TLR4基因多態性及IL-6表達水平與慢性腎盂腎炎表型特征的相關性研究

韓 晶,黃鳳麗

小兒腎盂腎炎是最常見的泌尿系統傳染性炎性疾病，具有較高的急性發病率和長期腎臟損害，在腎臟間質參與炎癥過程中，患兒的腎硬化風險極高，極易造成腎功能下降及早期殘疾[1-3]。因此，為改善腎盂腎炎患兒的生活質量，急需發現特異性指標以實現腎盂腎炎的早期診治。本研究通過探討Toll樣受體-4(TLR4)基因多態性與慢性腎盂腎炎表型特征及IL-6表達的相關性，以期發現腎盂腎炎的特異性指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集2018年1月-2019年12月于本院小兒科住院治療的60例加重期慢性腎盂腎炎患兒作為觀察組，同期納入95例健康兒童作為對照組，均進行臨床及實驗室檢查。收集2組患兒的一般資料并進行統計學分析，差異無統計學意義(P>0.05)。

1.1.1 納入標準：符合慢性腎盂腎炎相關性診斷標準[4]，并經X線、尿培養、尿常規及腎功能檢查等確診者；所有患者或其監護人均簽署知情同意書；獲得醫院倫理委員會批準。

1.1.2 排除標準：合并嚴重心腦血管疾病者；理解或認知功能障礙者；肝腎功能嚴重損失者；接受相關免疫藥物治療者；患尿道綜合征者；先天泌尿系畸形者；先天性免疫缺陷者。

1.2 方法

1.2.1 TLR4基因多態性檢測：采集所有研究對象周圍靜脈血作為研究標本，從肘靜脈取樣到帶有EDTA的無菌真空容器中，再與“ Dna-express”試劑一起引入eppendorf。使用寡核苷酸引物通過聚合酶鏈反應(PCR)(試劑盒購自Thermo公司)進行Asp299Gly多態性部分的遺傳分型。使用Tertsyk進行擴增。用PCR擴增TLR4基因的Asp299Gly多態性片段(上游：5′-GATTAGCATACTTAGACTACTACCTCCATG-3′；下游：5′-GATCAACTTCTGAAAAAGCATTCCCAC-3′)。25 μl反應混合物包含2.5 μl 10×Buf用于擴增， 2 mM氯化鎂，dNTP為0.2 mM，2.5個單位的DNA聚合酶標簽，20-50 ng基因組DNA， 66 ng Asp299Gly引物。

1.2.2 IL-6表達水平檢測：研究對象血清中IL-6含量的測定通過酶聯免疫吸附(ELISA，Thermo公司)試劑盒檢測。使用從肘靜脈到無菌真空容器中取樣的外周靜脈血作為研究材料。治療前和治療結束時對IL-6濃度進行了兩次分析。

1.2.3 常規指標檢測：使用常規方法對所有研究對象進行一般的臨床和實驗室以及生化指標檢測。腎小球濾過率(GFR)=48.4×身高(cm)/血液中肌酐含量(μmol/ L)，并校正了年齡和性別系數。尿液的細菌學研究包括檢測微生物劑及其對抗菌和化學治療劑的敏感性以及分子生物學研究[5](聚合酶鏈反應檢測沙眼衣原體、解脲支原體、人支原體，研究材料為從尿道上皮刮擦的上皮細胞)，86.7%的患病兒童在處方抗菌治療之前進行過治療。

1.3 統計學方法：使用SPSS 22.0統計軟件，使用標準χ2檢查數據是否符合Hardy-Weinberg平衡，檢查多形基因座的基因型分布。為了比較研究組之間的等位基因頻率，對自由度等于1的人，使用具有連續性的Yates校正的Pearson準則2，對研究組之間的基因型頻率進行比較。列聯表使用Fischer精確檢驗。為了比較未連接組中變體的頻率，確定95%置信區間(CI)，計算比值比(OR),以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TLR4基因多態性分布情況：在大多數實際健康的兒童中(96.8%)，TLR4基因的AA等位基因AA呈正態分布(基因型為“野生型”)。雜合基因型AG的頻率較低(3.2%)。慢性腎盂腎炎(CP)兒童的雜合子和突變基因型AG和GG的頻率分別為86.7%和11.7%，并顯著高于對照組的參數(χ2=5.78，OR=4.72，CI=1.2～8.56，P<0.05)。CP患兒中，突變等位基因299Gly的頻率比健康兒童高4.4倍(χ2=5.78，P<0.05)。CP患兒的實際平均雜合水平為Asp299Gly(АG)，最低數量(1.6%)是純合子Gly299Gly(GG)。

2.2 TLR4基因多態性與慢性腎盂腎炎表型特征的相關性：有TLR4基因多態性位點的Gly/Gly或Asp/Gly基因型的患病兒童與“野生”基因型攜帶者相比，CP的早期表現風險(χ2=15.2,P<0.05)、長期復發形成的風險、泌尿綜合征(χ2=4.0,P<0.05)和病情不穩定性(χ2=8.0,P<0.05)顯著更高。突變基因299Gly攜帶者的平均復發頻率為每年(3.8±0.2)次，而“野生基因型”兒童的復發次數較低，每年(1.1±0.2)次。血液中紅細胞沉降率和帶狀中性粒細胞降低(分別為1.6倍和2倍)。有白細胞減少癥(χ2=14.9,P<0.05)和感覺減退癥(χ2=14.7,P<0.05)。具有TLR4基因多態性基因位點的Gly/Gly或Asp/Gly基因型的兒童中，尿液中的白細胞數量超過沒有這些基因多態性的兒童近30倍，并高于正常水平(P<0.05)。此類患者在CP加重期間還具有更明顯的腎臟和排泄功能損害，尤其是晝間低脂血癥的減少，相對尿密度的降低和腎小球濾過率下降。299Gly TLR4的存在與解脲支原體和人型支原體之間有相關性(τ=0.58)。與具有“野生”基因型的兒童相比，TLR4基因多態性位點的純合子Gly/Gly和雜合子Asp/Gly患者的解脲支原體和人型支原體檢測頻率分別高11.7和5.9倍(P<0.05)。

2.3 TLR4基因多態性與IL-6表達相關性：在CP患兒中，IL-6的初始平均范圍為(2.49±0.11)pg/ml至(33.35±7.7) pg/ml。CP患兒的IL-6平均值為(10.58±2.40) pg/ml，而健康兒童的平均值為(3.43±0.21) pg/ml，超出對照3.1倍以上(P<0.05)。不同TLR4受體基因型變異的患病兒童組中，與TLR4基因等位基因正常分布的患者相比，基因型AG的IL-6，GG TLR4的水平比相同參數低2.2倍，在緩解期仍然很高(P<0.05)。緩解期患者與TLR4等位基因突變分布(τ=0.74，P<0.05)，疾病頻繁復發(τ=0.86，P<0.05)和尿毒癥延長患者(τ=0.76，P<0.05)直接相關。

3 討論

腎盂腎炎的發生發展及進程除取決于病原體特征外，還取決于個體特征(如患者的免疫反應)，這主要受其遺傳因素影響[6-7]，近年來，隨著分子生物學的發展，從基因層面預測患者的遺傳為預后及病理發展提供了可能。由于TLR4在先天免疫系統防御機制中的重要作用，多項研究發現TLR4基因等位基因的存在會引起泌尿生殖道感染(如衣原體、支原體病、脲原體病、賈德氏菌病、滴蟲)的風險增加[8]?；蚨鄳B性表明，可以從同一基因實現同一蛋白質的多個結構多樣的拷貝，同時，部分拷貝的變體沒有活性或可能具有相反的功能?？刂朴袡C體防御反應的基因差異可以在引入外源藥物的情況下提供不同的炎癥反應過程和特定的免疫反應過程特征，因此對慢性腎盂腎炎患兒單核苷酸替代的流行進行研究極為關鍵。

本研究結果表明，CP患兒TLR4多態性位點的雜合和純合突變基因型AG和GG的頻率與對照組相比顯著增高。與“野生”基因型攜帶者相比，腎盂腎炎患兒中TLR4基因突變等位基因299Gly的存在與疾病的復發、病情不穩定、機體炎癥反應的降低顯著相關，CP急性加重期間尿道綜合征持續時間延長，腎臟的濃度和排泄功能明顯受損(P<0.05)。在患有慢性腎盂腎炎的患病兒童中，Asp299Gly，Gly299Gly TLR4基因的多態性與某些微生物有關。特別是與具有“野生”基因型的兒童相比，TLR4基因多態性位點的純合子Gly/Gly和雜合子Asp/Gly的患者中解脲支原體和人型支原體的檢出率增高了11.7和5.9倍。

在存在某些遺傳先決條件的情況下，慢性腎盂腎病的患兒長期形成的IL-6反映了炎癥過程的穩定活動[9]，通過基因組中TLR4突變等位基因299Gly的存在與水平升高之間的直接相關性證明病情加重或緩解期患病兒童白細胞介素6的水平(P<0.05)。同時，在患兒泌尿系統下部檢測到解脲支原體和人型支原體，伴有促炎細胞因子濃度的升高(P<0.05)。