外泌體在急性心肌梗死診斷及預后的應用價值

項楚涵，張甜甜，張步春

外泌體是細胞分泌的具有脂質雙分子層結構的細胞外囊泡，內含DNA、RNA、代謝物、脂質、胞質和細胞表面蛋白，是細胞間通訊的重要介質[1]。近年來有關外泌體與AMI關聯性的研究日益增多。本文旨在檢索國內外近期已發表文獻深入分析外泌體在AMI中的作用及機制，為診斷和治療急性心肌梗死提供新的思路。

1 外泌體概述

外泌體的大小在40～160 nm，其平均直徑100 nm，主要來源于細胞的內涵體(Endosome)。外泌體由細胞內的內涵體通過胞吐作用釋放到胞外形成的[2]。

外泌體內包含核酸、細胞因子、蛋白質、脂類等多種物質，在細胞間的通訊中起到介質作用。所有培養的細胞類型均可分泌外泌體，且外泌體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁中。外泌體膜上富含參與外泌體運輸的四跨膜蛋白家族(CD63、CD81和CD9)；熱休克蛋白家族((HSP60、HSP70、HSPA5、CCT2和HSP90)。外泌體的分離和富集是外泌體生物醫學研究和臨床應用分析前的必要環節。不同的分離和富集方法會影響外泌體的數量、類型和純度。目前外泌體的提取方式主要包括以下幾種：一是超速離心法，這是目前外泌體提取最常用的方法；此種方法得到的外泌體量多，但是純度不足；二是過濾離心，這種操作方法不影響外泌體的生物活性，但同樣存在純度不足的問題；三是密度梯度離心法，用此種方法分離到的外泌體純度高，但是前期準備工作繁雜，耗時，量少；四是免疫磁珠法，這種方法可以保證外泌體形態的完整，特異性高、操作簡單、不需要昂貴的儀器設備，但是非中性pH和非生理性鹽濃度會影響外泌體生物活性，不便進行后續的實驗；五是PS親和法，該方法將PS(磷脂酰絲氨酸)與磁珠結合，利用親和原理捕獲外泌體囊泡外的PS。該方法與免疫磁珠法相似，獲得的外泌體形態完整，純度最高。由于不使用變性劑，不影響外泌體的生物活性，該方法獲得的外泌體可用于細胞共培養和體內注射。外泌體在心血管與代謝性疾病中都發揮重要作用。外泌體由于具有調節復雜細胞內通路的特性使其在許多疾病的治療控制方面具有潛在的用途，可以用于免疫調節、抗原呈遞和組織修復等方向的治療。外泌體上的分子標記使其成為用于疾病診斷和預后監測的有效液體活檢指標。隨著對外泌體的深入了解，其臨床應用越來越受到關注。

2 外泌體在急性心肌梗死中的診斷價值

高敏肌鈣蛋白目前是診斷心肌梗死的標準生物標志物，但是受年齡、性別、有無胸痛發作、腎功能水平的影響，在心力衰竭、應激性心肌病、大量肺栓塞或肺動脈高壓、嚴重急性中樞神經系統疾病等疾病，甚至劇烈運動情況下也可能升高。人們發現外泌體能夠作為檢測惡性腫瘤的潛在標志物[3]，而外泌體作為AMI生物標記物具有很大的診斷潛力，我們著重關注外泌體所攜帶的miRNAs和蛋白的診斷價值。

血清和血漿中發現的miRNAs具有穩定性、時間和組織特異性的特征，而外泌體作為miRNAs有效運載體，可能為急性心肌梗死患者的診斷提供一種新的可能。從心肌梗死患者血清中分離的外泌體包含miR-183，研究[4]證實miR-183水平與心肌缺血損傷程度為正相關，是一種新的心肌梗死診斷的生物標志物。miR-30a在急性心肌梗死患者血清的外泌體中高度富集，并通過外泌體在缺氧心肌細胞間有效轉移[5]，這提示外泌體做為運載工具有很好的保護miRNAs的能力。值得關注的是外泌體來源的miRNAs也可以在尿液中檢測到，急性心肌梗死大鼠外泌體相關的miR-1在血液和尿液中均出現特異性升高[6]，這提示檢測尿液種的外泌體可能成為急性心肌梗死新的診斷方法，而提取尿液的無創性可能會大大提高心肌梗死的診斷率具有很好的臨床應用前景。在心肌梗死的診斷、評估中不可以忽視外泌體特異性選擇攜帶蛋白的潛在價值。心肌梗死和非心肌梗死患者的血漿外泌體行蛋白質組學分析后發現，心?；颊叩难獫{外泌體中有252種蛋白為顯著差異表達蛋白，并證實外泌體C1QA、C5、APOD、APOC3、GP1BA、PPBP可能為一組新的心肌損傷的標志物[7]。

3 外泌體對急性心肌梗死患者預后的影響

患者急性心肌梗死后存活的心臟組織驟減，隨著病情的發展會出現心臟泵血功能下降，最終可能出現充血性心力衰竭。在心肌梗死病程中，多種類型的心臟細胞會釋放外泌體入血，這些外泌體參與心臟細胞的信息交流并傳遞有效物質，對心肌梗死患者的預后產生影響，值得注意的是miRNAs在外泌體介導反應中的重要地位。

心肌細胞來源的外泌體對于急性心肌梗死可以起到調節炎癥、調節自噬、抑制細胞凋亡的作用。急性心肌梗死過程中來源于心肌細胞的外泌體的生成出現一過性增加，聚集在缺血心肌中的外泌體會被浸潤的單核細胞迅速吸收，最終調節了局部的炎癥反應[8]。人誘導多能干細胞來源的心肌細胞(hiPSC-CM)在心肌梗死中的積極作用則離不開其分泌的外泌體能夠促進血管內皮細胞的生成[9]，還可通過調節缺氧心肌細胞的自噬來改善心肌梗死后的心功能，為缺血性心肌病提供無細胞特異性治療[10]。心肌細胞所分泌的miRNAs的有效轉運離不開外泌體這個有效通訊介質，如miR-92a以外泌體運載的形式轉移到成纖維細胞中有助于心肌成纖維細胞的激活[11]。

間充質干細胞(MSCs)因為其容易擴散分離、免疫原性低而且有轉化成多譜系的潛能，成為改善心肌梗死預后方面的研究熱點，而MSCs分泌的外泌體在影響心梗的預后方面也越來越被重視。不同來源的MSCs如骨髓間充質干細胞、脂肪組織來源間充質干細胞、臍帶血來源間充質干細胞分泌的外泌體都有較積極的報道，比如通過促進血管形成，抑制炎癥反應，減少梗死面積，改善心臟收縮和舒張能力，以減少心肌梗死帶來的心肌組織缺血性的損傷。MSCs來源的外泌體在體內體外均能把M1促炎型巨噬細胞轉化為M2抗炎型巨噬細胞[12]。MSCs分泌的外泌體包含miR-125b-5p可以有效調節自噬水平來保護心肌[13]，也可以抑制促凋亡靶基因，從而抑制缺氧缺糖誘導的心肌細胞凋亡[14]。

經過修飾的干細胞外泌體或經人工合成的外泌體是治療心肌梗死的新手段，外泌體可以幫助miRNA轉運入靶細胞并延長miRNs的生物半衰期，心球細胞(CDCs)、心臟祖細胞(CPCs)、肪組織來源的基質細胞(ADSCs)都可能成為新的治療工具。CDCs是較為被認可的心臟保護以及修復的一類干細胞，心肌內注射CDCs源性干細胞外泌體在急性心肌梗死的豬模型中已經有了較好的試驗成果，通過開胸心肌內注射CDCs源性干細胞外泌體，心肌梗死面積下降并維護了左室射血分數[15]。CPCs來源的外泌體直接注射到缺血心臟因為轉運內源性抗凋亡miRNAs可減少急性缺血再灌注損傷[16]。研究CPCs來源外泌體轉染了miR-322可以加強原外泌體的血管生成作用[17]。ADSCs分泌的外泌體經過miR-146a的修飾可通過下調早期生長反應因子1(EGR1)來減弱急性心肌梗死誘導的心肌損傷[18]。

然而外泌體對于急性心肌梗死的預后影響不是只有積極的方面，關于外泌體對急性心肌梗死不良影響的研究還不夠深入全面。有研究[19]證實，心肌梗死所激活的巨噬細胞分泌的外泌體富集miR-155，并通過外泌體被轉移到心臟的成纖維細胞中，抑制了心臟成纖維細胞的增值并促進了炎癥。

4 存在問題與展望

外泌體具有很好的臨床應用前景，缺乏被大家普遍接受的分離方法是最急需解決的問題。經典的外泌體分離方法是超速離心，其重復性高，獲得的外泌體量大，但是對技術和設備的要求高且分離時間長；外泌體分離商業化試劑盒的運用增多，其需要樣本量小，操作簡單且時間消耗少，較易重復，但靈敏度和特異性較低。除此之外外泌體提取價格昂貴，提取后有存在雜質的風險需經過較為復雜的外泌體鑒定，總的來說缺乏較為成熟的臨床應用平臺。未來需要開發出高純度、高通量、高回收率的外泌體分離方法和快速、高靈敏度、高特異性的外泌體檢測技術，這將大大推動外泌體的臨床應用。

敏感性與特異性是判斷疾病診斷標志物是否合格的關鍵點，外泌體診斷急性心肌梗死需要比較外泌體生物標志物與現臨床常規應用指標，需要完善的大型隨機對照試驗。另外隨著“組學”技術的發展，應重視對于外泌體的生物內容物及表征識別的開發。外泌體對急性心肌梗死的預后作用，目前研究多傾向于外泌體可以改善預后，這提供了對急性心肌梗死新的認知層面，并一定程度上提示了未來可能更好的治療方式?，F有研究多為細胞實驗或動物實驗階段，后期的研究開發還需要更多的技術理論支持。但需要關注的是外泌體的內容物包含有益成分也有有害的成分，另外細胞間的信息交換外泌體只是其中一種運行形式，需要深入研究細胞其它的分泌物。

綜上所述，未來外泌體有可能成為急性心肌梗死新的診斷標志物，實現對急性心肌梗死患者的早期無創性初篩。在急性心肌梗死預后影響方面，外泌體也有許多且積極的研究成果公開發布，這都展示了外泌體很好的應用前景，可能與其穩定性好、靶向性強、有一定級聯效應、沒有導致畸形或導致瘤變的情況以及無倫理學問題相關。