超聲內鏡聯合Ki-67、DOG1 表達對胃腸道間質瘤診斷、危險性分級的評估價值

陳麗萍，余志金，陳惠新

（惠州市中心人民醫院消化內科，惠州 516001）

胃腸道間質瘤（GIST）是最常見的起源于消化道的間質瘤，每年的發病率為百萬分之7.8［1］。GIST 在所有年齡組均有報道，然而，不到10%的患者年齡小于40歲［2］。在成人胃腸道間質瘤中，最常見的原發部位是胃和小腸；在極少數情況下，它們也發生在內臟外的部位，如腸系膜、網膜、骨盆和腹膜后［3］。不幸的是，GIST具有潛在惡性，預后較差，在根治性切除后，腫瘤復發仍然很常見，特別是在高?；颊咧?，超過50%的患者在根治性切除后5 年內復發［4］。尋找合適的方法對GIST盡早進行有效診斷和危險性分級對改善預后有積極作用。超聲內鏡是GIST 常用的檢測手段；Ki67 是一種核蛋白，可指示細胞增殖的程度；DOG1 是GIST 中特異表達的蛋白［5］。因此，本研究探討超聲內鏡聯合Ki-67、DOG1 表達對胃腸道間質瘤診斷、危險性分級的評估價值，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015 年1 月～2020 年12 月收治GIST 患者98 例作為GIST 組，男54 例，女44 例；年齡32～71 歲，平均（51.54±4.82）歲；腫瘤部位：胃79 例，小腸12 例，結直腸7 例；腫瘤直徑2～18cm，平均（6.25±2.34）cm；組織學類型：梭形細胞型73 例，上皮細胞型15 例，混合型10 例；核分裂數：≤5 個/50 高倍視野（Highpowerfield，HPF）66 例，6～10 個/50HPF 18 例，＞10個/50HPF 14 例；危險度分級（NIH）［6］：極低危12 例，低危28 例，中危36 例，高危22 例。選取同期非GIST 患者（均為內鏡診斷黏膜下腫物）30 例作為對照組，男18 例，女12 例；年齡36～68 歲，平均（53.61±3.78）歲；病理類型：胃腸道平滑肌瘤19 例，胃腸道神經鞘瘤11 例。兩組患者性別、年齡比較差異無統計學意義（P>0.05）。

1.2 納入與排除標準 納入標準：①GIST 符合《中國胃腸道間質瘤診斷治療共識》［7］中相關診斷標準，且經術后病理學確診；②初次確診為GIST；③均行內鏡下或外科手術切除治療，術前未進行輔助治療；④術前均行超聲內鏡檢查；⑤具有完整病歷資料。排除標準：①合并其他胃腸道疾病患者；②未進行超聲內鏡檢查患者；③合并其他惡性腫瘤患者。

1.3 方法

1.3.1 超聲內鏡檢查 患者于檢查前禁食禁水8h，靜脈全麻或表面麻醉，使用FUJINON -7000 超聲內鏡配合5-20MHz 可調探頭采用充盈法和水囊法進行檢查。觀察并記錄病變部位、大小、形狀、回聲等情況。

1.3.2 Ki-67、DOG1 表達檢測 取患者腫瘤組織標本，甲醛固定，石蠟包埋，連續切片，厚度4μm。使用Ki67、DOG1 免疫組化試劑盒（上海谷研實業有限公司）采用過氧化物酶標記的鏈霉親和素（SP）法檢測Ki-67、DOG1 表達情況。切片常規脫蠟水化，細胞通透液浸潤玻片30min，PBS 清洗3 次；將玻片放入0.01M 檸檬酸鈉緩沖液（PH6.0）中微波修復抗原，PBS 清洗3 次；加入3%H2O2溶液孵育30min 以阻斷內源性過氧化酶，PBS 清洗3 次；加入50μL 適當比例稀釋Ki67、DOG1 一抗，4℃孵育過夜，PBS 清洗5 次；加入二抗室溫孵育30min～1h，PBS 清洗5 次；滴加過氧化物酶標記的鏈霉親和素（SP）室溫孵育30min～1h，PBS 清洗5 次；濾紙吸干水分，加入50～100μL DAB，室溫反應10min，PBS 清洗3 次；加入蘇木素復染，幾秒后流水充分沖洗，脫水、透明、封片。

1.4 結果判定

1.4.1 超聲內鏡量化標準［8］在同一頻率下（9 Hz）采集兩組患者超聲圖像，并以JPEG 格式保存。由同一人（不知病理結果）對選取的超聲圖像利用 Photoshop CS6 13.0 軟件中沿病灶輪廓選定測定區間，測定其灰度平均值（回聲強度）及灰度標準偏差（回聲均勻度）。每張選定圖片各測定5 次，取平均值。

1.4.2 Ki-67、DOG1 陽性表達判讀 Ki-67 陽性為細胞核有棕黃色顆粒，DOG1 陽性為細胞質或細胞膜著色，每切片隨機取400 倍顯微鏡視野5 個，分別對陽性細胞及總細胞進行計數，計算陽性細胞率。陽性細胞率=（陽性細胞數/總細胞數）×100%。

1.5 統計學方法 使用SPSS 20.0 統計學軟件進行統計處理。計量資料以mean±SD 表示，兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用F 檢驗。繪制受試者工作特征曲線（Receiver Operating Characteristic，ROC），計算曲線下面積（Area Under the Cure，AUC），評估超聲內鏡、Ki-67 和DOG1 表達水平對診斷GIST 和危險度分級的效能，AUC 比較采用Z 檢驗。P<0.05 則認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者超聲內鏡、Ki-67、DOG1 表達比較GIST 組超聲內鏡圖像的灰度平均值及灰度標準偏差、Ki-67 和DOG1 表達陽性細胞率均高于對照組（P>0.05），見表1。

表1 兩組患者超聲內鏡、Ki-67、DOG1表達比較

2.2 超聲內鏡、Ki-67、DOG1 表達對GIST 的診斷價值 分別繪制超聲內鏡（灰度平均值、灰度標準偏差）、Ki-67、DOG1 表達及其聯合診斷GIST 的ROC 曲線，將GIST 作為陽性結果，對照組作為陰性結果。超聲內鏡圖像的灰度平均值診斷GIST 截點為62.83，AUC 為0.841；超聲內鏡圖像的灰度標準偏差診斷GIST 截點為11.56，AUC 為0.743；Ki-67 表達陽性細胞率診斷GIST截點為7.34%，AUC 為0.785；DOG1 表達陽性細胞率診斷GIST 截點為10.69%，AUC 為0.835；聯合診斷GIST的AUC 為0.954，高于單獨診斷AUC 值（P<0.05）。見圖1，見表2。

圖1 超聲內鏡、Ki-67、DOG1表達對診斷GIST的ROC曲線

表2 超聲內鏡、Ki-67、DOG1表達對診斷GIST的ROC曲線分析各數值

2.3 超聲內鏡、Ki-67、DOG1 表達與GIST 患者臨床特征的關系 GIST 患者腫瘤直徑、核分裂數、危險度分級與超聲內鏡（灰度平均值、灰度標準偏差）、Ki-67 表達陽性細胞率有關（P<0.05），與DOG1 表達陽性細胞率無關（P>0.05）；GIST 患者性別、年齡、腫瘤部位、組織學類型與超聲內鏡（灰度平均值、灰度標準偏差）、Ki-67、DOG1 表達陽性細胞率無關（P>0.05）。見表3。

表3 超聲內鏡、Ki-67、DOG1表達與GIST患者臨床特征的關系

2.4 超聲內鏡、Ki-67、DOG1 表達對GIST 危險度分級的診斷價值 分別繪制超聲內鏡（灰度平均值、灰度標準偏差）、Ki-67、DOG1 表達及其聯合診斷GIST 的ROC 曲線，將中危和高危GIST 作為陽性結果，低危和極低危GIST 作為陰性結果。超聲內鏡圖像的灰度平均值診斷GIST 危險度分級截點為67.34，AUC 為0.822；超聲內鏡圖像的灰度標準偏差診斷GIST 危險度分級截點為13.05，AUC 為0.746；Ki-67 表達陽性細胞率診斷GIST 危險度分級截點為8.90%，AUC 為0.794；DOG1表達陽性細胞率診斷GIST 危險度分級截點為14.85%，AUC 為0.687；聯合診斷GIST 危險度分級的AUC 為0.900，高于單獨診斷AUC 值（P>0.05）。見圖2，見表4。

表4 超聲內鏡、Ki-67、DOG1表達對GIST危險度分級的ROC曲線分析各數值

圖2 超聲內鏡、Ki-67、DOG1表達對GIST危險度分級的ROC曲線

3 討論

GIST 是臨床中最常見的胃腸道惡性上皮下病變（SEL）［9］。GIST 被認為起源于Cajal 的間質細胞［10］，Cajal 是胃腸道運動的起搏器細胞。GIST 主要是由酪氨酸激酶受體KIT 和血小板來源的生長因子受體-α的致癌突變引起的［11］。約10% ～ 30%的GIST 具有惡性臨床病程［12］。此外，有報道稱不僅具有高核分裂指數的大型GIST 經常表現出惡性臨床病程，具有低核分裂指數的小型GIST 也會表現出惡性轉移病程［13］。因此，GIST 被認為是一種潛在的惡性腫瘤。GIST 不分為良性或惡性，而是根據其惡性腫瘤的臨床風險進行分層：極低、低、中或高。外科切除是治療局限性GIST 的主要方法。然而即使腫瘤完全切除，仍有至少一半的胃腸道間質瘤患者術后會復發。盡管已證明酪氨酸激酶抑制劑可為轉移患者提供持續的疾病管理［14］，但無轉移的小GIST 外科切除術是永久治愈的唯一有希望的治療方法。早期診斷、早期切除是治療GIST 的最佳策略。然而，在內窺鏡檢查中，GIST 經常被檢測為SEL。SEL 的鑒別診斷范圍很廣，可以包括胃腸道外壓迫、靜脈曲張、異位胰腺和各種腫瘤，包括GIST、SEL 樣癌、平滑肌瘤、神經鞘瘤和脂肪瘤［15］。因此，探尋可用于診斷GIST 及危險性分級的有效指標具有重要意義。

超聲內鏡是評估GIST 的有價值的成像工具，因為它可以顯示與正常胃壁的第四低回聲層（固有肌層）相鄰的低回聲病變。目前已經有一些關于使用EUS 鑒別GIST 和良性間質腫瘤的研究［16］，但是，由于主觀解釋EUS 圖像是觀察者之間的一致性較差，在分析此類腫瘤的特征方面存在局限性。數字圖像由像素組成，像素是構成二維圖片的基本元素。在數字圖像分析中，使用紋理分析來計算像素的分布和空間變化以提取有用的數據，因此，數字圖像分析可提供有關EUS 圖像的客觀信息，從而可以減少在觀察者之間和觀察者內部主觀性誤差。本研究通過Photoshop 將超聲內鏡圖像量化，以灰度平均值表示回聲強度，灰度標準偏差表示回聲均勻度，結果表明，GIST 組灰度平均值和灰度標準偏差顯著高于對照組，并且與患者腫瘤直徑、核分裂數、危險度分級相關，同時灰度平均值和灰度標準偏差對GIST 診斷和危險性分級的AUC 值分別為0.841、0.743和0.822、0.746，提示灰度平均值和灰度標準偏差能有效代表超聲內鏡結果，且能較好的對GIST 進行診斷和分級，與前人研究結果相似［8］。

Ki67 是一種核增殖相關抗原，存在于活躍增殖的細胞中。它在細胞周期的生長和合成階段表達，但不在G0 階段（靜止階段）表達。Ki67 的預后價值已經在許多研究中被研究，它作為一個可靠的標志物已經在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、宮頸癌和結直腸癌中被證實［17-19］。因此，腫瘤細胞增殖標志物Ki67 可能是GIST 中有用的預后因素。到目前為止，已有多項研究報道了Ki67表達與GIST 惡性風險之間的相關性。LiH 等［20］報道Ki67 指數與GIST 危險分層和核分裂數呈正相關，并與CT 成像的腫瘤大小、輪廓、邊緣相關；Zhou Y 等［21］報道中、高危GIST 患者中Ki67 高表達率多于低危GIST患者，Ki67 高表達可能是惡性GIST 轉化風險的有用標志；Segales-Rojas P 等［22］報道Ki67 指數與GIST 復發無關。由于研究結果相互矛盾，樣本量有限，Ki67 在預測GIST 惡性腫瘤風險方面的意義仍有爭議。在本研究中，GIST 組Ki-67 陽性細胞率顯著高于對照組，并且與患者腫瘤直徑、核分裂數、危險度分級相關，對GIST診斷和危險性分級的AUC 值分別為0.785、0.794，表明GIST 患者腫瘤惡化程度高于對照組，與現有認知一致，Ki-67 表達情況可作為對GIST 進行診斷和分級的有效指標。

DOG1 屬于鈣離子激活的氯離子通道（CaCC）蛋白，由于其在大部分GIST 中表達而被證明是重要的診斷標記。CaCCs 在多種組織中表達，并且是正常生理功能的必要調節劑，包括神經元興奮性、平滑肌細胞收縮、上皮液分泌和胃腸蠕動［23］。具體而言，DOG1 已顯示為電壓敏感且被配體激活的離子通道，可被增加的細胞內游離Ca2+激活［24］。越來越多的證據表明，DOG1 與腫瘤發生、癌癥進展、轉移和細胞存活［25-27］。在GIST 中，DOG1 高表達與預后不良有關，其在循環腫瘤細胞中的高水平可預示復發［28］。在本研究中，GIST 組DOG1 陽性細胞率顯著高于對照組，但與患者腫瘤直徑、核分裂數、危險度分級無關，對GIST 診斷和危險性分級的AUC 值分別為0.835、0.687，表明DOG1 表達檢測在診斷GIST 的效能高于診斷GIST 危險性分級，與艾力·賽丁等［29］研究一致。

在本研究中，ROC 曲線分析表明，超聲內鏡聯合Ki-67、DOG1 表達對GIST 診斷和危險性分級的AUC值高于單獨診斷，效能更高。提示臨床中可檢測三者指標以綜合評估患者病情，盡早進行干預。本研究也存在一定的局限性，研究樣本量較少，需要進一步擴大樣本進行研究分析；同時本研究缺乏長期隨訪，未對患者預后進行分析。

綜上所述，GIST 患者超聲圖像顯示回升強、不均勻程度高，Ki-67、DOG1 表達陽性細胞率高，對患者進行超聲內鏡、Ki-67 和DOG1 表達檢測有助于預測病情嚴重程度。