一株紅曲霉的分離及發酵特性研究

苑建偉,齊鵬翔*，侯小歌，高俊乾

(1.周口職業技術學院 農牧工程學院，河南 周口 466000；2.周口師范學院 生命科學與農學學院，河南 周口 466000)

紅曲霉屬真菌界、紅曲霉屬 (MonascusvanTieghem)，形態多為不規則的分支菌絲，菌絲多核具有大型液泡、線粒體和橫隔[1]；分生孢子單一或成串地生長于菌絲頂端，并從上至下逐漸成熟[2]。菌落有成絨氈狀、皮膜狀、皮膜狀少褶皺或具有輻射紋。

紅曲霉菌最顯著的特征是可以產生紅色色素，紅曲色素具有抑制脂肪酶衍生物活性的特點，對紅曲發酵過程中產生的D型氨基酸具有較高的抑制活性[3-4]。在紅曲發酵過程中，紅曲霉菌可以產生多種功能的次生代謝產物，包括抗抑菌物質、膽固醇生物合成抑制劑、麥角固醇等[5]。一些科學研究表明，這些次生代謝產物具有抗炎[6-7]、抗氧化[8]活性，同時可以預防或改善高膽固醇血癥[9]、高脂血癥[10]、高血壓、糖尿病[11]、肥胖[12]、老年癡呆癥[13]等。近年來，紅曲霉已用于合成食品添加劑及化學藥物，世界各國掀起了食用綠色食品和天然藥物的熱潮[14-15]。紅曲作為藥食兼用的天然制品，正在引起消費者和研究者的極大關注[16-19]。

本課題主要針對紅曲霉菌發酵的功能、發酵的特性以及在制曲中的應用進行研究，使人們了解到紅曲霉菌培養產生各種次級代謝產物的最優發酵條件以及在最優條件下對工業制曲的積極作用。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

本實驗從某紅曲米中分離得到的紅曲霉菌，分別命名為F1、F2、F3。

1.1.2 主要培養基

麥芽汁液體培養基[20]：麥芽粉與水按1∶6混合。37 ℃ 保溫30 min，52 ℃ 保溫60 min，65 ℃保溫約30 min，開始計時，每隔5 min測定糖化液與碘液反應，藍色消失顯黃色時糖化結束，78 ℃保溫10 min，滅菌冷卻至室溫待用。

黃豆芽液體培養基[21]：取100 g黃豆芽，加水煮沸20 min后過濾，濾液定容至1000 mL，加葡萄糖50 g，pH自然，分裝滅菌。

1.2 主要儀器與設備

LRH系列的生化培養箱、SYQ-DSX-280B型不銹鋼壓力蒸汽滅菌器、HZQ-X300恒溫振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司；101-型電熱鼓風干燥箱 北京科偉永興儀器有限公司；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 主要實驗方法

1.3.1 紅曲霉菌的分離、純化

1.3.1.1 紅曲霉菌株的分離與純化

分離：取5.0 g紅曲米放入100 mL三角瓶中，加入45 mL無菌水，在35 ℃、150 r/min恒溫振蕩器中振蕩15 min進行活化，此濃度為10-1；用移液槍吸取1 mL加入到盛有9 mL的無菌水中，振蕩搖勻，濃度為10-2；依次進行梯度稀釋，到10-5。用移液槍吸取10-3、10-4、10-53個梯度1 mL打入麥芽汁平板培養基中，用涂布涂勻，每個梯度兩個平行，30 ℃培養3～5 d。

純化：用接種環挑取單菌落，在麥芽汁平板上劃線，30℃培養3～5 d。

1.3.1.2 紅曲霉菌形態觀察

載玻片濕室培養法[22]：準備濕室：在培養皿底部鋪一張圓形濾紙片，濾紙片上依次放上“U”玻璃片擱架、載玻片、蓋玻片(兩片)，蓋上皿蓋，外用紙包扎，121 ℃滅菌20 min。取菌接種：用接種環挑取孢子，輕輕在載玻片上碰幾下，接種量要少，同一載玻片接種兩處。加培養基：用移液槍吸取少量融化冷卻45 ℃豆芽汁培養基滴到接種處，直徑約為0.5 cm。加蓋玻片：待培養基凝固前，用無菌鑷子將蓋玻片蓋上，輕輕按壓，要求蓋玻片與載玻片之間留有小縫隙。倒保濕劑：倒入約3 mL 20%的無菌甘油，使濾紙完全濕潤，蓋上皿蓋，30 ℃培養。觀察：定時用顯微鏡觀察紅曲霉菌生長情況，取16，24，32，48，72 h時間點。

1.3.2 紅曲霉菌的發酵特性研究

1.3.2.1 紅曲霉菌在不同溫度條件下的發酵特性

選擇豆芽汁液體培養基，15，20，25，30，35，40，45 ℃，培養5 d測定紅曲霉菌的酸度、色價、酯化力和糖化酶活力。其中，紅曲霉菌酸度的測定采用酸堿滴定法，色價的測定采用分光光度計法，采用滴定法測定酯化酶活力，采用紫外法測定酶活力[23-24]。

1.3.2.2 紅曲霉菌在不同酸性條件下的發酵特性

選擇豆芽汁液體培養基，調初始pH值為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，培養5 d測定紅曲霉菌的酸度、色價、酯化力和糖化酶活力。

1.3.2.3 紅曲霉菌在不同酒精濃度條件下的發酵特性

選擇豆芽汁液體培養基，用無水乙醇調節培養基初始酒精濃度為1%、3%、5%、7%、9%，培養5 d測定紅曲霉菌的酸度、色價、酯化力和糖化酶活力。

1.3.2.4 紅曲霉菌在不同糖度條件下的發酵特性

選擇豆芽汁液體培養基，設置初始糖度分別為4%、6%、8%、10%、12%、14%，培養5 d測定紅曲霉菌的酸度、色價、酯化力和糖化酶活力。

1.3.3 紅曲霉菌在制曲中的應用

1.3.3.1 紅曲霉菌種子液的制備

選擇初始pH 5.5、糖度10%、酒精度5%的麥芽汁液體培養基，30 ℃培養5 d得到種子液。

1.3.3.2 紅曲霉應用于麩曲的制備

將紅曲霉菌種子液以10%的接種量分別接種于500 mL三角瓶、1000 mL三角瓶和托盤的無菌麩皮中，30 ℃培養7～8 d，采用滴定法、干燥法、滴定法、皂化法測定麩曲的酸度、水分、糖化酶活力、酯化酶活力。

2 結果與分析

2.1 紅曲霉菌的分離、純化與鑒定

2.1.1 紅曲霉菌的分離與純化

經稀釋涂布法分離得到3株紅曲霉菌，對其編號為F1、F2、F3。挑取3株菌株的單菌落進行純化，觀察發現F2生長最好、產紅色色素最多，所以選定F2菌株為供試菌種。

2.1.2 菌種觀察

通過平板菌落和鏡檢觀察特征(見圖1)，實驗發現煙色紅曲霉菌的F2菌株在麥芽汁瓊脂培養基生長良好，菌落初為白色，老熟后為橙紅色，菌落呈絨狀。菌絲具有橫隔，多核，分枝多而不規則。分生孢子梗由菌絲生出，頂部產生分生孢子，以向基式生出26個成串。

圖1 不同時間紅曲霉菌的生長狀況

2.2 紅曲霉菌的發酵特性研究

2.2.1 紅曲霉菌在不同溫度條件下的發酵特性

由圖2可知，不同溫度均會對煙色紅曲霉菌產酸、產色素、酯化酶活力和糖化酶活力產生不同程度的影響。當溫度達到30 ℃時，煙色紅曲霉菌的產酸最高，為1.2 mL/dL，產酸較高的溫度范圍為30～35 ℃，工業化生產一些需要產酸發酵的工藝可以控制溫度在30～35 ℃。 煙色紅曲霉菌產色素最高的溫度為35 ℃，產色素最佳的溫度范圍為30～40 ℃。煙色紅曲霉菌酯化酶活力最高的是30 ℃，可達到19.94 U/mL；酯化酶活力較高的溫度范圍為30～35 ℃。當溫度為35 ℃時，糖化酶活力最高，此時糖化酶活力27.6 U/mL，糖化酶活力較高的溫度范圍為30～35 ℃。綜合考慮，煙色紅曲霉菌在溫度30～35 ℃發酵特性最為明顯，所以在制曲工藝中可以控制溫度在30～35 ℃。

圖2 不同溫度對煙色紅曲霉菌產酸、產色素、酯化酶活力和糖化酶活力的影響Fig.2 The effect of different temperatures on acid production, pigment production, esterification enzyme activity and saccharification enzyme activity of Monascus fuliginosus Sato

2.2.2 煙色紅曲霉菌在不同酸性條件下的發酵特性

由圖3可知，當培養基的pH為6.0時，煙色紅曲霉菌產酸最高，為3.6 mL/dL；產色素最高的pH為5.0；酯化酶活力最高的pH為6.0，所以對于產色素要求較高的發酵工藝可以控制pH在5.5～6.0，此時酶活力為20.15 U/mL。pH≥4每兩個梯度間酯化力差距不大，酯化力最適的酸度范圍在pH 4.0～7.0，所以對于產乙酸乙酯要求較高的工藝，可以將培養液酸度控制在pH 4～7。糖化酶活力最高的pH為5.0，酶活力為18.92 U/mL，所以對一些糖化酶活力要求較高的工藝可以控制酸度pH為4.0～5.5。綜合考慮，煙色紅曲霉菌發酵最適的酸度范圍為pH 5.0～6.0。

圖3 不同pH對煙色紅曲霉菌產酸、產色素、酯化酶活力和糖化酶活力的影響Fig.3 The effect of different pH values on acid production, pigment production, esterification enzyme activity and saccharification enzyme activity of Monascus fuliginosus Sato

2.2.3 煙色紅曲霉菌在不同酒精濃度條件下的發酵特性

酒精度對煙色紅曲霉菌產酸、產色素、酯化酶活力和糖化酶活力的影響見圖4。

圖4 不同酒精度對煙色紅曲霉菌產酸、產色素、酯化酶活力和糖化酶活力的影響

由圖4可知，當酒精度為7%時煙色紅曲霉菌產酸最高，酸度為1.6 mL/dL，產酸較高的酒精度范圍為7%～9%；當酒精度為5%時，煙色紅曲霉菌產色素最高；當酒精度為1%時，酯化酶活力最高，可達到19.9 U/mL，酯化酶活力最適的酒精度范圍為1%～5%，所以對于一些產乙酸乙酯要求較高的企業可以控制酒精度在1%～5%；糖化酶活力最高的酒精度是5%，為18.9 U/mL。綜合考慮，煙色紅曲霉菌發酵最適的酒精度范圍為5%左右。

2.2.4 煙色紅曲霉菌在不同糖度條件下液體培養基發酵特性

不同糖度對煙色紅曲霉菌產酸、產色素、酯化酶活力和糖化酶活力的影響見圖5。

圖5 不同糖度對煙色紅曲霉菌產酸、產色素、酯化酶活力和糖化酶活力的影響Fig.5 The effect of different sugar content on acid production, pigment production, esterification enzyme activity and saccharification enzyme activity of Monascus fuliginosus Sato

由圖5可知，煙色紅曲霉菌產酸最高的糖度是10%，為1.4 mL/dL；產色素最高的糖度是10%，為2.38；產酯化酶活力最高的糖度是8%，為21.12 U/mL；糖化酶活力最高的糖度是10%，為21.29 U/mL；綜合考慮，煙色紅曲霉菌發酵最適糖度為8%～10%。

2.3 煙色紅曲霉菌在不同容器中的發酵特性

在最優的發酵條件下，不同容器的煙色紅曲霉菌在麩皮擴大培養中的酸度、水分含量、酯化酶活力和糖化酶活力的影響見圖6。

圖6 不同容器擴大培養對煙色紅曲霉菌的酸度、水分含量、酯化酶活力和糖化酶活力的影響Fig.6 The effect of amplification culture in different containers on acidity, moisture content, esterification enzyme activity and saccharification enzyme activity of Monascus fuliginosus Sato

由圖6可知，擴大培養的酸度最高的是托盤，為2.4 mL/dL；最低的是1000 mL三角瓶，為1.05 mL/dL，托盤產酸量普遍大于三角瓶。水分最高的為1000 mL三角瓶，為75%；水分最低的是托盤，為15%；托盤培養水分小于三角瓶。糖化酶活力最高的是托盤，為112 U/mL；最低的是500 mL三角瓶，為64 U/mL；托盤糖化酶活力普遍大于三角瓶。酯化力最高的是托盤，為16.79 U/mL；最低的是1000 mL三角瓶，為6.29 U/mL；托盤酯化力普遍大于三角瓶。綜合考慮，煙色紅曲霉菌在麩皮發酵中托盤培養最好。

3 結論

通過分離，純化共得到3株煙色紅曲霉菌，挑選出長勢最好的一株煙色紅曲霉菌F2，經初步鑒定,菌株F2為煙色紅曲霉菌。該菌株產酸最適條件為溫度30 ℃、pH 6.0、酒精度7%、糖度10%；產色素最適條件為溫度35 ℃、pH 5.0、酒精度5%、糖度10%；酯化酶活力最適條件為溫度30 ℃、pH 6.0、酒精度1%、糖度8%；糖化酶活力最適條件為溫度35 ℃、pH 5.0、酒精度5%、糖度10%。1000 mL三角瓶水分最高，為75%；酸度、酯化酶活力、糖化酶活力托盤培養最高，分別為2.4 mL/dL、16.79 U/mL、112 U/mL。以上實驗結果可為實際工業制曲生產提供理論基礎，具有一定的參考意義。