豆腐果苷對脂多糖誘導的豬小腸上皮細胞損傷分析

石樂天，陳勇臻，郭騰達，劉金鑠，張光輝，陳鵬舉

(1.河南農業大學動物醫學院，鄭州 450002；2.焦作工學院，河南焦作，454000；3.河南省現代中獸醫研究院，鄭州 450002；4. 山東鑫德慧生物科技有限公司，山東鄆城 274700)

0 引 言

【研究意義】豬小腸是動物機體中直接參與消化、吸收、轉運的器官，可直接與腸道內部微生物及其產物直接接觸。腸道黏膜是抵抗病原微生物入侵的第一道防線，而腸上皮細胞是腸道黏膜屏障的重要組成部分，其位于機體與腸腔內環境的交界處，保護腸道免受損傷。在機體機能正常的情況下，腸上皮細胞處于一種穩定的環境下，而當機體處于不佳的情況下時，腸上皮細胞受到損傷，容易產生嚴重的氧化應激和炎性反應[1]。有效保護腸上皮細胞免受損傷對提高仔豬機體免疫有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，可以產生并釋放內毒素，容易引起斷奶仔豬腹瀉和水腫等疾病，對腸道損傷嚴重[2]。豆腐果苷(4-甲酰苯基-β-D-異吡喃糖苷，HEL)是一種從野生植物龍眼科植物深綠山龍眼的果實中提取的具有鎮痛和抗抑郁作用的活性植物單體，臨床用于治療精神神經癥[3-6]。HEL通過ERK/CREB信號誘導BDNF顯著增加，降低大鼠血清CORT和促炎因子的表達，改善抑郁樣行為[7-9]?！颈狙芯壳腥朦c】有研究表明，黃芪多糖和橙皮苷等對豬小腸上皮細胞炎性損傷有保護作用[10，11]，但豆腐果苷豬腸上皮細胞的作用機制還未有報道。為了提高仔豬腸上皮細胞對損傷的抵抗能力，改善氧化及炎性損傷所引起的不良反應，需要不斷提高或改善對損傷的抵抗能力?！緮M解決的關鍵問題】試驗分為5組，對照組、LPS組、HEL(25、50和100 μM)+LPS組，研究HEL對細胞炎癥及氧化損傷的影響，并確定潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材 料

豬空腸上皮細胞(IPEC-J2)在含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養基中于37℃和5% CO2的培養箱中培養。

對照組，LPS組，HEL(上海，源葉)(25、50和100μM)+LPS組。IPEC-J2細胞接種于6孔板中，密度為2×103細胞/孔，等細胞密度達到70%～80%后，將HEL按不同劑量添加到細胞中預培養1 h，用2 μg/mL的LPS刺激細胞12 h。12 h后收集細胞進行實驗處理。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

將細胞按密度1×103細胞/孔接種在96孔板中，每組設3個重復，HEL(25、50和100 μM)和LPS(2 μg/mL)分別刺激細胞12 h，等處理時間結束后，將舊培養液除去，更換含有10%CCK-8試劑的DMEM培養液，2 h后用酶標儀(Thermo公司)在450 nm處測量各孔的吸光值。

1.2.2 qRT-PCR

用trizol提取細胞中總RNA，根據反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，用SYBR Green 染料法進行TNF-α、IL-1β和IL-6的測定，通過公式2-ΔΔCt計算其各自的表達量。表1

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.3 抗氧化酶及氧化產物的檢測

取細胞樣品，按試劑盒說明書(南京，建成)測定丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。

1.2.4 ELISA

使用ELISA試劑盒(Bio-Swamp)將收集的細胞上清液用于定量TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表達水平的測定。每組設3個重復，使用酶標儀在450 nm下測定每孔的吸光值，并通過標準曲線計算TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度。

1.3 數據處理

采用GraphPad Prism 6.0進行統計分析，各組數據以Means±SEM的形式表示，并用Student's t test、Two-way ANOVA分析各組數據之間差異性，#P<0.05表示與對照組相比差異顯著，*P<0.05表示與LPS組相比差異顯著。

2 結果與分析

2.1 HEL和LPS對細胞毒性的影響

研究表明，HEL不同劑量組和LPS對IPEC-J2細胞無毒性作用。圖1

圖1 HEL和LPS細胞毒性變化Fig.1 Effects of Hel and LPS on the cytotoxicity of IPEC-J2 cells

2.2 HEL對炎性因子表達水平的影響

研究表明，LPS會顯著升高TNF-α、IL-β和IL-6的表達水平，而HEL會顯著降低LPS所刺激的TNF-α、IL-β和IL-6的表達水平。圖2

圖2 不同添加劑量HEL下TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平變化Fig.2 Effect of HEL on the expression of inflammatory factors

2.3 HEL對抗氧化酶及氧化產物的影響

研究表明，LPS會顯著降低抗氧化酶SOD和CAT的活性，而HEL則會顯著增高LPS所引起的SOD和CAT的活性。LPS會升高氧化產物MDA的活性，HEL會顯著降低LPS所引起的MDA的活性。圖3

圖3 不同添加劑量HEL下SOD，CAT和MDA變化Fig.3 Effect of HEL on SOD, CAT and MDA

2.4 HEL對炎性及氧化相關蛋白的影響

研究表明，LPS會顯著提高Nrf2和HO-1蛋白的表達量，而與LPS組相比，HEL治療組中Nrf2和HO-1蛋白的表達量會進一步升高。與LPS組相比，HEL治療組會顯著降低TNF-α、IL-β和IL-6蛋白的表達水平。圖4

圖4 不同添加劑量HEL下TNF-α、IL-1β、IL-6、Nrf2和HO-1蛋白變化Fig.4 Effects of HEL on TNF-α, IL-1 β, IL-6, Nrf2 and HO-1 proteins

3 討 論

LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁中的一種成分，是內毒素的一種，是一種典型的腸毒素，對宿主具有毒性作用，常用于細胞氧化應激及炎癥模型的建立[10,11]。LPS誘導引起的急性肺損傷，探討Ficolin A通過激活補體對急性肺損傷的保護作用；LPS誘導大鼠炎癥和氧化應激引起的認知障礙，分析維生素D3在這過程中所發揮的作用機制[12]。腸道通透性的改變可能是LPS外周循環轉運的潛在觸發因素[13]。LPS參與細胞或機體多種模型的建立，試驗成功構建LPS引起的細胞氧化及炎性損傷模型以進一步探討相關機制。

Nrf2是細胞氧化應激反應中的關鍵因子，是調控機體細胞、組織及器官中氧化還原平衡的主要組成部分，受Keap1的調控，當Nrf2被激活后會入核，進而與ARE結合，啟動下游一系列解毒和抗氧化因子和蛋白的表達(如HO-1)[14,15]。HO-1又稱為熱休克蛋白，可以被多種刺激激活，如氧化損傷等，其表達對細胞具有較強的保護作用。試驗研究發現，HEL對LPS所引起的氧化損傷具有保護作用。Nrf2和HO-1蛋白的活化會進一步引起一些列抗氧化酶及氧化產物的變化，會抗氧化酶SOD和CAT的活性，降低抗氧化產物MDA的含量，增強對細胞的保護作用，降低氧化應激所引起的損傷。實驗研究發現，LPS組的變化如前論述相似，HEL治療組會顯著降低LPS所引起的Nrf2和HO-1蛋白的表達量，會增強SOD和CAT的活性及減弱MDA的含量。HEL會緩解LPS所引起的IPEC-J2細胞的氧化損傷。

炎癥反應需要一個復雜的轉錄程序的激活，這是細胞類型和刺激特異性的，涉及數百個基因的動態調節。在炎癥組織中，免疫系統的實質細胞和浸潤細胞中基因表達都發生了廣泛的變化[18]。在細胞水平上，炎癥的基礎是復雜的基因表達程序的部署，包括數百個基因，并在主要刺激后幾分鐘內被激活[19]。TNF-α、IL-1β和IL-6是常見的參與炎性反應的重要炎性細胞因子。TNF-α、IL-1β和IL-6屬于促炎細胞因子，可促進多種細胞因子和趨化因子的產生，進而開始急性和慢性炎性反應過程。TNF-α、IL-1β和IL-6在炎癥發生的不同階段表達的先后時間不一樣，協同參與炎性反應進程，具有重要的局部和全身免疫效應。研究選擇TNF-α、IL-1β和IL-6三個與炎性反應關系最密切的指標進行觀察，HEL會在mRNA及蛋白水平分別降低TNF-α、IL-1β和IL-6的表達量。Zhang Y等[20]研究發現HEL對炎性反應具有一定的抑制作用，且與我們的研究結果相似。HEL除了用于神經衰弱的催眠、鎮靜和治療外，HEL對CCl4誘導的肝損傷還具有保護作用[21]，HEL可改善慢性不可預測輕度應激大鼠的學習和認知能力及cAMP/PKA/CREB信號活動[7]。HEL還具有對大鼠慢性不可預測輕度應激模型的抗抑郁作用[9]?？傊?，HEL在豬腸上皮細胞損傷中發揮了重要的調節作用，但HEL還有眾多其他有價值的功能需要去進一步探討和發現。

4 結 論

HEL會顯著降低炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6在mRNA水平的表達；LPS會顯著提高氧化相關蛋白(Nrf2和HO-1)的表達和抗氧化酶(SOD和CAT)的活性；HEL會緩解LPS所引起的IPEC-J2細胞的氧化及炎性損傷，一定程度上保護細胞免受傷害。