m6A-RNA甲基化在急性髓系白血病中的研究進展

全海薇，張亞麗，王 涵，鄒雨彤，程美玉，姜賀然，夏 薇

(北華大學醫學技術學院，吉林 吉林 132013)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一種由于造血干/祖細胞累積各種獲得性遺傳畸變，導致血細胞發生生長/分化改變的惡性克隆性疾病[1]。由于AML發病機制的復雜性、異質性，目前仍然不能在分類系統上得到完全反映，AML的發病機制、分類及診斷治療面臨著研究瓶頸[2]。近年“表觀轉錄組學”的建立，為AML的診治提供了新的研究方向?！氨碛^轉錄組學”是在RNA水平上發現的一種新興基因表達調控方式。在RNA的化學修飾中N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)修飾是真核生物mRNAs和lncRNA最常見的轉錄后修飾。在此背景下，首次在AML中發現了m6A沉積并直接參與癌癥發生。m6A修飾的可逆性和動態性以及其微調和協調基因表達程序的能力，對白血病細胞分化、發育和AML的臨床診治產生巨大貢獻[3]。本文綜述了m6A-RNA甲基化修飾在AML中的作用，并為小分子藥物靶向治療AML提供新思路。

1 m6A-RNA甲基化概述

RNA形態功能多樣性是以RNA的四個典型堿基進行大量修飾為基礎。自20世紀60年代以來，已經發現了150多種RNA的化學修飾[4]。其中m6A修飾即腺苷殘基的N-6位置添加甲基是真核生物最常見的轉錄后修飾。m6A修飾由甲基化轉移酶(writers)、去甲基轉移酶(erasers)、甲基化相關閱讀蛋白(readers)以及可能影響這些調節的其他蛋白動態控制。m6A修飾影響mRNA剪接、核輸出、穩定性和翻譯等不同階段，在基因表達中發揮關鍵作用[3]。

Writers包括甲基轉移酶樣蛋白3(methyltransferase-like 3，METTL3)、甲基轉移酶樣蛋白14(methyltransferase-like 14,METTL14)以及m6A-METTL相關復合物(MACOM)。MACOM復合物由腫瘤相關蛋白(WTAP)、RNA結合基序15(RBM15)、Vir樣m6A甲基轉移酶(VIRMA，也稱KIAA1429)、Cbl原癌基因1(CBLL1)和鋅指蛋白ZC3H13等多種蛋白質組成。在體內，METTL3-METTL14二聚體活性受MACOM調節。MACOM中的RBM15及其類似物RBM15B通過與WTAP結合，協助WTAP與METTL3-METTL14二聚體結合，招募METTL3-METTL14至核小斑對底物進行修飾[5-6]。在轉錄過程中，METTL3和METTL14誘導m6A沉積在內含子區域新生RNA上[7]，完成mRNA剪接。沉默METTL3可減緩mRNA核輸出。

在真核細胞中，erasers包括脂肪和肥胖相關蛋白(fat-mass and obesity associated protein，FTO)和Alk B同源物5(Alk B homolog 5，ALKBH5)，二者均屬于AlkBα-戊二酸依賴的雙加氧酶。敲除人源細胞中FTO或ALKBH5均導致m6A水平全面上調。FTO針對多個RNA底物，對不同組織和生物系統有不同的功能。下調ALKBH5可加速mRNA的核輸出[8]。

Readers包括含YTH結構域的蛋白家族、胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白(IGF2BPs)、RNA結合蛋白以及“間接”readers。含YTH結構域的蛋白家族包括YTHDF1[9]、YTHDF2[9]、YTHDF3[9]、YTHDC1[10]和YTHDC2[11]，是一組主要的m6A readers，在mRNA穩定性[12]、mRNA剪接[13]、mRNA結構[14]、mRNA輸出[15]、翻譯效率[16]和miRNA生物發生[17]等方面發揮重要作用。IGF2BPs包括IGF2BP1/2/3，是一類獨特的m6A readers，通過識別GG(m6A)C序列(典型的m6A序列)與目標mRNA靶向結合，提高mRNA的穩定性[18]。此外，“間接”readers HNRNPC、HNRNPG可作為優先結合m6A修飾的RNA結構“開關”。

2 m6A-RNA甲基化在AML中的作用

2.1 METTL3-METTL14復合物在AML中的作用

RNA甲基轉移酶METTL3是復合物中唯一的催化亞基，METTL14在體內與METTL3連接形成穩定的二聚體，在維持復合物完整性、定位靶向mRNA方面起非催化作用[19]。AML是METTL3和METTL14表達水平最高的癌癥之一，與正常造血祖細胞相比，AML細胞中METTL3和METTL14均過度表達[20-21]。METTL3-METTL14甲基化復合物能促進AML的發展并維持原始白血病細胞[20-21]。在AML細胞系和原代母細胞中過表達METTL3和METTL14均可促進增殖，下調則誘導細胞分化和凋亡[20-21]。對AML移植小鼠模型進行全基因組CRISPR/CAS9篩查，結果表明METTL3、METTL14和METTL16是影響AML生存的關鍵基因[21]。

在AML細胞中，METTL3和METTL14主要結合到轉錄起始位點，早期的m6A共轉錄沉積促進與AML增殖相關的mRNA的翻譯，如c-MYC、BCL2、PTEN、SP1和MYB[20-21]。METTL14通過SPI1-METTL14-MYB/MYC信號軸調節骨髓生成和白血病發生[20]，髓系轉錄調控子SPI1負調控METTL14，使其誘導m6A修飾致癌基因MYB和MYC，從而抑制AML細胞分化、促進細胞自我更新。轉錄因子CEBPZ(CCAAT增強子結合蛋白)是AML中的一個新的突變基因[22]，可在基因啟動子上招募METTL3[21]，提示AML中METTL3的共轉錄招募下降。研究表明在AML中，METTL3異位于細胞質，與負責翻譯的核糖體互相作用[23]。胞質中的METTL3可以促進特定mRNA(如癌基因EGFR和TAZ)的翻譯，而不依賴于METTL3自身的催化活性[23-24]。此外，較高水平的胞質METTL3導致WTAP蛋白水平隨之增加[23]，維持WTAP蛋白在AML中的致癌作用。

2.2 WTAP在AML中的作用

Wilms腫瘤1(WT1)基因在白血病的發生中具有致癌作用，其過度表達與不良預后相關[25]。WTAP與WT1配對，調節靜止和增殖之間的平衡。研究發現WTAP蛋白在AML中上調。下調AML細胞系中WTAP，可抑制細胞增殖，誘導凋亡，延緩白血病病程[26]。另外，WTAP在RNA代謝的表觀轉錄調控中可作為m6A甲基轉移酶復合體中的一個調節亞單位來發揮作用[27]。

2.3 RBM15在AML中的作用

部分急性巨核細胞白血病(AMKL)患者常產生染色體異位，攜帶融合癌基因RBM15-MKL1[28]。RBM15可直接結合并控制巨核生成基因GATA1、RUNX1、TAL1和c-MPL的pre-mRNA選擇性剪接[29]。蛋白精氨酸甲基轉移酶1(PRMT1)在AMKL細胞系中的過表達可下調RBM15蛋白水平，影響RNA的剪切，從而阻遏巨核細胞的終末分化[29]。敲除RBM15可導致B細胞分化、髓系和巨核細胞擴張受阻[30]。靶向PRMT1可能是恢復AMKL巨核細胞分化的一種根治療法。

2.4 FTO在AML中的作用

已有報道，在攜帶MLL-AF9、PML-RARA和FTL3-ITD易位的AML亞型中FTO表達升高[31]。R-2-羥基戊二酸(R-2HG)在體內、外通過抑制白血病細胞的增殖、促進細胞周期阻滯和凋亡而發揮廣泛的抗白血病活性。R-2HG可通過抑制FTO高表達，靶向FTO-m6A-MYC/CEBPA信號軸，下調MYC和CEBPA表達，從而發揮抗腫瘤作用[32]。在癌細胞系中進行的大規?；蚯贸Y查顯示，白血病細胞不存在普遍的FTO依賴[33]，FTO在m6A修飾中的去甲基化作用還存在爭議。

3 m6A-RNA甲基化作為抗癌藥物靶點的研究

參與m6A-RNA甲基化的writers、erasers和readers這三類物質，目前已成為小分子靶向治療AML的潛在靶點。主要針對METTL3-METTL14復合物探索開發新的治療策略和小分子藥物。研究人員獲得了METTL3-METTL14復合物的高分辨率晶體結構，這兩種蛋白都屬于Ⅰ類甲基轉移酶家族[34]，其中METTL3的結合口袋是由Ⅰ類甲基轉移酶家族通用的折疊酶產生的。由此，為設計藥物的結構提供導向：可根據晶體結構利用計算機工具CADD來設計新的抑制劑[35]；也可考慮采用已發現的針對Ⅰ類甲基轉移酶家族成員的有效抑制劑，例如蛋白賴氨酸甲基轉移酶、PRMTs和DNA甲基轉移酶(DNMTs)來治療AML。

METTL3-METTL14復合物催化甲基轉移酶反應，是通過復合物的催化部位與腺苷蛋氨酸(SAM)或S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)結合[35](如METTL3與SAM結合[34])完成的。甲基供體SAM輔因子和甲基受體腺苷底物結合在METTL3[36]的不同位點。已報道的METTL3-METT14抑制劑只有反應產物SAH和核苷酸類似物西那霉素[37]。因此，在構思潛在METTL3-METTL14抑制劑時，可以考慮以核苷酸、SAM或者雙底物配體為靶點。針對核苷酸靶點的藥物，如氮胞苷和地西他濱，可作用于DNMT，已批準用于AML臨床治療之中[38]，但這些藥物的生物利用度差且毒性強。相比之下，與SAM結合的小分子抑制劑有良好的藥理特性和口服生物利用度。目前針對混合型白血病1H3K4甲基轉移酶的MM-401抑制劑[39]、針對套細胞淋巴瘤蛋白精氨酸甲基轉移酶-5的EPZ015666口服抑制劑[40]、組蛋白甲基轉移酶DOT1L抑制劑[41]等治療藥物已進入臨床研究。雙底物抑制劑與SAM和核苷酸抑制劑相比，基于結構層面而言，具有更強的選擇性?？茖W家設計了DNMT3A和DNMT1雙底物抑制劑喹唑啉-喹啉衍生物，其可誘導結腸癌HCT116細胞CDKN2A啟動子去甲基化并于治療7 d后重新激活[42]。這種思路同樣適用于AML的治療中。

隨著人們對轉錄組學研究的逐步深入，發現RNA轉錄水平的改變與多種癌癥密切相關，并在轉移和耐藥中發揮重要作用[43]。已發現AML中m6A修飾的改變可以破壞正常的細胞分化并促進癌癥的發展?？梢灶A見，m6A修飾酶的活性易被化合物靶向，并最終可能在未來的癌癥治療中提供重大創新。