反硝化細菌的分離篩選及反硝化作用影響因素研究

宋玫瀅，孫曉莉，王豆豆，林雅琪 ，劉 洋，2，3

(1.湖州師范學院生命科學學院，浙江湖州 31300；2.浙江省水生生物資源養護與開發技術研究重點實驗室，浙江湖州 313000；3.新疆第二醫學院基礎醫學部，新疆克拉瑪依 834000)

從1986年到2016年，我國養殖業發展迅速，水產品產量從445萬噸猛增加到5 142萬噸。然而，隨著水產養殖業的快速發展，水體中的殘餌、糞便、水生動物尸體、漁藥等物質大量增加，造成氮、磷以及其他有機物大量積累，導致水環境的污染，生態環境日趨惡化。水產動物的排泄物、殘餌、尸體中，含有大量的蛋白質，被微生物分解后形成氨基酸，再進一步分解成氨氮，造成水體富營養化，同時亞硝酸鹽大量積累，嚴重危害水生動物的健康養殖。這些問題已經成為制約水產養殖業健康可持續發展的重要因素。如何去除水體中的氨氮和亞硝酸鹽，對于水產養殖業健康可持續發展和水環境保護意義重大。

目前發現的反硝化細菌分布于10個不同的科，且屬于假單胞桿菌屬、產堿桿菌屬的較多。一直以來，厭氧反硝化細菌被認為是唯一能夠進行反硝化作用的細菌。直到1983年，ROBERSTON等分離出了在有氧條件下能夠進行反硝化作用的細菌()。NAOKI等研究檢測到在有氧的環境下，有兩株細菌能將硝酸鹽還原，經鑒定后，屬于有氧反硝化細菌。有氧反硝化細菌的發現有特殊意義，對其后續的研究也受到越來越廣泛的關注。盡管已發現部分反硝化細菌，具有較好的反硝化作用，然而，尋找適應一些特殊環境條件的高效反硝化能力的菌株，對于解決水體富營養化和亞硝酸鹽對水生動物的毒害，仍然具有十分重要的理論和實際研究意義。本研究通過采集活性污泥樣品，并從中分離反硝化細菌，研究影響菌株反硝化作用的主要環境因素，為反硝化細菌在養殖廢水處理應用中提供理論指導，具并有一定實際應用價值。

2 材料與方法

2.1 樣品采集

用于分離反硝化細菌的活性污泥樣品分別采自湖州鳳凰污水處理廠、美欣達印染廠、大港印染廠生化池。

2.2 培養基和試劑

富集培養基Buhospgckud(g/L)：(NH)SO2 g，FeSO0.2 g，KHPO1.0 g，MgSO0.5 g，NaCl2 g，CaCO5 g，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

反硝化細菌分離培養基：采用Giltay培養基，具體配方詳見參考文獻[16]。

2.2 反硝化細菌的分離篩選

2.2.1 活性污泥預處理

將采集的活性污泥樣品1 mL加入到裝有9 mL、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液的100 mL燒杯中，用超聲波發生器超聲振蕩1 min。

2.2.2 富集培養

將預處理過的活性污泥，用pH 7.2的磷酸鹽緩沖液從10逐級稀釋至10，取不同稀釋度的樣品液各1 mL，分別接種于含10 mL Buhospgckud培養基的試管中，每一稀釋度重復接種3管，28 ℃培養20 d(不接種的對照管同時培養)。每隔3 d取樣0.5 mL進行硝化和反硝化定性檢測和稀釋涂布。

2.2.3 硝化和反硝化細菌檢測

用無菌移液管吸取不同濃度的試管培養液并加入到白色瓷板凹窩中，然后在其中分別加入Griess試劑(Ⅰ液和Ⅱ液各2滴)和二苯胺試劑(2滴)。出現紅色為亞硝化細菌陽性管，出現藍色為硝化細菌陽性管。在實驗前，需先測定空白對照管液體中是否含亞硝酸鹽或者硝酸鹽。

2.2.4 稀釋涂布

將富集后的樣品，涂布在Giltay培養基上，每個稀釋度涂布3個平皿。將涂布好的平板倒置在30 ℃恒溫培養箱中培養3～5 d。觀察菌落周圍是否變藍，挑取菌落周圍變藍的菌落進行劃線純化。刮取1～2環菌體細胞，放入已滅菌的裝有800 μL的15%(v/v)甘油的Giltay液體培養基的菌種保藏管中，并將其放入-80 ℃冰箱進行菌株保藏。

2.2.5 產氣實驗

將10 mL Giltay液體培養基加入大試管(20 mm×200 mm)中，將杜氏小試管(5 mm×20 mm)倒立放入大試管中，小試管中的氣體排凈，121℃滅菌20 min后，冷卻至室溫后接入活化后的菌株，30 ℃恒溫培養5～7 d，觀察小管內是否有氣泡產生。

2.2.6 菌株脫氮能力比較

將分離純化的反硝化菌株按1%接種量，接種至100 mL新鮮的Giltay培養基中，30 ℃黑暗條件，靜止(震蕩)培養14 d，每隔2 d取樣1 mL，測定菌體濃度OD和NO-N，NO-N濃度。每個實驗3次重復。選取脫氮能力最高的菌株進行菌種鑒定。

2.3 菌種鑒定

菌株接種于Giltay培養基30 ℃培養72 h，觀察菌落形態，進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體細胞的形態學特征。利用磁珠法快速提取基因組DNA，具體方法參考文獻[17]。用16S rDNA引物進行擴增，PCR產物利用DNA試劑盒純化后，送至上海生物工程公司進行測序。對已測得的序列提交GenBank進行序列比對，下載與目標菌株親緣關系比較近的菌株的16S rDNA序列。利用Clustal W 1.81進行多序列比對，并用軟件Mega 4.0進行分析，采用NJ法構建系統發育樹。

2.4 反硝化細菌脫氮影響因素研究

2.4.1 溫度對脫氮的影響

將該菌株接種于裝有50 mL滅菌Giltay培養基的250 mL錐形瓶中，將培養溫度分別設置為4、20、30、37、45 ℃，培養72 h后，測定菌體OD和樣品中NO-N和NO-N濃度。每組實驗設置3個重復，以未接菌的培養基做空白對照。

2.4.2 pH對脫氮的影響

將培養基初始pH分別設置為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。菌株接種后，放置于30 ℃培養120 h，分別于培養72 h后取樣，測定菌體OD和樣品中NO-N和NO-N濃度。每組實驗設置3個重復，以未接菌的培養基做空白對照。

2.4.3 溶氧對脫氮的影響

將該菌株接種于Giltay培養基中，在最適培養溫度30 ℃和pH培養，搖床轉速設置為0、50、100、150、200 r/min，培養72 h后取樣，測定菌體OD和樣品中NO-N和NO-N濃度。每組實驗設置3個重復，以未接菌的培養基做空白對照。

2.4.4 不同C源和硝酸鹽濃度對脫氮的影響

將該菌株接種于Giltay培養基中，分別添加1%(w/v)的不同種類的碳源(乙酸鈉、丁二酸鈉、檸檬酸鈉和葡萄糖)和不同濃度的NO-N(0.1，10，100，500，1 000 L)，在最適培養溫度30 ℃、pH和轉速下培養72 h后進行取樣，測定菌體OD和樣品中NO-N和NO-N濃度。每組實驗設置3個重復，以未接菌的培養基做空白對照。

2.5 分析方法

菌體濃度的測定采用移液槍吸取200 μL培養液樣品放入酶標板中，再將酶標板放入酶標儀中，調整波長為600 nm，記錄測量結果(每個樣品取3個重復)。亞硝酸鹽和硝酸鹽含量的測定參照文獻[18]，分別采用N-1萘基-乙二胺光度法和紫外分光光度法。

3 結果與分析

3.1 反硝化細菌的分離篩選

從活性污泥中分離純化得到44株反硝化細菌菌株，對其進行脫氮能力檢測，挑選出四株脫氮能力較強的菌株，分別命名為A、B、G、H，其中菌株A和H脫氮能力最強，分別為67.04%，84.67%。將這四株菌株接種于10 mL Giltay液體培養基上進行產氣試驗，發現這四株菌株可以在杜氏小管內產氣，在管頂部形成明顯氣泡。將這四株菌株保藏用于后續實驗。

3.2 菌種鑒定

A、B、G、H四株菌株在含Giltay固體培養基的平板中的菌落形態見圖1。A菌株為土黃色菌落，菌落較大，表面粗糙，邊緣呈波浪型。B菌株菌落大小中等，呈白色，光滑，中間有凸起，邊緣整齊。G菌株大小中等，圓形，呈藍色，光滑，中間有凸起。H菌株菌落較小，圓形，白色，光滑，菌落中間有凸起。對脫氮能力最強的菌株A和H進行了16S rDNA擴增和測序，并在GenBank上進行序列比對分析，發現A菌株與的同源性高達99.65%(圖2A)，H菌株與的同源性高達99.72%(圖2B)。因此這兩株菌分別鑒定為A和H。

圖1 反硝化細菌的分離篩選Fig 1 Screening and isolation of denitrifying bacteria

圖2 反硝化細菌A菌株(A)和H菌株(B)的遺傳進化樹Fig.2 The phylogenetic tree of denitrifying bacteria strain A(A) and strain H(B)

3.3 反硝化細菌的脫氮影響因素研究

3.3.1 溫度對脫氮的影響

由圖3可知，A、B、G三株菌株在30 ℃條件下NO-N的濃度最低，表明去除率最高，分別為67.04%、50.14%、33.99%，H菌株在37 ℃條件下，NO-N的濃度最低，表明對NO-N的去除率最高，為84.67%(圖3B)。A、B、G三株菌株在30 ℃條件下的菌體濃度最高，表明這三株菌株的最適生長溫度為30 ℃；H菌株在37 ℃條件下的菌體濃度最高，表明其最適生長溫度為37 ℃(圖3A)。

圖3 菌株在不同溫度的生長情況和對的去除效果Fig.3 The effects of nitrate removal on different temperatures by the strain

3.3.2 pH對脫氮的影響

有圖4可知，在pH 6.0的情況下A、B、G、H四株菌株對培養基中NO-N的濃度最低，表明去除率最高，分別為57.10%，42.21%，33.79%，64.31%(圖4B)，其菌體濃度也最大(圖4A)。菌株的最適培養溫度和最適pH條件下，H菌株的去除率高于其他菌株，為64.31%。

圖4 菌株在不同pH的生長情況和對的去除效果Fig.4 The effects of nitrate removal at different pH by the strain

3.3.3 溶氧對脫氮的影響

由圖5可見，A、B兩株菌株在靜止情況下培養基中NO-N的濃度最低，表明去除率最高，分別為36.17%，33.43%；G菌株在轉速為100 r/min的情況下，NO-N的濃度最低，表明去除率最高，為29.23%；H菌株在轉速為50 r/min的情況下，NO-的濃度最低，表明去除率最高，為42.91%(圖5B)。菌株A、B在靜止情況下，菌體濃度最高，菌株G在轉速為100 r/min條件下，菌體濃度最高(圖5A)。表明A、B兩株菌株需要在厭氧條件下進行反硝化作用，G、H兩株菌株可以在有氧條件下脫氮，H菌株在有氧條件下的脫氮能力高于其他三株菌株。

圖5 轉速對菌株去除效果Fig.5 The effects of rotation speed on nitrate removal

3.3.4 碳源對脫氮的影響

由圖6可知，A、B、G、H四株菌株均在檸檬酸鈉的環境下對培養基中NO-N的濃度最低，表明去除率最高，分別為31.76%、31.49%、24.18%、41.15%，H菌株培養基NO-N濃度最低，表明去除率高于其他菌株(圖6B)。菌株A、H在以檸檬酸鈉和丁二酸鈉為碳源的培養基上，菌體濃度明顯高于其他兩株菌株，在這兩種碳源的培養基上菌體濃度高于其他碳源(圖6A)。

圖6 碳源對菌株生長和去除效果Fig.6 The effects of carbon resources on stain growth and nitrate removal

3.3.5 硝酸鹽濃度對脫氮的影響：

研究了菌株H在不同硝酸鹽濃度情況下的菌株脫氮情況，結果發現隨著培養基中硝酸鉀的濃度升高，高于1 g/L時，菌株脫氮速率在提高為71.78%，隨著培養基中硝酸鹽濃度上升，菌株的脫氮能力下降較快。這可能是過高的硝酸鹽濃度對菌株生長造成毒害，使得其脫氮效率下降(圖7)。

圖7 硝酸鹽濃度對菌株去除硝酸鹽影響Fig.7 The effects of nitrate concentrations on nitrate removal

4 討論

本研究從污水處理廠的活性污泥中分離篩選得到兩株具有高效反硝化細菌，其中菌株H為，該屬的微生物菌種被發現在土壤中廣泛存在，有耐鹽性和生長pH寬等特點。反硝化作用會受到環境因子(溫度、pH、溶氧、碳源和氮源濃度)影響，如何發揮反硝化細菌的性能，需要對反硝化細菌的反硝化特性進行深入研究。

本研究進一步研究了環境因子、C/N源種類和濃度對于菌株反硝化作用的影響，發現A、B、G三株菌株在30℃下培養脫氮能力最強，H菌株在37℃下培養脫氮能力最強。溫度對于菌株脫氮能力有重要影響，這與前人報道的研究結果一致。A、B、G、H四株菌株在培養基pH值為6.0的條件下脫氮能力最強，pH高于或低于6.0都會顯著影響菌體生長和菌株對硝酸鹽的利用。pH對于菌株的反硝化作用有重要影響。大多數反硝化作用發生在厭氧環境中，有少部分細菌可以在有氧條件下進行反硝化作用。本研究發現反硝化細菌G菌株和H菌株分別在轉速為100 r/min和50 r/min的條件下脫氮能力最強，屬于好氧反硝化細菌。菌株A和B在靜止條件下，反硝化能力較強。反硝化細菌脫氮能力受到溶氧濃度影響，過高或者過低的溶氧濃度影響菌株的脫氮能力。

碳源對于菌株的脫氮有重要影響，部分反硝化細菌需要在一定碳源濃度條件下，進行反硝化作用，碳源的種類對于反硝化作用影響明顯。本研究發現A、B、G、H四株菌株均在以檸檬酸鈉為碳源的環境下，脫氮能力最強，與周夢娟等報道的結果一致，也有其他研究報道以葡萄糖、琥珀酸為碳源時菌株脫氮能力最強。不同的菌株所需利用碳源種類不同，說明碳源能為異養型反硝化細菌提供生長所需的能量，以及反硝化過程中的電子供體，能影響反硝化細菌的生長和脫氮能力。

本研究發現H菌株在硝酸鹽濃度高于50 g/L的環境下，脫氮速率下降，菌體生長緩慢，與李文甫報道的結果有些不同。但是本實驗設置的硝酸鹽濃度最低為1g/L，而大于500 mg/L，李文甫報道的菌株在500 mg/L最低硝酸鹽濃度的條件下脫氮能力最強。硝酸鹽濃度也會影響菌株的反硝化速度，不同反硝化細菌脫氮能力有差異，適宜的硝酸鹽濃度環境下脫氮才能取得較好效果。

反硝化細菌高效的脫氮效率不僅需要反硝化細菌的活性強，生長速度快，還要求反硝化細菌在合適的環境條件下。本實驗分離篩選獲得的反硝化細菌與商品化反硝化菌劑相比，反硝化效率略低。商品化的反硝化菌劑其菌種成分一般不是單一菌株，復合菌劑的反硝化效果可能優于單一菌種。由于課題研究時間所限，本研究分離篩選到的反硝化細菌應用于實際養殖廢水的凈化處理還在進行之中。另外，關于H 菌種的反硝化代謝途徑研究還需進一步深入研究。

感謝張榮飛老師對本課題研究提供儀器培訓方面的資助。感謝參與課題研究的朱佳娜同學。