響應面法優化瓦尼桑黃菌液態發酵工藝

李學震，鄭明珠，馬艷蕊，和法濤*，劉光鵬

（1.吉林農業大學，吉林長春 130118；2.中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東濟南 250220）

瓦尼桑黃（Sanghuangprous vaninii）是桑黃菌的一種，由于其跟桑樹桑黃（Sanghuangprous sanghung）物種親緣關系很近，所以具有抗腫瘤、抗氧化、增強免疫力等活性功能[1]。研究表明，桑樹桑黃只生長在桑樹的活木上，自然生長條件局限，人工栽培困難[2]。而瓦尼桑黃菌生長條件容易控制，可以進行人工代料栽培，因此近年來被廣泛種植[3]。桑黃主要功能成分有多糖、多酚、黃酮和三萜等[4]，其中多酚化合物是桑黃菌的次級代謝產物之一，桑黃子實體和菌絲體中均含有多酚類物質[5]。桑黃素是桑黃菌中的多酚類物質之一，可以抑制香蕉中水溶性多糖的降解，從而延緩香蕉在貯藏過程中的軟化和變質[6]。雖然，楊樹桑黃可以進行人工栽培，但是生長周期長、需要不斷調整每個生長階段的生長條件。桑黃菌液態發酵可以大量生產桑黃菌菌絲體，菌絲體中含有大量的多酚類物質，且接種量少，發酵周期短，只需要5～7 d[7]。

有研究表明，在培養基中加入真菌激發子[8]、脂類物質[9]、桑樹產物[10-11]和稀土元素[12]等，可以有效提高桑黃菌液態發酵中黃酮、多糖和三萜等目標產物的產量。Ma 等[13]發現在培養基中分別添加0.03 g/L 萘乙酸和0.02 g/L 豆香素，可以明顯提高桑黃菌液態發酵中的黃酮產量，但以不同糧食作為桑黃菌液態發酵培養基尚未見報道。因此，本實驗選用5 種不同糧食作物作為液態發酵培養基的碳源，4 種動植物氮源和兩種桑產物，在單因素實驗的基礎上，采用Plackett-Burman 實驗設計和中心組合實驗設計，優化了桑黃菌液態發酵的生產工藝，為桑黃菌液態發酵生產多酚類物質及產品利用與開發提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試菌株

桑黃菌菌株，由山東省臨清市哲碩農產品有限公司提供，經山東省農業科學院鑒定為瓦尼桑黃菌（Sanghuangporus vaninii）。

1.1.2 培養基

PDA 培養基，購自青島賓得生物技術有限公司。PDB培養基，購自北京索萊寶生物科技有限公司。

基礎培養基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.75 g，氯化鈣0.75 g，蒸餾水1 L。

1.1.3 試劑

葡萄糖、無水氯化鈣、無水碳酸鈉，天津大茂化學試劑廠；磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂，國藥集團化學試劑有限公司；福林酚試劑，上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇，天津富宇精細化工有限公司，以上試劑均為分析純。酵母粉，賽默飛世爾科技公司；牛肉膏，國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨，北京雙旋微生物培養基制品廠；桑葉、桑葚由山東省臨清市哲碩農產品有限公司提供；小米、玉米、高粱、蕎麥、豆粕、麩皮均為市售。

1.1.4 儀器與設備

BSC-150 恒溫培養箱、YXQ-LS-100A 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；手持攪拌器，揚州均瑞機械設備有限公司；無菌操作臺，深圳藍思凈化科技有限公司；打孔器，廣州科友生物科技有限公司；UV-1000 型紫外分光光度儀，上海天美科學儀器有限公司；TDL-5A 低速大容量離心機，上海安亭科學儀器有限公司；ME-104 型萬分之一天平，梅特勒托利多儀器有限公司；HH-4 型數顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；R308 型旋轉蒸發儀，上海申生科技有限公司；ZWYR-2112B 型恒溫調速搖床柜，上海智誠分析儀器制造有限公司；FD-2 型真空冷凍干燥機，上海比朗儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種平板活化與制備

取實驗室中已分離純化后的桑黃菌菌株斜面，在無菌操作臺上取0.5 cm2接入PDA 平板，菌株長到4～6 cm時，保存于4 ℃冰箱中備用，使用前在28 ℃培養箱中恒溫培養6 h。

1.2.2 發酵種子液制備

取平板上的菌絲，用直徑5 mm 的打孔器打孔，接入PDB 培養基，裝液量每瓶100 mL/250 mL，每瓶接種4塊。28 ℃、150 r/min 振蕩培養7 d，待菌種長滿搖瓶，用手持攪拌器在無菌操作臺內將菌絲打散，但不破壞細胞，放入4 ℃冰箱備用，使用前在搖床28 ℃恒溫培養6 h。

液體發酵培養：將制備的種子液，接入配置好的培養基中，接種量10%，裝液量200 mL/500 mL，每個菌種3瓶。28 ℃、150 r/min 振蕩培養7 d。

1.2.3 桑黃菌液態發酵培養基的碳源篩選

選擇5 種糧食作物為碳源小米粉、玉米粉、薏米粉、蕎麥粉、高粱粉，添加量均為2%，分別加入基本培養基中。培養條件：26 ℃，裝液量200 mL，搖瓶轉速150 r/min，500 mL 搖瓶培養7 d，抽濾得菌絲體，凍干后測多酚含量和菌絲生物量。

1.2.4 桑黃菌液態發酵培養基氮源篩選

選擇4 種常見的氮源：豆粕粉、麩皮粉、酵母粉、牛肉膏，添加量均為1%，分別加入基本培養基中，培養條件同1.2.3，抽濾得菌絲體，凍干后測量多酚含量和菌絲生物量。

1.2.5 桑黃菌液態發酵培養基生長因子篩選

選用兩種生長因子：桑葉粉和桑葚粉，添加量均為1%，分別添加到基本培養基中。培養條件同1.2.3，抽濾得菌絲體，凍干后測多酚含量和菌絲生物量。

1.2.6 Plackett-Burman 實驗設計

根據單因素實驗結果配制培養基，將制備好的瓦尼桑黃菌種子按照實驗設計的接種量進行接種。PB 試驗設計包括8 個因素，即小米粉、酵母粉、桑葉粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、pH 和接種量；以上8 個因素各設置高水平（+1）和低水平（-1），實驗設計見表1。

表1 Plackett-Burman 試驗的因素和水平編碼值Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.2.7 中心組合實驗設計

根據Plackett-Burman 實驗結果，利用Design-Expert 10.0 軟件對具有顯著性的因素包括小米粉、磷酸二氫鉀、接種量進行中心組合實驗設計，并以桑黃菌菌絲總多酚得率為響應值，進行三因素三水平實驗設計，共20 個實驗點，詳見表2。

表2 中心組合實驗設計因素及水平Table 2 Factors and levels of central composite design

1.2.8 桑黃菌菌絲生物量及總多酚含量測定

將發酵培養液抽濾得菌絲體，將菌絲體取出用蒸餾水清洗3 次，再抽濾后，在-40 ℃條件下預冷凍24 h，冷肼溫度-80 ℃，真空度10 Pa 條件下凍干12 h，稱重法測菌絲生物量。桑黃菌絲總多酚得率按照冉軍艦等[14]的方法進行標準曲線的繪制與測定。

1.2.9 數據處理

采用Origin 9.0 進行繪圖，SPSS Statistics 22.0 進行數據統計與分析，Design-Expert 10.0 進行實驗設計及方差分析。

2 結果與分析

2.1 總多酚含量測定標準曲線的建立

采用福林酚法，在765 nm 處測定吸光度，總多酚標準曲線：y=1.320 8x＋0.000 6，R2=0.998 5，線性范圍為10～160 μg/mL。

2.2 發酵培養基碳源的篩選結果

不同植物碳源加入液態發酵培養基，以桑黃菌菌絲生物量和多酚含量為指標進行篩選[15]。由圖1 可以看出，以小米粉為碳源發酵桑黃菌的菌絲生物量和多酚含量均最高，分別為2.21 g 和2.05 mg/g。玉米粉發酵的桑黃菌絲體多酚含量1.82 mg/g，菌絲生物量為1.12 g。高粱粉發酵桑黃菌菌絲生物量和多酚含量均最低，分別為0.35 g和1.06 mg/g。蕎麥粉發酵桑黃菌菌絲體生物量為0.59 g，與薏米粉發酵桑黃菌相差3 倍左右，但菌絲多酚含量高于薏米粉發酵桑黃菌，為1.23 mg/g；薏米粉發酵的桑黃菌菌絲生物量和多酚含量分別為1.68 g 和1.12 mg/g。綜上，小米粉發酵的桑黃菌兩指標均最佳，因此選擇小米粉為液態發酵培養基碳源。

圖1 不同植物碳源對桑黃菌發酵的影響Fig.1 Effects of different plant carbon sources on the fermentation of Sanghuangprous

2.3 發酵培養基氮源篩選結果

圖2 顯示了不同氮源對桑黃菌發酵的影響。由圖知，以豆粕粉為氮源發酵的桑黃菌菌絲生物量和多酚含量分別為1.66 g 和1.52 mg/g，低于酵母發酵桑黃菌的菌絲生物量（2.01 g）和菌絲多酚含量（2.48 mg/g）；同為植物氮源，以麥麩為氮源發酵的菌絲生物量只有0.77 g，多酚含量僅1.13 mg/g；牛肉膏發酵得到的菌絲生物量最低，為0.57 g，但多酚含量高于麥麩，為1.31 mg/g。綜上，選擇酵母粉作為氮源進行桑黃菌液態發酵較適宜。

圖2 不同氮源對桑黃菌發酵的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources on fermentation of Sanghuangprous

2.4 發酵培養基生長因子篩選

有研究表明，桑樹枝水提物能增加桑黃菌液態發酵的菌絲生物量，及發酵液中有效成分的含量[10]。本實驗采用桑葉和桑葚作為生長因子，考察其對桑黃菌液態發酵菌絲生物量和多酚含量的影響，結果見圖3。由圖可知，添加1%桑葉粉后，桑黃菌液態發酵菌絲生物量為1.34 g，菌絲多酚含量為1.85 mg/g，明顯高于添加1%桑葚粉發酵的菌絲生物量（1.14 g）和多酚含量（1.22 mg/g）。因此，選用桑葉粉作為液態發酵培養基的生長因子。

圖3 不同生長因子對桑黃菌發酵的影響Fig.3 Effects of different growth factors on the fermentation of Sanghuangprous

2.5 Plackett-Burman 實驗設計結果及方差分析

根據文獻，除本實驗篩選的碳源、氮源及生長因子外，微量元素、pH 值和接種量也對菌絲多酚含量產生影響。因此，對影響桑黃菌菌絲多酚含量的8 個因素，即小米粉（X1）、酵母粉（X2）、桑葉粉（X3）、MgSO4·7H2O（X4）、KH2PO4（X5）、CaCl2（X6）、pH（X7）、接種量（X8）進行了研究。結果如表4 所示，當X2和X5處于低水平，X1、X3、X4、X6、X7、X8處于高水平時，桑黃菌絲多酚含量達到了2.51 mg/g；當X3、X7、X8處于低水平，X1、X2、X4、X5、X6，桑黃菌絲多酚含量僅有0.32 mg/g。

表4 Plackett-Burman 實驗設計結果Table 4 Results of Plackett-Burman experimental design

通過Design-Expert 10.0 軟件對Plackett-Burman 實驗結果進行數據分析，在所進行實驗的8 個因素中，有3個因素對結果影響顯著，分別是小米粉、KH2PO4和接種量。根據擬合方程：Y=+1.63-0.19X1-0.16X2+0.18X3-0.06X4-0.32X5-0.09X6+0.16X7+0.28X8可知，R-Sq(adj）=87.77%，說明方程擬合度良好。由表5 可知，在影響試驗結果最顯著的3 個因素中，X8對試驗結果影響最大，X5次之，X1最小，其中X1和X5系數為負值，說明呈現負效應，X8系數為正值，說明呈現正效應。

表5 Plackett-Burman 實驗方差分析Table 5 Variance analysis of Plackett-Burman

2.6 中心組合實驗設計結果及方差分析

采用中心組合實驗設計，以多酚類化合物為評價指標，對培養基中小米粉、KH2PO4加量和接種量進行優化，結果見表6。利用Design-Expert 10.0 軟件對實驗數據進行分析，得到桑黃菌菌絲體中多酚含量（Y）與小米粉（A）、KH2PO4（B）、接 種 量（C）之 間 的 回 歸 方 程：Y=2.53+0.21A+0.31B+0.21C+0.19AB+0.22AC+0.10BC-0.29A2-0.51B2-0.31C2。

表6 中心組合實驗結果Table 6 Result of central combination design

回歸分析表明（見表7），模型P＜0.000 1，說明回歸方程差異極顯著，實驗設計可靠，同時失擬項P=0.077 9＞0.05 不顯著，表明此模型與實際值的吻合度高，模型精確。R2=0.937 4，即約93.74%桑黃菌菌絲多酚變化可由上述模型解釋，說明該模型的預測值與實際值之間的相關度較好。模型中1 次項A、B、C 對桑黃菌菌絲多酚影響顯著，交互項AB、AC，二次項A2、B2、C2對多酚含量影響顯著，顯著性次序為B＞A＞C。

表7 中心組合實驗結果方差分析Table 7 Variance analysis of central combination design

2.7 響應面分析

圖4 是通過Design-Expert 10.0 軟件處理得出的結果，對培養基中小米粉、KH2PO4和接種量3 個因素的兩兩交互作用進行分析。當接種量一定時，菌絲總多酚含量隨著KH2PO4和小米粉添加量的增加先增后減。KH2PO4等高線圖的變化密集，小米粉的等高線變化較稀疏，即KH2PO4對菌絲多酚含量的影響比小米粉顯著（圖4a）。當KH2PO4一定時，桑黃菌菌絲多酚含量隨接種量的增加而增加，隨小米粉含量的增加先增大后減少，且兩者有較強的交互作用，相對于小米粉等高線比接種量的密集，即接種量比小米粉對菌絲多酚影響顯著（圖4b）。當小米粉含量一定時，多酚含量隨接種量的增加而增加，隨KH2PO4含量先增加后減少，兩者沒有顯著的交互作用，相對接種量而言，等高線向KH2PO4變化較密集，因此KH2PO4對菌絲多酚含量影響較接種量顯著（圖4c）。

圖4 響應面等高線圖Fig.4 Contour map of response surface

綜上所述，根據模型預測的最佳發酵方案為小米粉24.00 g/L、酵母粉10 g/L、桑葉粉10 g/L、KH2PO41.08 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、CaCl21 g/L、pH 6.5、接種量11.64%，在此條件下發酵的桑黃菌菌絲體總多酚含量預測值為2.62 mg/g。

2.8 驗證實驗

根據上述培養基配方進行驗證實驗，檢測理論值與實際結果是否一致。在三次平行試驗后，測得桑黃菌發酵菌絲多酚含量為2.63 mg/g，相對誤差在±0.5%以內，且有較好的重復性，表明培養基優化結果正確可靠。

3 結論與討論

本試驗在三組單因素實驗的基礎上，篩選出適用于桑黃菌液態發酵的碳源、氮源和生長因子，結果表明：小米、酵母粉和桑葉粉對桑黃菌液態發酵高產菌絲體和總多酚均有顯著影響。通過PB 實驗設計和中心組合實驗設計及響應面分析，優化了桑黃菌液態發酵多酚高產的發酵工藝條件，即小米粉24.00 g/L、酵母粉10 g/L、桑葉粉10 g/L、KH2PO41.08 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、CaCl21 g/L、pH 6.5、接種量11.64%，在此條件下發酵桑黃菌菌絲總多酚含量為2.62 mg/g。在驗證實驗中，桑黃菌菌絲總多酚含量為2.63 mg/g，相對誤差較小，實驗效果穩定，可以為以液態發酵法大量生產桑黃菌絲多酚提供理論支持。