楊桃根活性成分對高糖誘導H9c2心肌細胞損傷的改善作用及機制

高雨桐 吳婭妮 陳銘 張曉琳 韋秀莎 韋曉潔 黃仁彬

摘 要 目的：研究楊桃根活性成分2-十二烷基-6-甲氧基-2，5-二烯-1，4-環己二酮（DMDD）對高糖誘導H9c2 心肌細胞損傷的改善作用及機制。方法：將H9c2 心肌細胞分為正常組、高糖組、滲透壓對照組和DMDD高、中、低濃度組（8、4、2 μmol/L）。正常組和高糖組細胞分別加入低糖（含5.5 mmol/L葡萄糖，下同）、高糖DMEM培養基（含33.3 mmol/L葡萄糖，下同）培養48 h;滲透壓對照組細胞加入含27.5 mmol/L甘露醇的低糖DMEM培養基培養48 h;DMDD各濃度組細胞先加入高糖DMEM培養基培養24 h，再加入含相應濃度DMDD的高糖DMEM培養基繼續培養24 h。各組細胞培養結束后，采用MTT法檢測細胞存活率;采用相應試劑盒檢測細胞上清液中活性氧簇（ROS）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、乳酸脫氫酶（LDH）的活性;采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測細胞上清液中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）的水平;采用吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）染色法檢測細胞凋亡情況;采用Western blot法檢測細胞中凋亡相關蛋白[活化的胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3）、B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）]的表達水平以及核因子κB （NF-κB）/NF-κB抑制蛋白α（IκBα）信號通路相關蛋白（NF-κB p65、IκBα）的磷酸化水平。結果：與正常組比較，高糖組細胞存活率、GSH-Px活性、Bcl-2蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01）; ROS、LDH活性，TNF-α、IL-6水平，Bax、cleaved caspase-3蛋白表達水平和NF-κB p65、 IκBα蛋白磷酸化水平均顯著升高（P<0.01）;細胞呈橙黃色熒光，且形態模糊的細胞明顯增多，表現出明顯的凋亡狀態。滲透壓對照組細胞上述指標與正常組比較差異無統計學意義。與高糖組比較，DMDD各濃度組細胞上述指標活性或水平（低濃度組細胞存活率、LDH活性除外）均顯著逆轉（P<0.05或P<0.01）;細胞中橙黃色熒光明顯減少，細胞形態較完整。結論：DMDD可改善高糖誘導的H9c2心肌細胞損傷;其作用機制可能與抑制氧化應激和炎癥反應、調控凋亡相關蛋白和NF-κB/IκBα通路相關蛋白的表達有關。

關鍵詞 2-十二烷基-6-甲氧基-2，5-二烯-1，4-環己二酮;糖尿病心肌病;H9c2心肌細胞;凋亡;NF-κB/IκBα信號通路

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effects of 2-dodecyl-6-methoxycyclohexa-2，5-diene-1，4-dione （DMDD） from Averrhoa carambola on H9c2 myocardial cell injury induced by high glucose and its mechanism. METHODS： H9c2 myocardial cells were divided into normal group， high glucose group， osmotic pressure control group， DMDD high， medium and low concentration groups （8， 4， 2 μmol/L）. Normal group and high glucose group were treated with low glucose DMEM medium （containing 5.5 mmol/L glucose， similarly hereinafter） and high glucose DMEM medium （containing 33.3 mmol/L glucose， similarly hereinafter） for 48 h， respectively. The cells in osmotic pressure control group were cultured in low glucose DMEM medium containing 27.5 mmol/L mannitol for 48 h. In DMDD groups， cells were cultured in high glucose DMEM medium for 24 h， and then in high glucose DMEM medium containing corresponding concentration of DMDD for 24 h. At the end of cell culture， MTT method was used to detect the cell survival rate. The activities of ROS， GSH-Px and LDH in cell supernatant were detected by using related kits. ELISA assay was used to detect the levels of TNF-α and IL-6 in cell supernatant. Cell apoptosis was detected by acridine orange/ethidium bromide （AO/EB） staining. Western blot assay was used to detect the expression of apoptosis related proteins （cleaved caspase-3， Bcl-2， Bax） and the phosphorylation level of nuclear factor κB （NF-κB）/NF-κB suppressor protein α （IκBα） signaling pathway related proteins （NF-κB p65， IκBα）. RESULTS： Compared with the normal group， survival rate， the activity of GSH-Px and protein expression of Bcl-2 in high glucose groups were decreased significantly （P<0.01）; the activities of ROS and LDH， the levels of TNF-α and IL-6， the protein expression of Bax and cleaved caspase-3， and the phosphorylation level of NF-κB p65 and IκBα were increased significantly （P<0.01）; the cells showed orange yellow fluorescence， and the number of cells with fuzzy morphology increased significantly， showing an obvious apoptotic state. There was no statistical significance in above indexes of osmotic pressure control group compared with normal group. Compared with high glucose group， the activities or levels of above indexes （except for cell survival rate an LDH activity in low concentration group） were reversed significantly in DMDD groups （P<0.05 or P<0.01）; the orange yellow fluorescence in the cells decreased significantly， and the cell morphology was relatively complete. CONCLUSIONS： DMDD can significantly improve H9c2 myocardial cell injury induced by high glucose; the mechanism of which may be associated with suppressing oxidative stress and inflammatory response， regulating the expression of apoptosis related protein and NF-κB/IκBα pathway related protein.

KEYWORDS? ?2-dodecyl-6-methoxycyclohexa-2，5-diene-1，4-dione; Diabetic cardiomyopathy; H9c2 myocardial cell; Apoptosis; NF-κB/IκBα signaling pathway

糖尿病心肌病是一種糖尿病心血管并發癥，由機體糖代謝紊亂引發，可表現出心肌組織結構異常和心功能下降，在疾病末期常伴有充血性心力衰竭和心收縮功能不全，是目前糖尿病患者死亡的主要原因[1]?，F有的研究認為，心肌細胞損傷所致的凋亡是糖尿病心肌病產生的關鍵因素，在整個疾病發生和發展過程中持續存在并扮演重要角色[2]。然而糖尿病心肌病的心肌細胞凋亡發生機制復雜，目前認為其與高糖引起的非酯化脂肪酸累積、活性氧簇（ROS）聚集、炎癥反應及自噬紊亂等有關[3-4] 。因此，研發能有效緩解高糖所致心肌細胞損傷的藥物，對于防治糖尿病心肌病具有十分重要的意義。

2-十二烷基-6-甲氧基-2，5-二烯-1，4-環己二酮（2-dodecyl-6-methoxycyclohexa-2，5-diene-1，4-dione，簡稱為“DMDD”）是本課題組首次從酢漿草科植物楊桃根Averrhoa carambola L.中分離出的一種活性成分[5]，具有降血糖、改善血脂代謝、抗炎、抗氧化和抗腫瘤等藥理作用[6-7]。經本課題組前期預實驗發現，DMDD可明顯改善糖尿病心肌病模型小鼠的心肌損傷，但其具體作用機制尚不明確。相關研究發現，NF-κB通路能調控H9c2心肌細胞的氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡等多個生理或病理過程，進而影響心肌損傷，是治療糖尿病心肌病的潛在靶點[8]?；诖?，本研究以高糖誘導建立H9c2心肌細胞損傷模型，研究DMDD對模型細胞的存活率、氧化應激相關因子[ROS、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、乳酸脫氫酶（LDH）]、炎癥因子[腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）]、凋亡相關蛋白[活化的胱天蛋白酶3（cleaved caspase-3）、B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）]以及核因子κB（NF-κB）/NF-κB抑制蛋白α（IκBα）信號通路相關蛋白（NF-κB p65、IκBα）的影響，以期為DMDD治療糖尿病心肌病提供理論基礎和實驗依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有311型CO2細胞培養箱、Micro CL17R型高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司），1450型生物超凈臺（蘇州凈化設備有限公司），CKX-41型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司），SpectraMaxPlus384型多功能酶標儀（香港分子儀器有限公司），Odysse Clx型雙色紅外熒光成像儀（美國Li-COR公司），Mini PROTEAN?Tetra Cell型電泳槽（美國Bio- Rad公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用DMDD由本實驗室自制，純度不低于80%;低糖DMEM 培養基、胰蛋白酶（批號分別為8120459、2120539）均購自美國Gibco公司;青鏈霉素混合液、磷酸鹽緩沖液（PBS）、MTT試劑（批號分別為20190306、20200804、715F0527）均購自北京索萊寶科技有限公司;胎牛血清（批號A58G00J）購自美國Gemini公司;BCA蛋白濃度檢測試劑盒（批號P0010S）購自上海碧云天生物技術有限公司;兔抗GAPDH多克隆抗體、兔抗cleaved caspase-3多克隆抗體、兔抗Bax多克隆抗體、兔抗Bcl-2多克隆抗體、兔抗IκBα多克隆抗體（批號分別為00083125、00077110、00089105、00093692、00091696）均購自美國Proteintech公司;兔抗NF-κB p65多克隆抗體（批號CN89330）購自南京巴傲得生物科技有限公司;兔抗磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）多克隆抗體、兔抗磷酸化IκBα（p-IκBα）多克隆抗體、DyLightTM 800熒光標記的山羊抗兔免疫球蛋白二抗（批號分別為3033S、2859S、5151）均購自美國Cell Signaling Technology公司;吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）雙熒光染色試劑盒（批號0629A20）購自北京雷根生物技術有限公司;小鼠ROS、IL-6、TNF-α酶聯免疫試驗試劑盒（批號分別為Oct2019、Oct2019、Oct2019）購自上海泛柯實業有限公司;LDH檢測試劑盒、GSH-Px檢測試劑盒（批號分別為20190910、20190905）均購自南京建成生物工程研究所;其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為超純水。

1.3 細胞

本研究所用大鼠H9c2心肌細胞購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。

2 方法

2.1 細胞培養

將大鼠H9c2心肌細胞培養于含10% 胎牛血清和1%青-鏈霉素的低糖DMEM培養基（含5.5 mmol/L葡萄糖，下同）中，置于 37 ℃、5%CO2培養箱中培養至融合度達70%～80%時，以含0.25%乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化并傳代培養，取對數生長期的細胞進行后續實驗。

2.2 分組、造模與給藥

參考文獻[9]的方法，將對數生長期的H9c2心肌細胞分為正常組、高糖組、滲透壓對照組（以考察由高糖引起的滲透壓改變是否會造成細胞損傷）和DMDD高、中、低濃度組（8、4、2 μmol/L，濃度根據本課題組前期研究結果設置）。正常組和高糖組細胞分別加入低糖、高糖（含33.3 mmol/L葡萄糖，下同）DMEM培養基培養48 h;滲透壓對照組細胞加入含27.5 mmol/L甘露醇的低糖DMEM培養基培養48 h;DMDD各濃度組細胞先加入高糖DMEM培養基培養24 h后，再加入含相應濃度DMDD的高糖DMEM培養基繼續培養24 h。

2.3 H9c2心肌細胞存活率的檢測

取對數生長期的H9c2心肌細胞，以5×104 mL-1的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，按“2.2”項下方法分組、造模與給藥，另設不含培養基和細胞的空白組，每組設置3個復孔。各組細胞培養結束后，每孔加入含 10% MTT的低糖DMEM 培養基100 μL，繼續培養4 h;棄去培養基，加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，避光振蕩15 min;采用酶標儀于 490 nm波長下檢測每孔吸光度（OD）值，并計算細胞存活率[細胞存活率（%）=（實驗組OD值-空白組OD值）/（正常組OD值-空白組OD值）×100%]。

2.4 H9c2心肌細胞上清液中ROS、GSH-Px和LDH活性的檢測

取對數生長期的H9c2心肌細胞，以5×104 mL-1的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，按“2.2”項下方法分組、造模與給藥，每組設置3個復孔。各組細胞培養結束后，收集培養液，于4 ℃條件下以3 000 r/min離心10 min;取上清液，按相應試劑盒說明書方法操作，然后采用酶標儀分別于450、412、450 nm波長下，檢測細胞上清液中ROS、GSH-Px、LDH的活性。

2.5 H9c2心肌細胞上清液中TNF-α和IL-6水平的檢測

采用ELISA法進行檢測。取對數生長期的H9c2心肌細胞，以5×104 mL-1的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，按“2.2”項下分組、造模與給藥，每組設置3個復孔。各組細胞培養結束后，收集培養液，于4 ℃條件下以3 000 r/min離心10 min;取上清液，按相應試劑盒說明書方法操作，采用酶標儀于450 nm波長下，檢測細胞上清液中TNF-α和IL-6的水平。

2.6 H9c2心肌細胞凋亡情況的檢測

采用AO/EB染色法進行檢測。取對數生長期的H9c2心肌細胞，以1×105 mL-1的密度接種于6孔板中，每孔1 mL，按“2.2”項下方法分組、造模與給藥，每組設3個復孔。各組細胞培養結束后，按試劑盒說明書相關方法染色5 min，然后采用熒光顯微鏡觀察各組細胞的凋亡情況（AO能透過正常細胞的細胞膜，從而嵌入細胞核使細胞呈綠色熒光;EB僅能透過受損細胞的細胞膜，從而嵌入細胞核使細胞呈橘紅色熒光）。

2.7 H9c2心肌細胞中凋亡相關蛋白表達和NF-κB/IκBα通路相關蛋白磷酸化水平的檢測

采用Western blot法進行檢測。將對數生長期的H9c2心肌細胞，接種到直徑為70 mm的培養皿中，待細胞生長至融合度達80% 時，按“2.2”項下方法分組、造模與給藥。各組細胞培養結束后，棄去培養液，以PBS 洗滌3次，加入裂解液于冰上充分裂解細胞15 min后，于4 ℃條件下以 12 000 r/min離心15 min;收集上清液，采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度。蛋白經變性處理后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉膜;以TBST緩沖液清洗5 min×3次，加入cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα、GAPDH的一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），于4 ℃條件下孵育過夜;以 TBST 洗滌5 min×3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 5 000），室溫孵育1 h，置于雙紅外熒光成像儀中成像。采用Image J 1.8.0軟件進行分析，以p-NF-κB p65與NF-κB p65的蛋白灰度值比值、p-IκBα與IκBα的蛋白灰度值比值分別表示NF-κB p65、IκBα蛋白的磷酸化水平，以Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3與內參GADPH的蛋白灰度值比值表示3種蛋白的表達水平。實驗重復3次。

2.8 統計學方法

采用SPSS 17.0 軟件對數據進行統計分析，結果以x±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 DMDD對高糖誘導的H9c2心肌細胞存活率的影響

與正常組比較，高糖組細胞存活率顯著降低（P<0.01），滲透壓對照組細胞存活率差異無統計學意義（P>0.05）;與高糖組比較，DMDD高、中濃度組細胞存活率均顯著升高（P<0.01），詳見表1。

注：與正常組比較，**P<0.01;與高糖組比較，##P<0.01

Note：vs. normal group，**P<0.01; vs. high glucose group，##P<0.01

3.2 DMDD對高糖誘導的H9c2心肌細胞上清液中ROS、GSH-Px和LDH活性的影響

與正常組比較，高糖組細胞上清液中ROS、LDH活性均顯著升高，GSH-Px活性顯著降低（P<0.01），而滲透壓對照組細胞上清液中上述指標活性差異無統計學意義（P>0.05）;與高糖組比較，DMDD各濃度組細胞上清液中ROS、LDH（低濃度組除外）活性顯著降低（P<0.05或P<0.01），GSH-Px活性均顯著升高（P<0.01），詳見表2。

注：與正常組比較，**P<0.01;與高糖組比較，#P<0.05，##P<0.01

Note：vs. normal group，**P<0.01; vs. high glucose group，#P<0.05，##P<0.01

3.3 DMDD對高糖誘導的H9c2心肌細胞上清液中TNF-α和IL-6水平的影響

與正常組比較，高糖組細胞上清液中TNF-α和IL-6水平均顯著升高（P<0.01），滲透壓對照組上述指標水平差異無統計學意義（P>0.05）;與高糖組比較，DMDD各濃度組細胞上清液中TNF-α和IL-6水平均顯著降低（P<0.01），詳見表3。

3.4 DMDD對高糖誘導的H9c2心肌細胞凋亡的影響

正常組細胞的細胞膜光滑，細胞核完整;高糖組細胞呈橙黃色熒光，且形態模糊的細胞較正常組明顯增多，表現出明顯的凋亡狀態;滲透壓對照組細胞無明顯的凋亡狀態;DMDD各濃度組細胞的橙黃色熒光較高糖組明顯減弱，且細胞形態較完整，詳見圖1。

3.5 DMDD對高糖誘導的H9c2心肌細胞中凋亡相關蛋白和NF-κB/IκBα通路相關蛋白表達的影響

與正常組比較，高糖組細胞中Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（P<0.01），Bax、cleaved caspase-3蛋白表達水平和NF-κB p65、IκBα蛋白磷酸化水平均顯著升高（P<0.01），而滲透壓對照組上述蛋白表達水平或磷酸化水平差異無統計學意義（P>0.05）;與高糖組比較，DMDD各濃度組細胞中Bcl-2蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），Bax、cleaved caspase-3蛋白表達水平和NF-κB p65、IκBα蛋白磷酸化水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖2、圖3、表4。

4 討論

氧化應激和炎癥反應均是糖尿病心肌病產生、惡化的關鍵因素;氧化應激是由于ROS的過度生成和（或）清除減少，導致機體內的ROS相對過剩;當糖尿病患者體內的ROS長期過量時，會誘發DNA、蛋白質、脂質等生物大分子損傷，進而引起心臟炎癥、心肌肥厚及心血管功能的病變，從而誘導糖尿病心肌病的發生[10-11]。有研究表明，ROS活性的升高在高糖誘導的H9c2心肌細胞的凋亡過程中具有重要作用[12]。GSH-Px是機體的清除劑，能特異性地清除過氧自由基、超氧陰離子等，從而減輕ROS造成的損傷[13]。LDH主要存在于細胞內，當細胞受損時，LDH會泄漏至細胞外，故可作為反映細胞損傷程度的指標[7]。本研究發現，DMDD可顯著降低高糖誘導的H9c2心肌細胞上清液中ROS、LDH的活性，升高GSH-Px的活性。這表明DMDD對高糖誘導的H9c2心肌細胞損傷的改善作用，可能與抑制氧化應激反應有關。

相關研究發現，促炎因子IL-6和TNF-α在糖尿病心肌病的發病機制中也具有重要的作用[8， 14]。當糖尿病患者體內TNF-α水平升高時，可損害其胰島素信號傳導功能和心肌功能;當TNF-α水平降低時，可減輕心肌炎癥和心肌纖維化程度，進而改善心功能[14]。另有研究發現，當糖尿病模型小鼠體內IL-6水平降低時，其心功能改善、間質纖維化減輕[15]。本研究發現，DMDD可降低高糖誘導的H9c2心肌細胞上清液中IL-6、TNF-α水平。這表明DMDD對高糖誘導的H9c2心肌細胞損傷的改善作用，可能與抑制炎癥因子表達有關。

促凋亡因子caspase-3在細胞凋亡途徑中發揮著至關重要的作用：當細胞凋亡發生時，凋亡信號通過級聯反應匯聚于caspase-3酶原，然后使該酶原發生裂解、活化，從而獲得凋亡執行能力[16]。另外，凋亡的發生也與Bcl-2蛋白家族密切相關，其中Bcl-2、Bax之間的動態平衡是界定細胞凋亡發生的重要指標[17-18]。本研究發現，DMDD可升高高糖誘導的H9c2心肌細胞中cleaved caspase-3、Bax蛋白的表達水平，降低Bcl-2蛋白的表達水平。這表明DMDD對高糖誘導的H9c2心肌細胞損傷的改善作用，可能與調控凋亡相關蛋白的表達有關。

NF-κB是一種核轉錄因子，當機體發生應激、炎癥時均可將其激活;IκB蛋白家族是NF-κB的抑制蛋白，當細胞處于靜息狀態時，細胞質中NF-κB 的p65亞基或p50亞基會與IκB結合，從而在細胞質中形成多聚體復合物，使NF-κB蛋白活性受到抑制;當細胞受到刺激時，IκBα被蛋白酶降解，使得NF-κB與IκB形成的多聚體逐漸解離，最終激活NF-κB信號通路[9，19]。本研究發現，與正常組比較，高糖組H9c2心肌細胞中NF-κB p65、IκBα蛋白的磷酸化水平均顯著升高，說明NF-κB/IκBα通路被激活;經DMDD干預后，H9c2心肌細胞中NF-κB p65、IκBα蛋白的磷酸化水平均顯著降低。這表明DMDD對高糖誘導的H9c2心肌細胞損傷的改善作用，可能與抑制NF-κB/IκBα通路相關蛋白的表達有關。

綜上所述，DMDD可改善高糖誘導的H9c2心肌細胞損傷;其作用機制可能與抑制氧化應激和炎癥反應、調控凋亡相關蛋白和NF-κB/IκBα通路相關蛋白的表達有關。

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（收稿日期：2021-02-24 修回日期：2021-05-06）

（編輯：唐曉蓮）