納豆紅曲復合物的降脂作用及藥代動力學分析

齊明明，張文萌，印書霞，孫建博*

（1.中國藥科大學中藥學院，江蘇南京 210009）（2.臨沂市檢驗檢測中心，山東臨沂 276000）（3.康道生物（南通）有限公司，江蘇南通 226000）

紅曲是傳統的曲類中藥，在我國有近千年的使用歷史[1]，是以粳米為原料由曲霉科真菌紅曲霉的菌絲體發酵而形成的紅米曲[2]，用于食物色素、酒和肉類儲存已有數百年歷史[3]。紅曲中的藥用成分主要有洛伐他汀、紅曲色素、甾醇類、十氫化萘、γ-氨基丁酸和不飽和脂肪酸等[4-5]。洛伐他汀是β-羥基-甲戊二酸單酰輔酶A 還原酶的競爭性抑制劑[6]，可抑制膽固醇的合成，增加低密度脂蛋白受體合成，臨床上主要用于高血脂的治療[7]。此外，紅曲還有降低血糖、血壓等作用[8-9]。納豆凍干粉中含有一種水溶性的單鏈多肽絲氨酸蛋白酶，即納豆激酶（NK），其對血栓、急性心肌梗死、腦血栓中風、脈管栓塞等血栓性疾病的預防和治療具有一定意義[10]。有研究表明NK 具有溶解纖維蛋白的活性[11]，每天補充一定量的NK，持續兩個月，可降低健康受試者體內的纖維蛋白原和凝血因子含量[12]，且NK 的纖溶活性作用效果快、安全性高[13]。納豆紅曲復合物（Natto monascus complex，NMC）是由紅曲、植物甾醇、納豆凍干粉為主要原料制成的一種保健食品，研究顯示其具有輔助降血脂的效果[14-17]。

目前市面上含有紅曲、納豆等成分的保健食品種類眾多，雖然已有研究顯示這類保健食品具有一定的降脂溶栓藥理作用，但相關實驗數據仍相對較少，且缺乏相關的藥物代謝動力學研究。因此，本實驗旨在研究NMC 對高脂飲食（High fat diet，HFD）誘導大鼠模型血脂水平的影響。此外，由于之前的研究[18]顯示NMC 中主要的降脂藥效成分是洛伐他汀，因而本研究選用洛伐他汀作為指標性成分，考察了其在比格犬體內的藥物代謝動力學過程，以期為納豆、紅曲類保健食品的研發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

納豆紅曲復合物（批號：20181123）購自康道生物（南通）有限公司；低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）測定試劑盒（貨號：A113-1-1）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒（貨號：A112-1-1）、總甘油三酯（Total triglyceride，TG）測定試劑盒（貨號：A110-1-1）以及總膽固醇（Total cholesterol，TC）測定試劑盒（貨號：A111-1-1）購自南京建成生物工程研究所；洛伐他汀膠囊（批號19021211）購自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Spectra Max iD5 多功能酶標儀，美谷分子儀器（上海）有限公司；Agilent LC-MS6420 質譜檢測儀，安捷倫科技有限公司；高效液相色譜檢測儀，島津企業管理（中國）有限公司；Eclipse Plus C18RRHD 色譜柱，安捷倫科技有限公司。

1.3 藥物與主要試劑配制

0.5%羧甲基纖維素鈉溶液（0.5% CMC-Na）的配制：精密稱取CMC-Na 粉末5.0 g，加入至1000 mL加熱至60 ℃后的三蒸水中，均勻鋪撒于液面，80 ℃加熱攪拌，現用現配。

NMC 混懸液的配制：將NMC 粉碎為粉末，過篩。精密稱取16.2 g、32.4 g 和64.8 g 粉末，分別加入100 mL 的0.5% CMC-Na 溶液中混懸，配制成濃度分別為16.2 g/100 mL、32.4 g/100 mL 以及64.8 g/100 mL 的NMC 混懸液。

洛伐他汀混懸液的配制：精密稱取洛伐他汀180 mg，加入100 mL 的0.5% CMC-Na 溶液中混懸，現用現配。

10%水合氯醛溶液的配制：稱取10.0 g 的水合氯醛粉末，加入生理鹽水100 mL 溶解，配制成4%的溶液，現用現配，使用前冷藏。

1.4 實驗動物與飼料

180～220 g SD 大鼠，SPF 級，雌雄各半，購自南京青龍山動物繁殖場，許可證號：SCXK(滬)2018-0004。6～8 m 齡比格犬（普通級），體重約10 kg，6 只，雌雄各半，購自南京青龍山動物繁殖場，許可證號：SCXK(滬)2018-0007。大鼠高脂飼料（貨號：TP25540）由南通特洛菲飼料科技有限公司提供。比格犬飼料購自南京青龍山動物繁殖場。飼養條件：室溫22～25 ℃，相對濕度：60%±10%，自然光線，自由飲水進食，適應性飼養7 d。本實驗已獲得中國藥科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.5 動物模型的建立及分組

SD 大鼠隨機分為正常組和實驗組。正常組大鼠給予普通飼料，實驗組給予高脂飼料，連續喂養4 w后，于眼眶靜脈叢取血1.5 mL，分別測定LDL-C、HDL-C、TG 以及TC 的水平。若實驗組大鼠的血脂水平與正常組相比出現顯著性差異，即為造模成功。

將造模成功的大鼠隨機分為5 組，即模型組、陽性藥洛伐他汀組（1.8 mg/kg）、NMC 低劑量組（162 mg/kg）、NMC 中劑量組（324 mg/kg）、和NMC 高劑量組（648 mg/kg），每組各8 只。隨后，正常組大鼠給與普通飼料，而其余各組大鼠則繼續給予高脂飼料，并開始灌胃給藥，每天一次，連續給藥4 w，正常組和模型組則給予等量的0.5% CMC-Na 溶液。

1.6 大鼠血清血脂檢測

給藥結束后，大鼠禁食12 h，然后于眼眶靜脈叢取血1.5 mL，4 ℃靜置2 h 后于4000 r/min 條件下離心20 min，取上層血清，分別使用TC、TG、HDL-C、LDL-C 試劑盒測定血脂相關指標。

1.7 色譜條件和質譜檢測參數

色譜柱：EclipsePlus C18RRHD（1.8 μm，2.1×50 mm），流動相由乙腈:水=65:35（V/V）組成，進樣體積3 μL，流速0.2 mL/min，柱溫30 ℃，離子源溫度350 ℃，去簇電壓170 V，碰撞電壓27 V。

質譜離子化方式：電噴霧離子化（ESI），正離子模式；多反應監測（MRM）。洛伐他汀[M+Na]+m/z：427.2→325.2，辛伐他汀[M+Na]+m/z：441.2→325.2。

在此條件下測得的洛伐他汀有較好的分離度。

血漿樣品的處理：取500 μL 血漿置于抗凝離心管中，精密加入內標溶液1500 μL，于5 ℃、10000 r/min 條件下離心10 min，連續兩次，隨后吸取上層血漿移入聚丙烯管中密封，置于-80 ℃冰箱中冷凍保存備用。

1.8 內標對照品溶液的制備

精密稱取辛伐他汀和甲苯磺丁脲各1.00 mg，加入乙腈定容至10 mL，即得0.1 mg/mL 的辛伐他汀和甲苯磺丁脲的混合溶液。隨后用乙腈稀釋至10 ng/mL，即得內標溶液。

1.9 比格犬給藥方案

取6 只健康比格犬，口服給予8 片NMC。分別于給藥前（0 h）和給藥后0.5、1、2、3、4、5、6、8、12 h 和24 h 采集腿靜脈血2 mL，置于抗凝的離心管中。

1.10 數據統計學處理

所有的數據結果均以mean±SEM 表示，采用單因素方差分析進行統計學分析，若p＜0.05 則表示存在顯著性差異，若p＜0.01 則表示存在極顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 NMC 對HFD 誘導大鼠血脂水平的影響

2.1.1 大鼠一般情況

適應性喂養一周后，SD 大鼠飲食正常，毛色光亮，精神狀態良好，敏捷度良好，活動反應能力正常。分組喂養4 w 后，正常組大鼠無明顯變化，而HFD 誘導大鼠食欲降低，毛色發黃無光澤，糞便稀溏，血液黏稠。

2.1.2 高脂血癥大鼠模型的建立

如表1 所示，造模4 w 后，與正常組相比，HFD誘導大鼠的血清中LDL-C與TC 水平均顯著升高（p＜0.01），TG 水平明顯升高（p＜0.05），證明大鼠高脂血癥模型造模成功。

表1 正常組大鼠與HFD 誘導大鼠血脂情況Table 1 The blood fat data of normal and HFD-induced rats(mmol/L,mean±SEM)

2.1.3 NMC 對HFD 誘導大鼠血脂的影響

給藥4w 后，采用相應試劑盒測定各組大鼠血清中LDL-C、HDL-C、TC 和TG 水平，結果如表2 所示。各組大鼠血清中的HDL-C 無顯著性差異。與空白組相比，模型組大鼠血清中LDL-C（10.35 vs.0.28）、TC（15.29 vs.1.57）以及TG（0.44 vs.0.32）水平均顯著升高（p＜0.01）。與模型組相比，NMC 低、中劑量組大鼠血清中LDL-C（8.04，8.11）以及TG（0.22，0.23）水平顯著降低（p＜0.01），且NMC 高劑量組大鼠血清中LDL-C（6.53）、TC（10.53）以及TG（0.28）水平均顯著降低（p＜0.01）。此外，洛伐他汀也可顯著降低HFD 誘導大鼠血清中的LDL-C（7.93）、TC（11.86）以及TG（0.25）水平，但與NMC 高劑量組無顯著性差異（p＞0.05）。這些結果表明，NMC 灌胃給藥可降低HFD 誘導大鼠的血脂水平，其作用具有劑量依賴性，且高劑量的作用效果與洛伐他汀相當。

表2 NMC 對HFD 誘導大鼠血脂的影響Table 2 The effects of NMC on the blood fat of HFD-induced rats (mmol/L,mean±SEM)

2.1.4 NMC 對HFD 誘導大鼠肝臟病理學的影響

如圖1 所示，給藥4 w 后，正常組大鼠肝臟外觀呈深紅色，表面光滑細膩，斷面無顆粒，質地柔軟堅韌。模型組大鼠肝臟顏色變淺，呈淡黃色，質地變硬且易碎，斷面呈顆粒狀，體積變化不明顯。NMC 低、中、高劑量組大鼠肝臟顏色逐漸加深，有顆粒狀斑點，肝臟斷面呈顆粒狀，洛伐他汀組大鼠肝臟顏色則偏淡紅色。

圖1 各組具有代表性的大鼠肝臟外觀照片Fig.1 The representative liver photographs of rats from different groups

隨后，本研究運用蘇木精-伊紅染色法檢測了NMC 對HFD 誘導大鼠肝臟組織病理學的影響。染色結果如圖2 所示，正常組大鼠肝細胞形態正常，細胞邊界及細胞核清晰，胞漿呈粉紅色（圖2a）。與正常組相比，模型組大鼠肝臟組織出現炎性細胞浸潤，肝細胞體積顯著增大且腫脹，核顏色加深，細胞間界限不清，胞漿中出現較大的脂肪滴，將細胞核擠向一側，呈重度脂肪樣變化（圖2b）。而與模型組相比，NMC中、高劑量組大鼠肝臟組織炎性細胞浸潤以及脂肪樣變性減輕，細胞形態明顯改善，細胞間界限較為清晰，且作用效果與洛伐他汀相當（圖2d～f）。

圖2 NMC 對HFD 誘導大鼠肝臟組織病理學的影響（400×）Fig.2 The effects of NMC on the liver histopathology of HFD-induced rats (400×)

2.2 NMC 藥物代謝動力學研究

2.2.1 NMC 在比格犬體內的濃度-時間曲線

本研究通過HPLC 法檢測，精密稱定洛伐他汀標準品12.50 mg，梯度稀釋，在238 nm 下測得吸光度，以峰面積積分值為縱坐標Y，進樣濃度X(mg)為橫坐標，進行線性回歸，得標準曲線Y=2685.3X+83128，r=1。精密稱定納豆紅曲復合物20.00 mg，加入乙腈溶液定容至10 mL 容量瓶中，在238 nm 處測吸光度，代入標準曲線方程，計算得每20 mg NMC 復合物中含有洛伐他汀0.355 mg。

本實驗運用LC-MS 技術檢測比格犬給與NMC后，其血漿中洛伐他汀的濃度變化，得到的血藥濃度-時間曲線如圖3 所示，在比格犬體內，NMC 給藥后洛伐他汀的達峰時間Tmax為1.17 h，峰濃度Cmax為62.33 ng/mL。

圖3 比格犬口服NMC 后血漿中洛伐他汀的藥物濃度-時間曲線Fig.3 The concentration-time curve of lovastatin in the plasma from beagle dogs after oral administration of NMC(Mean±SEM,n=6)

2.2.2 NMC 在比格犬體內的藥代動力學參數

隨后本研究根據前面的藥物濃度-時間曲線，用統計矩法計算了NMC 中洛伐他汀在比格犬血漿中的藥代動力學參數，主要包括末端相消除半衰期T1/2、血藥濃度-時間曲線下面積AUC、體內滯留時間MRT，以及Tmax和Cmax實測值等，具體數據如表3 所示。

表3 NMC 單次給藥后比格犬血漿中洛伐他汀的藥代動力學參數Table 3 The pharmacokinetic parameters of lovastatin in the plasma of beagle dogs after a single doseof NMC

本采用LC-MS技術測定了NMC給藥后比格犬血漿中洛伐他汀的濃度變化，并進行了藥代動力學分析。實驗結果顯示，NMC 口服給藥后，其成分洛伐他汀在比格犬體內的消除半衰期T1/2為5.95 h，以梯形法計算得的血藥濃度-時間曲線下面積AUC(0-24)為137.40 mg/L×h，AUC(0-∞)為165.99 mg/L×h，平均體內滯留時間MRT 為7.83 h。

洛伐他汀可以通過多種方法進行檢測，其中主要以HPLC 和LC-MS/MS 為主[16]。HPLC-UV 紫外檢測法靈敏度較低，最低檢測限較高，難以準確測定洛伐他汀的血藥濃度，且LC-MS 中的選擇性離子檢測（SIM）模式準確度也較低，誤差較大。而本實驗使用的Agilent 6420 三重四極桿質譜檢測儀，其多反應監測（MRM）模式可以同時準確定量樣品中待測物和內標物的含量，具有高效、特異性強、靈敏高等特點，被廣泛用于研究藥物的代謝動力學特征。辛伐他汀為洛伐他汀的同系物，常被用作內標物，以解決質譜檢測器信號相對不穩定的問題[19,20]。此外，此實驗條件下洛伐他汀和辛伐他汀的[M+Na]+均比[M+H]+峰響應值高，且更為穩定，因此本實驗選擇[M+Na]+峰為定量峰。

之前的藥物代謝動力學研究結果表明，洛伐他汀在人和比格犬血漿中的達峰時間和半衰期等數據相近[19-21]，此外也有文獻對洛伐他汀緩釋制劑進行研究[22,23]，但尚無有關紅曲或NMC 的藥物代謝動力學研究。洛伐他汀作為紅曲中降脂的主要有效成分，其體內檢測方法較為成熟，因此，本研究選用洛伐他汀作為紅曲降脂的指標性成分，考察其在比格犬體內的藥物代謝動力學過程，以期為紅曲的安全性評價提供參考。本實驗結果顯示，比格犬單次口服NMC 后，洛伐他汀血藥濃度達峰時間約為1.17 h，半衰期約為5.95 h，體內滯留時間為7.83 h，這與之前的文獻報道基本相同，但峰濃度（30.05～129.33 mg/L）個體間差異較大，可能是因為實驗動物存在個體差異。

3 結論

本研究表明NMC灌胃給藥可降低HFD誘導大鼠的LDL-C、TG 和TC 等血脂水平，并可減輕肝臟細胞脂肪變性，且作用效果與洛伐他汀相當。而且，藥代動力學實驗結果表明，NMC 的有效成分洛伐他汀在比格犬體內可被正常吸收、代謝，并在12 h 之內代謝完全。本研究成果可為納豆、紅曲類保健食品的研發提供實驗依據。