽取樣品進行酶活及風味物質的測定。以原汁為對照，研究處理壓力、處理時間及貯藏期對西瓜汁中LOX、HPL 及AAT 活性的影響。

1.3 酶活性的測定方法

1.3.1 LOX 活性測定

樣品制備：取1.5 mL 西瓜汁和8 mL 磷酸緩沖液（pH=7.0）于離心管中，將離心管放入已預冷的離心機內，在4 ℃條件下，15 000 r/min 離心15 min，所得上清液即為粗酶液。

反應體系：采用3 mL 反應體系。取2.8 mL 磷酸緩沖液（pH=6.8）和100 μL、0.1 mol/L 反應底物液（亞油酸鈉）于具塞試管中，混合搖勻后放入30 ℃水浴鍋中保溫10 min，之后再加入粗酶液100 μL；混勻后倒入比色皿內，反應開始15 s 時，在室溫25 ℃下，波長234 nm 處測定吸光值，記錄15 s 后的1 min 內吸光度OD 值的變化。

1.3.2 HPL 活性的測定

樣品制備：取2 mL 西瓜汁和5 mL 磷酸緩沖液（pH=7.0）于離心管中，將離心管放入已預冷的離心機內，在4 ℃條件下，15 000 r/min 離心30 min，所得上清液即為粗酶液。

反應體系：采用3.5 mL 反應體系。取2 mL 醋酸緩沖液、0.75 mL 反應底物液、0.15 mL NADH、0.1 mL ADH 酶液和0.5 mL 粗酶液于具塞試管中，混合搖勻后倒入比色皿內，在室溫下于波長340 nm 處測定吸光值，記錄1 min內OD 值的變化。

1.3.3 AAT 活性的測定

樣品制備：取2 mL 西瓜汁和5 mL 磷酸緩沖液（pH=7.0）于離心管中，將離心管放入已預冷的離心機內，在4 ℃條件下，15 000 r/min 離心30 min，所得上清液即為粗酶液。

反應體系：采用3 mL 反應體系。取2.5 mL MgCl2溶液、150 μL、乙酰-CoA（乙酰輔酶A）、50 μL 丁醇和150 μL 粗酶液于具塞試管中混合搖勻，添加100 μL 的DTNB，搖勻后倒入比色皿內，在室溫下于波長412 nm 處測定吸光值，記錄1 min 內OD 值的變化。

1.3.4 西瓜汁中典型風味物質含量的方法測定

采用氣相色譜內標法，測定西瓜汁中的風味物質，內標物溶液的配制及風味物質的測定方法參照劉野等[3]的方法，稍有改動。每個樣品取8 mL 西瓜汁，加入到體積為15 mL 的萃取瓶中。加入0.01%（體積分數）內標物溶液0.05mL，使內標物在西瓜汁樣品的質量濃度為0.546mg/mL。

1.4 數據處理

三種酶殘存活性的測定均進行3 次平行操作，取平均值。實驗數據采取Excel 2010 軟件統計，以Origin 9.0繪圖。風味物質測定數據處理，采用SAS 8.12 及Ducan’s多重檢驗（P＜0.05），試驗結果以均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 西瓜汁中LOX 活性的變化

超高壓處理可使酶激活或鈍化，影響香氣合成途徑中酶的作用，進而影響前體物質向香氣化合物的轉化[13-14]。一般情況下，采用較低壓力時，如300 MPa 對PPO、POD 及LOX 等有激活作用，水果中某些香氣成分會因這些酶的激活而受到損失，而400 MPa 處理時可使部分酶失活，使香氣物質的降解減少[1]。經相同壓力（400 MPa）不同保壓時間（10、20、30 min）處理的西瓜汁中LOX 在4 ℃貯藏條件下，其酶活性的變化如圖1 所示。相同保壓時間（20 min）不同壓力（200、400、600 MPa）處理的西瓜汁中LOX在4 ℃貯藏條件下，其酶活性的變化如圖2 所示。

圖1 相同壓力（400 MPa）不同保壓時間處理的西瓜汁在4 ℃貯藏期間LOX 活性的變化Fig.1 Changes of LOX activity in watermelon juice treated with the same pressure (400 MPa) at different holding time during storage at 4 ℃

圖2 相同保壓時間（20 min）不同壓力處理的西瓜汁在4 ℃貯藏期間LOX 活性的變化Fig.2 Changes of LOX activity during storage of watermelon juice treated with different pressure at 4 ℃for the same holding time (20 min)

由圖1、2 可見，貯藏期為0 d 時，經超高壓處理后的LOX 活性均低于對照組。由圖1 可知，相同壓力下，保壓時間越久，酶活性越低；在相同保壓時間下，壓力越大，對LOX 活性的鈍化作用越強。隨著貯藏天數的增加，對照組西瓜的LOX 活性有降低趨勢，而經超高壓處理后的LOX 活性則隨貯藏天數的增加先上升后降低，基本在1～2 d 達到最大值。貯藏期為10 d 時，相同壓力不同保壓時間下，LOX 活性基本一致。另外，貯藏期為2 d 時，400 MPa、10 min 條件下的LOX 活性急速降低，可能是由試驗中的誤差所致。

由圖2 可知，400 MPa、20 min 和600 MPa、20 min 這兩組處理，LOX 活性均是在1～2 d 內顯著上升，而在貯藏2 d 后，酶的活性均呈下降趨勢，隨后隨貯藏天數的增加呈降低趨勢。而在200 MPa、20 min 時，LOX 活性的趨勢和對照組基本一致，說明200 MPa、20 min 的處理條件對LOX 活性基本無影響。

2.2 西瓜汁中HPL 活性的變化

經相同壓力（400 MPa）不同保壓時間（10、20、30 min）處理的西瓜汁中HPL 酶在4 ℃貯藏條件下，酶活性的變化如圖3 所示。相同保壓時間（20 min）不同壓力（200、400、600 MPa）處理的西瓜汁中HPL 在4 ℃貯藏條件下，酶活性的變化如圖4 所示。

圖3 相同壓力（400 MPa）不同保壓時間處理的西瓜汁在4 ℃貯藏期間HPL 活性的變化Fig.3 Changes of HPL activity in watermelon juice treated with the same pressure (400 MPa) at different pressurekeeping time at 4 ℃during storage

圖4 相同保壓時間（20 min）不同壓力處理的西瓜汁在4 ℃貯藏期間HPL 活性的變化Fig.4 Changes of HPL activity during storage of watermelon juice treated with different pressure at 4 ℃for the same holding time (20 min)

由圖3、4 可知，貯藏第0 天時，經超高壓處理后的HPL 活性均高于對照組。隨著貯藏天數的增加，對照組西瓜汁的HPL 活性在0～2 d 時略微上升，隨后呈降低趨勢，而經超高壓處理后的HPL 活性則隨貯藏天數的增加逐漸上升，在1～2 d HPL 活性達到最大值，2 d 后，酶活性也隨著貯藏天數的增加而逐漸降低。貯藏期為10 d時，相同的壓力不同的保壓時間下，保壓時間越長酶活性越低。此外，貯藏期在1～2 d 時，200 MPa、20 min 處理的HPL 活性急速上升，且在2～3 d 內仍維持最大值，該值遠超過其他組，這說明在200 MPa、20 min 處理條件下貯藏時間1～3 d 對HPL 有較強的激活作用。

2.3 西瓜汁中AAT 活性的變化

經相同壓力（400 MPa）不同保壓時間（10、20、30 min）處理的西瓜汁中AAT 在4 ℃貯藏條件下，其酶活性的變化如圖5 所示。

圖5 相同壓力（400 MPa）不同保壓時間處理的西瓜汁在4 ℃貯藏期間AAT 活性的變化Fig.5 Changes of AAT activity during storage of watermelon juice treated with the same pressure (400 MPa)at 4 ℃for different holding time

相同保壓時間（20 min）不同壓力（200、400、600 MPa）處理的西瓜汁中AAT 在4 ℃貯藏條件下，其酶活性的變化如圖6 所示。

圖6 相同保壓時間（20 min）不同壓力處理的西瓜汁在4 ℃貯藏期間AAT 活性的變化Fig.6 Changes of AAT activity during storage of watermelon juice treated with different pressure at 4 ℃for the same holding time (20 min)

由圖5 和圖6 可知，貯藏期為0 d 時，超高壓處理后的AAT 活性均低于對照組，隨著貯藏天數的增加，對照組和超高壓處理的AAT 活性均逐漸上升，且在1～2 d達到最大值，2 d 之后，AAT 活性隨著貯藏天數的增加呈遞減趨勢，10 d 以后AAT 基本無活性。

400 MPa、10 min 和200 MPa、20 min 兩組的酶活性在1 d 時達到最大值，而400 MPa、20 min 和600 MPa、20 min 這兩組的AAT 活性均是在2 d 時達到最大值，之后隨貯藏天數的增加呈降低趨勢，而400 MPa、30 min AAT活性的變化趨勢和對照組基本一致，說明400 MPa、30 min 的處理條件對AAT 活性影響不明顯，除此之外，貯藏2～3 d 時，200 MPa、20 min AAT 活性急速降低且低于對照組，可能是由誤差所致。

通過以上分析可知，超高壓處理西瓜汁的最佳參數條件是壓力400 MPa，保壓時間20 min，貯藏期1～10 d。在最佳參數條件下，三種酶的活性有一定程度的鈍化，可以有效保證西瓜汁的風味品質。

2.4 超高壓處理西瓜汁貯藏中典型風味物質的變化

由表1 可知，采用400 MPa、20 min 超高壓處理西瓜汁，在4 ℃貯藏時，10 d 內各種風味物質含量變化不明顯。綜合分析，采用超高壓處理西瓜汁，其風味物質的變化較小。貯藏期間能夠很好地保證風味物質的品質。因此，超高壓技術結合低溫處理，可對西瓜汁貯藏與加工可以提供條件參考。

表1 400 MPa、20 min 超高壓處理冷藏西瓜汁在4 ℃時典型風味物質質量濃度的變化Table 1 Change of typical flavor compounds content of high hydrostatic pressure treated watermelon juice during storage at 4 ℃for 400 MPa and 20 min

3 結論

本文采用超高壓處理西瓜汁，以AAT、HPL 及LOX作為測定指標，研究了不同超高壓條件對西瓜汁低溫貯藏后香氣相關酶活的影響及變化規律，從而確定了保持西瓜汁香氣品質的最佳參數條件。結果表明：貯藏0 d時，超高壓處理減弱了三種酶的活性，且相同的壓力下，保壓時間越久，殘存酶活性越低。而經超高壓處理后的三種酶活性隨貯藏天數的增加先呈上升趨勢，基本在1～2 d 達到最大值，2 d 之后，酶活性隨貯藏天數的增加逐漸降低，10 d 后三種酶基本無活性。綜合以上分析，根據實際生產過程，從節約能源和提高效率方面考慮，確定超高壓處理西瓜汁的最佳參數條件是壓力400 MPa，保壓時間20 min，貯藏期1～10 d，此時西瓜汁的品質較佳。因此，超高壓處理可以有效保證冷藏西瓜汁貯藏過程中的香氣品質，為西瓜汁貯藏與加工技術提供理論依據。