莖用萵苣褪綠心腐病調查研究

胡啟鑌，劉建密*，陳文樂，陳彩霞，黃培枝，林積秀

（1.福建三明市植保植檢站，福建三明 365000；2.福建永安市植保植檢站，福建永安 366000）

莖用萵苣是福建省春、秋兩季的主要經濟作物，‘飛橋萵苣’作為主栽品種，具有地方特色，并獲“國家地理標志保護產品”稱號。因其質地爽脆，味道鮮甜、風味獨特，深受消費者歡迎，以‘飛橋萵苣’為主要品種的莖用萵苣種植已成為當地農業增效、農民增收的支柱產業之一。

2005 年在‘飛橋萵苣’原產區永安等地首次出現一種萵苣新病害，帶病移栽后造成萵苣死苗、缺株，后期感染造成頂部葉片褪綠、生長停滯、莖部變褐、不堪食用等；罹病株喪失經濟價值。2008 年，該病在莖用萵苣種植區爆發為害，平均株發病率達20.5%，嚴重的地塊株發病率高達53.6%。2012 年明確了該病是一種植原體病害，并將之命名為“莖用萵苣褪綠心腐病”（lettuse chlorotic leaf rot disease，LCLRD）。該病的發生嚴重影響了莖用萵苣的產量、質量和效益。因此，在‘飛橋萵苣’主栽區永安市調查了該病害的病原、傳播介體、寄主種類、病害發病規律及防控技術等，總結了一套科學有效的莖用萵苣褪綠心腐病綜合防控技術，以推廣應用。

1 試驗方法

1.1 病原鑒定方法

1.1.1 病因排查

為明確病因，在萵苣生產季開展了大量田間病因篩查試驗。田間試驗均設空白對照，按照正常生產栽培。缺素試驗中各處理撒施或噴施不同元素（鈣肥、硼肥、錳肥、鋅肥等）種類的肥料；藥劑試驗中不同處理噴施不同類型藥劑（治療細菌、抑制真菌、抗病毒劑、殺蟲劑、殺螨劑等藥劑）或全程覆蓋防蟲網；抗生素試驗各處理采用不同類型抗生素（青霉素、土霉素）灌根的方法；不同類型的試驗均設3 次重復，隨機排列，依次分年度開展。

室內試驗采用常規病原菌分離培養方法，室內或保濕培養或直接用培養基培養，并用普通光學顯微鏡進行觀察。根據病毒病的傳播特點，開展傳統的摩擦接毒試驗。

1.1.2 病原鑒定

采用DAPI 熒光顯微鏡檢測。取新鮮萵苣切100～200 μm 厚度的薄片，用戊二醛固定，DAPI（4＇,6-二脒基-2-苯基吲哚鹽酸）染色，最后用Leica DM6000B 落射熒光顯微鏡檢查韌皮部篩管內植原體特異性熒光的有無和強弱，紫外線激發濾光片波長為365 nm，阻斷濾光片波長為420 nm。

用PCR 法擴增。使用植原體16S rDNA 基因序列通用引物R16mF2（5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′）和R16mR2（5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′），對病株及健康株分別提取總DNA，以提取的植物總DNA 為模板進行PCR 擴增。

采用電子顯微鏡觀察。取染病根和葉脈組織進行固定和超薄切片，通過透射電子顯微鏡觀察植物韌皮部篩管中的植原體細胞形態，發現其形狀呈球狀、橢圓形或不規則形且大小在60～1 100 nm 范圍的無細胞壁菌體。另在植物維管束組織中找到成熟的篩管，在篩管內觀察到符合的菌體形態，則判斷為植原體的把握性就很大。

1.2 傳播介體鑒定方法

利用植原體16S rDNA 基因的PCR 擴增通用引物R16mF2/R16mR2 和R16F2n/R16R2，對昆蟲樣本總DNA進行巢式PCR 鑒定，檢測各種葉蟬在自然條件下攜帶莖用萵苣褪綠心腐植原體的情況。

葉蟬回接試驗，萵苣生產季采用田間捕捉葉蟬活蟲，全部放入含有盆栽萵苣褪綠心腐病株的養蟲籠中，飼菌3 d 后將葉蟬從中挑選歸類后分別放入盆栽健株的養蟲籠中飼養，每個養蟲籠放置2～3 株經防蟲網育苗的萵苣健株，每個養蟲籠放置同種類的昆蟲1～5 頭，觀察健株是否發病，30 d 后利用植原體16S rDNA 基因的PCR 擴增通用引物R16mF2/R16mR2 和R16F2n/R16R2，對萵苣樣本總DNA 進行巢式PCR 鑒定。

1.3 寄主植物鑒定方法

在永安當地不同季節采集萵苣田間雜草及萵苣田周圍有疑似叢枝、簇芽、小葉、黃化等癥狀的農作物和林木，利用植原體16S rDNA 基因的PCR 擴增通用引物R16mF2/R16mR2 和R16F2n/R16R2，對各植物樣本總DNA 進行巢式PCR 鑒定，檢測各種植物帶菌情況。

2 結果與分析

2.1 病原

2.1.1 田間癥狀

苗期無癥狀或癥狀不明顯，帶病植株移栽后至蓮座期，先是在心葉顯癥，心葉出現褪綠或褪紅，葉色變淡變白，隨后頂部葉片挺直變細，嫩葉基部流膠，而后停止生長，最后心腐死株。旺長抽莖后，罹病植株頂部葉片褪綠或褪紅變白、生長停滯。剖開莖部，早期感染部位變褐或干枯，近根莖部外層變褐；后期感染莖中髓失水成空心狀，近根莖部略有變褐[1-2]。

2.1.2 病因排查分析

多年病因篩查試驗結果已由項目組林積秀等[1-2]發表，根據多年的試驗結果，分析得出：首先排除了缺鈣、硼、錳等缺素原因；運用傳統的摩擦接毒試驗，健康植株未發病，田間藥劑試驗用抗病毒病藥劑處理對該病害無緩解效果，初判非病毒引起；室內試驗未能分離出細菌、真菌，將病部高濕培養，肉眼和顯微鏡均未發現有噴菌現象或菌絲體，同時各類型藥劑試驗表明，細菌性、真菌性藥劑處理也沒有使病害變輕，初判非細菌、真菌引起；田間調查發現，在萵苣地上部和地下部均未見明顯的咀嚼式口器昆蟲留下的蟲口傷，田間病因篩查試驗中覆蓋防蟲網和噴施殺蟲劑兩個處理可以緩解或減少病害的發生，苗期覆蓋防蟲網大田期噴施殺蟲劑的復合處理有明顯的防控效果，試驗確認了萵苣褪綠心腐病的發生為害與某種或某些種昆蟲蟲量的多少密切相關，防蟲治蟲可以有效地減輕該病的發生。同時選用土霉素和青霉素兩種抗生素對病株進行灌根試驗，發現用土霉素灌根處理后，病株癥狀發展得到有效抑制，新發枝葉逐漸恢復正常，而青霉素處理則無效，病株持續發展，直至整株死亡，由于青霉素作用部位為細胞壁，而土霉素作用部位為細胞膜，結合防蟲治蟲可減緩病害發生，推測該病應為刺吸式口器昆蟲傳播且由只有細胞膜而無細胞壁的植原體引起[3-5]。

2.1.3 病原鑒定

用DAPI 熒光顯微鏡檢測得出（圖1），在病株主莖和葉中肋橫切片的外生韌皮部區域和內生韌皮部區域都存在亮藍色的植原體DNA 被染色后發出的強熒光斑；從主莖和葉中肋的縱切片中可以看到長條狀、充滿植原體DNA 藍熒光的篩管細胞，或單一篩管存在植原體熒光，或多條篩管同時充滿熒光，而健康植株中未見植原體特異性熒光。

圖1 萵苣植原體DAPI 熒光顯微鏡觀察結果Fig.1 DAPI fluorescence microscopy observations of symptomed lettuce plant

經PCR 檢測，從病株中檢測得到大約1.4 kb 的DNA片段，經NCBI 數據庫中BLAST 分析，為翠菊黃化組（16Sr Ⅰ）成員，進一步系統進化樹分析得出該組歸屬于16SrⅠ-B 亞組植原體，同時又用電子顯微鏡觀察了莖用萵苣褪綠心腐病植原體的微觀形態。在感病萵苣的葉脈和根的組織篩管細胞中發現了圓形或不規則形狀的植原體存在，大小在200～800 nm 之間[6-7]。

2.2 傳播介體

試驗共檢測了12 種葉蟬和1 種蝽象，共計116 個樣本，其中葉蟬7 號（未定屬種）、黑額二叉葉蟬、褐室二斑葉蟬和黃綠二室葉蟬4 種葉蟬的14 個樣本中攜帶植原體。如圖2 電泳圖譜所示，黑額二叉葉蟬、褐室二斑葉蟬和黃綠二室葉蟬的4～6 泳道與3 泳道的正對照均在1 200 bp 左右的位置顯示明亮的目的條帶,初判斷葉蟬7號、黑額二叉葉蟬、褐室二斑葉蟬和黃綠二室葉蟬這4 種葉蟬為萵苣褪綠心腐病的潛在傳播媒介。

圖2 部分葉蟬帶菌情況巢式PCR 電泳圖譜Fig.2 Nested PCR electrophoresis map of some leafhopper

飼菌回接試驗于2013—2016 年持續了做了3 個萵苣生產年度，共做了75 批次14 種昆蟲（包括葉蟬7 號、黑額二叉葉蟬、褐室二斑葉蟬和黃綠二室葉蟬等10 種葉蟬，白背飛虱、褐飛虱和2 種蝽象）的回接試驗，結果顯示：有2 次回接黑額二叉葉蟬的健株在回接后表現褪綠心腐癥狀，并檢測到了萵苣褪綠心腐病植原體；在黑額二叉葉蟬回接的3 次未顯癥萵苣上也檢測到萵苣褪綠心腐病植原體，從而確定了黑額二叉葉蟬為萵苣褪綠心腐病的媒介昆蟲[7]。

2.3 寄主植物

試驗共采集了21 科61 種植物共計518 株樣本，其中農作物種類有16 種，分別是油麥菜、萵苣、辣椒、白蘿卜、生菜、包菜、茼蒿菜、馬鈴薯、玉米、花生、甘薯、煙草、茄子、薏仁、空心菜和西紅柿；林木種類有4 種，分別是苦楝、竹柏、梧桐和竹子；雜草種類有41 種。

經巢式PCR 檢測（如圖3 所示），泳道1 萵苣病株為正對照，泳道2～11 為其他植物，顯示與正對照有相同大小的目的條帶，即在辣椒、苦楝、油麥菜、生菜等中檢測到植原體的存在。同時在永安開展調查時，發現黃椒、紅椒、雞爪椒和長椒上檢測出植原體，而朝天椒和牛角椒未檢測出植原體，從而明確了辣椒、苦楝、油麥菜、生菜為莖用萵苣褪綠心腐病的中間寄主植物[7-9]。

圖3 部分寄主植物的巢式PCR 電泳圖片Fig.3 The nested PCR electrophoresis map of some of the host plants

3 發病規律

莖用萵苣播種早，葉蟬密度高發病重；氣溫高，遇天氣干旱，利于葉蟬活動繁殖和植原體增殖，發病重；管理粗放，雜草多，發病重；連作田發病重。黑額二叉葉蟬蟲量大的田塊辣椒叢枝?。ㄖ苍w病害）發病重，前作田為辣椒的田塊莖用萵苣褪綠心腐病發病重。經蟲情測報燈下觀察，黑額二叉葉蟬發生與秋萵苣生長期高度吻合，9—10 月為燈下高峰期。該葉蟬體型小，雄蟲2.6～2.7 mm，雌蟲2.7～2.8 mm，田間多在葉背面或雜草中棲息，活動方式多為跳躍飛行，活動范圍較??；驚擾后易跳躍，不易近距離觀察，田間未見卵少見若蟲，成蟲對黃板有趨性。

該病的初侵染源主要是中間寄主辣椒、苦楝、油麥菜和生菜，在萵苣生長季（9 月至翌年4 月）通過黑額二叉葉蟬刺吸傳病，或本身帶毒的黑額二叉葉蟬直接為害傳??；該病的再侵染主要依靠媒介昆蟲黑額二叉葉蟬在田間短距離傳播；病原物需要在活體萵苣或中間寄主體內越冬，也可在越冬的黑額二叉葉蟬體內存活，來年氣候條件適宜，繼續傳播為害；春萵苣生產季結束后，黑額二叉葉蟬在中間寄主、雜草或其他植物上繼續繁殖生存，轉主為害辣椒等中間寄主，9 月份繼續為害秋萵苣[10]。

4 綜合防控技術及成效

4.1 綜合防控技術

根據莖用萵苣褪綠心腐病是植原體病害這一特征，在生產上宜采用“農業防治、治蟲防病”的防治策略[10-12]，即協調應用農業、物理、生物、化學防治措施，開展生態調控，阻斷或減少蟲媒與作物的接觸傳病，控制田間蟲媒種群數量，防范莖用萵苣褪綠心腐病爆發成災。

4.1.1 農業防治

（1）適時播種

在三明高海拔地區（海拔500 m 以上），莖用萵苣播種期宜安排在9 月初，中低海拔地區（海拔500 m 以下），莖用萵苣播種期宜安排在9 月20 日左右。其他市、縣可按相應氣象狀況調整播種期，遠離辣椒、苦楝樹、油麥菜和生菜等其他寄主生長地育苗，減少侵染為害。

（2）施足基肥

種植田要重施基肥，掌握在移栽前3～5 d，每667 m2施腐熟有機肥2 500 kg、鈣鎂磷肥100 kg 和45%三元復合肥50 kg，然后翻耕整畦。

（3）田間生態調控措施

一般在播種后18 d 左右，萵苣苗4～5 葉時打孔移栽。移苗帶土，宜在陰天或傍晚移栽定植，定植后澆透定根水。移栽后至團棵期土壤要保持濕潤，采用早晚噴淋澆水，澆透水，使田間一直保持高濕狀態，創造有利于幼苗扎根成活、不利于葉蟬生長的環境，控制葉蟬種群的突增。幼苗成活后，結合灌水每667 m2每次追施5 kg 尿素和5 kg 硫酸鉀，隔5～7 d 澆施一次，促其早生快發，縮短易受害感病期。肉質莖形成期要求水分充足，缺水莖棒小，莖基部表皮易開裂，團棵期后忌潑澆，以溝灌為主，保持畦面干爽。蓮座期葉面噴施0.3%硼砂液一次。萵苣現蕾前或心葉與外葉齊平時及時采收。

（4）及時拔除病株補植健株

拔苗移栽時，要剔除已表現出輕微癥狀的感病株，做到少帶病苗進大田。同時在移栽時要多預留一些假植苗備用。大田期要經常巡查，發現病株須及時拔除，并從假植苗中取健株補栽。拔除的病株不能隨意丟棄，必須集中堆漚。

4.1.2 物理防治

（1）防蟲網覆蓋培育壯苗

播種后用30 目防蟲網覆蓋，網上加蓋黑色遮陽網。覆蓋形式為將竹片彎成小拱插于大田畦溝，拱架上覆蓋防蟲網，網底邊用土塊壓實，成小拱棚。要避免苗長高后葉片緊貼防蟲網給葉蟬攝食傳病有可乘之機。稀播育壯苗，每10 m2播5 g 種子。萵苣出苗后去掉遮陽網。萵苣苗期施水、肥可直接從防蟲網上方施入，不能掀網。

萵苣苗移栽前2～3 d 揭開防蟲網煉苗時，要隨即噴施吡蚜酮+高效氯氰菊酯等農藥防范葉蟬為害，同時做到帶藥移栽。

（2）大田期黃板誘殺

萵苣移栽大田后，應立即懸掛黃板。每667 m2均勻懸掛25 cm×30 cm 的黃板30 片左右，黃板下端高出萵苣植株10～15 cm 為宜，并隨植株的生長及時調整黃板的懸掛高度。

4.1.3 化學防治

（1）苗期噴藥防治蟲媒

苗期未采用防蟲網覆蓋育苗的，在第二片真葉展開時，選用吡蚜酮或噻蟲嗪加上高效氯氰菊酯，按照包裝說明的用量兌水噴霧，防止葉蟬及其它害蟲為害傳??；7 d后再噴一次；移栽前2～3 d 時再噴一次藥，帶入大田，防范剛移栽就遭受葉蟬的取食傳病。采用防蟲網覆蓋育苗的，需在移栽前2～3 d 揭網煉苗時噴一次上述藥劑，之后帶入大田。

（2）大田期適時噴藥防治葉蟬

萵苣移栽7 d 后選用吡蚜酮或噻蟲嗪與醚菊酯或高效氯氰菊酯或聯苯菊酯，按照包裝說明，兌水噴霧防治，藥后5～7 d 續噴1 次，藥劑輪換使用，防范大田前期媒介葉蟬取食傳病。

4.2 經濟、社會和生態成效

4.2.1 經濟效益顯著

2014—2018 年5 年間，項目組在永安、大田、沙縣、建甌、武平等縣（市）建立莖用萵苣褪綠心腐病綜合防控技術示范片，示范面積為200 hm2。實驗得出：該病平均株發病率1.64%、防治效果達90.5%，平均產量達3 513.8 kg/667 m2，比對照增產437.7 kg/667 m2，萵苣價格按1.5元/kg 計算，增收656.55 元/667 m2。經多年萵苣農戶實際調查結合試驗示范，示范區節工0.7 d/667 m2，按日工資100 元計算，可節約工本70 元/667 m2；示范區減少物化成本15.7 元/667 m2；示范區減少農本85.7 元/667 m2。增收節支742.25 元/667 m2，項目實施5 年累計推廣9.1萬hm2，總經濟效益10 億元以上，經濟效益顯著。

4.2.2 社會、生態效益顯著

明確了萵苣褪綠心腐病的發病原因，并采取了高效的綜合防控措施，有效抑制了萵苣產區莖用萵苣褪綠心腐病的爆發為害，增加了經濟效益，因此萵苣種植戶、消費者滿意度逐年上升，社會效益明顯，同時也減少了農藥殘留，保護了田間生物的多樣性和農田生態環境，生態效益顯著。

5 展望

自植原體被發現以來，植原體病害研究取得了重要進展。但由于植原體為韌皮部?；?，不易在培養基上進行人工培養，因此對植原體的研究依然面臨著許多困難和挑戰，這也就限定了病害控制手段的開發。目前有效的措施包括加強防控、利用寄主植物抗性、清除初侵染源和綜合治理媒介昆蟲切斷傳播途徑等，可以控制植原體病害的發生和流行[11-12]，但針對植原體病原本身的防控研究較滯后。

就萵苣褪綠心腐病而言，其媒介昆蟲、中間寄主等還有待深入研究。如在萵苣、辣椒等田間發現了形態特征有明顯不同的30 余種葉蟬，這些種類中如何分類定名，有待進一步研究，其中一種葉蟬優勢種群可能為新種。在中間寄主的研究方面，本試驗在分析萵苣褪綠心腐病時，發現了一些其他作物的植原體病害，如辣椒叢枝病，這種病害易與病毒病混淆；同時在植原體病害本底調查等方面還有待進一步研究。