一種含精氨酸和抗氧化成分的膠囊對糖尿病小鼠糖脂代謝改善作用的研究

宋藝鳴， 郭佳帥， 田 甜， 左媛媛， 常彥忠， 趙保路， 于 鵬

(河北師范大學 生命科學學院，河北 石家莊 050024)

糖尿病是全球性的常見病，是一種以高血糖為特征的代謝性疾病[1].在經濟高速發展、生活方式改變和社會老齡化等多種因素影響下，全球范圍內糖尿病患病率逐年遞增.據估計，2019年全球有4.88億(20～99歲)糖尿病患者，占人口的9.5 %[2]，其中，65～99歲人群中有1.36億糖尿病患者(占該人群人口數20 %)，預計到2030年，65～99歲人群中約有1.95億糖尿病患者，到2045年，高齡人群糖尿病患者將達到2.76億[3].預計到2045年，20～99歲糖尿病患者將增加到6.93億.此外，估計有3.74億人的糖耐量異常[4]，中國的糖尿病患病人數已躍居世界前列，成年糖尿病患者超過1億[3,5].高血糖和糖尿病會引發重要的社會健康問題，損傷人體心臟、全身血管、神經系統、腎臟、眼睛和足等，造成心臟病、腦中風、失明、下肢壞死等繼發性疾病，嚴重影響患者的身心健康[6-9].

根據世界衛生組織的糖尿病診斷和分類標準，糖尿病在病因上分為4種類型：Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)、其他特定類型的糖尿病和妊娠糖尿病[10].其中T2DM所占的比例最高，發病機理一般為胰島素分泌不足或胰島素作用途徑受損導致胰島素抵抗，所引發的嚴重并發癥給患者造成極大痛苦.一旦診斷出高血糖或糖尿病，就需要進行口服降糖藥或注射胰島素等治療，但是隨著時間的延長，糖尿病會進一步危害心血管和腎臟，并且降血糖藥物的使用和花費呈現逐年增加趨勢[1].事實上，將近一半的糖尿病患者未能及時診斷，因此，預防高血糖將成為維持健康的首選策略.

穆拉德東箭牌納歐膠囊(國食健字G20160036，簡稱納歐膠囊)是一種以L-精氨酸、L-谷氨酰胺、?；撬?、維生素C、維生素E等為主要成分的保健品，含有合成一氧化氮(NO)的底物及多種抗氧化成分.有研究表明，高血糖引起的線粒體功能障礙和內質網應激有關，促進活性氧(ROS)的積累，ROS的增加引起氧化應激進而誘導細胞凋亡，并損害NO的釋放，最終促進了糖尿病并發癥的發生和發展，而降低糖尿病患者的氧化應激就能緩解高血糖的癥狀[11-12].L-精氨酸是NO合成的唯一底物，在年輕健康的成年人中，L-精氨酸是內源性產生的，但是病理狀況可能導致L-精氨酸的缺乏[13]，已有研究顯示長期服用L-精氨酸可改善心血管疾病.目前，L-精氨酸已經作為一種膳食營養增補劑被廣泛使用.谷氨酰胺是一種哺乳動物非必需氨基酸，維生素C(又稱L-抗壞血酸)和維生素E(又稱生育酚)是具有強抗氧化能力的維生素，?；撬峋哂袕V泛的生理藥理作用，研究表明這些成分均有調節機體糖脂代謝、抗炎癥和抗氧化能力，對維持機體正常生理功能具有重要作用[14-16].

鑒于上述研究進展和納歐膠囊所含主要成分，推測納歐膠囊可能具有降低血糖和預防糖尿病的作用.因此設計了如下實驗，以高熱能飼料飼喂小鼠并腹腔注射一次四氧嘧啶使其胰島受損，從而制備糖尿病小鼠模型，并灌胃不同劑量的納歐膠囊溶液，通過檢測小鼠空腹血糖、糖耐量、血清胰島素、胰島素抵抗水平、血清膽固醇和鐵代謝等指標，探討了納歐膠囊對糖脂代謝紊亂小鼠的降血糖作用.

1 實驗設計

1.1 材料及設備

1.1.1 試劑

穆拉德東箭牌納歐膠囊(廣州三三醫藥生物科技有限公司)，原料主要成分有L-精氨酸、L-谷氨酰胺、?；撬?、維生素C、維生素E、檸檬酸鋅、硒化卡拉膠.標志性成分及含量為每100 g含L-精氨酸32 g、L-谷氨酰胺17 g、?；撬?8 g、維生素C 9 g、維生素E 2 g、鋅0.5 g、硒2 mg.四氧嘧啶(A7413，美國Sigma)，葡萄糖(D8150，北京索萊寶)，轉鐵蛋白受體(transferrin receptor 1,TfR1)抗體(13-6800，美國Thermo)，β-actin抗體(MA1-744，美國Thermo)，鐵蛋白輕鏈(light chain of ferritin,FtL)抗體(109373，美國Abcam)和鐵蛋白重鏈(heavy chain of ferritin,FtH)抗體(183781，美國Abcam)，其他均為國產分析純試劑.

1.1.2 儀器

Synergy H4多功能酶標儀(美國Biotech)，三諾血糖儀及血糖試紙(中國長沙)，臺式低溫超速離心機(美國Beckman)，恒冷箱冰凍切片機(德國Leica)，Milli-Q超純水系統(美國Millipore)等.

1.1.3 試劑盒

小鼠胰島素ELISA檢測試劑盒(上海Biotech)，總膽固醇測試盒(A111-1-1南京建成)，油紅O染液(G1260，北京索萊寶).

1.1.4 飼料

小鼠維持飼料(NIH31)和高熱能飼料(D19061901)購自常州鼠一鼠二生物科技有限公司.高熱能飼料主要含豬油10 %、蔗糖15 %、蛋黃粉15 %、酪蛋白5 %、膽固醇1.2 %、膽酸鈉0.2 %、碳酸氫鈣0.6 %、石粉0.4 %和小鼠維持飼料52.6 %.

1.2 實驗動物及分組

6～8周清潔級BALB/c雄性小鼠72只，購自河北醫科大學動物中心.分組及處理情況見表1.

表1 小鼠分組及處理情況Tab.1 Mice Groups and Treatment

1.3 模型構建及實驗方法

1.3.1 正常動物降糖實驗

6～8 周BALB/c雄性小鼠禁食4 h(不禁水)，取尾靜脈血測試空腹血糖，將空腹血糖水平相同的小鼠隨機分為1個對照組和1個高劑量組，每組12只.用維持飼料喂養，對照組給予無菌水，高劑量組給予用無菌水配制的高劑量納歐膠囊，按每天2.5 mg/g(體質量)，連續灌胃30 d，禁食4 h后測定2組小鼠空腹血糖值.

1.3.2 四氧嘧啶誘導胰島素抵抗糖脂代謝紊亂小鼠模型的建立

根據中華人民共和國衛生部《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003)，選擇6～8 周BALB/c雄性小鼠，普通維持料適應飼養3～5 d，禁食4 h后取尾靜脈血，測定空腹血糖；給予葡萄糖2.5 mg/g(體質量)，0.5，2 h后，再分別測定血糖值，作為該批次動物血糖基礎值.以0，0.5 h血糖水平分組，每組12只，3個高血糖模型組加納歐膠囊劑量組灌胃給予下列無菌水配制的不同質量濃度納歐膠囊：低劑量配方組0.1 mg/g·d、中劑量配方組0.5 mg/g·d、高劑量配方組2.5 mg/g·d，空白對照組和模型對照組給予同體積無菌水，連續灌胃33 d.各組給予維持料飼養，7 d后模型對照組和3個劑量組更換高熱能飼料，飼喂21 d后，模型對照組和3個劑量組禁食24 h(不禁水)，腹腔注射四氧嘧啶120 mg/kg(體質量).之后繼續給予高熱能飼料喂飼3～5 d.各組動物禁食4 h后，取血、下丘腦和肝組織檢測各項指標.

1.4 空腹血糖和糖耐量的測定

各組小鼠禁食4 h，取尾靜脈血，測定空腹血糖值，灌胃不同質量濃度納歐膠囊劑量組和灌胃等體積無菌水的模型對照組，15～20 min后各組經口給予葡萄糖2.5 mg/g(體質量)，0.5，2 h后測定各組口服葡萄糖后的血糖值，計算血糖下降率和血糖曲線下面積：

血糖下降率=(實驗前血糖值-實驗后血糖值)/實驗前血糖值×100 %，

血糖曲線下面積=(0 h血糖值+0.5 h血糖值)×0.5/2+(2 h血糖值+0.5 h血糖值)×1.5/2.

1.5 胰島素水平的測定

各組小鼠禁食4 h，內眥取血，靜置1 h，離心(離心力2 000 g，20 min，4 ℃)后取上清液備用.按照試劑盒說明書，測定各組小鼠血清胰島素水平，計算胰島素抵抗指數，觀察各組胰島素抵抗情況：

胰島素抵抗指數≈血糖×胰島素/22.5.

1.6 總膽固醇(T-CHO)的測定

根據試劑盒檢測說明書，檢測各組小鼠血清膽固醇含量.

1.7 蛋白免疫印跡

小鼠經生理鹽水灌流后取下丘腦和肝臟組織，根據實驗室已有技術進行蛋白免疫印跡(western blotting)[17].將組織加入含蛋白酶抑制劑-苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA(radio-immunoprecipitation assay)蛋白裂解液提取總蛋白，將組織置于冰水混合物環境下，用細胞超聲破碎儀反復操作6次對細胞進行破碎，然后12 000 g，4 ℃，離心20 min，取上清液;然后，用BCA法測定蛋白質濃度，取30 μg總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，100V,70 min恒壓轉膜后進行免疫印跡.一抗TfR1(1∶5 000)和β-actin(1∶10 000)在4 ℃下孵育過夜，辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗室溫孵育1.5 h，ECL發光液顯色免疫印跡的條帶；最后用美國通用化學發光儀獲取圖像，用Image Lab 5.1軟件分析條帶光密度值.

1.8 油紅O染色

小鼠經左心室灌流無菌、冷生理鹽水沖洗血液后，改用4 %多聚甲醛和0.1 mol/L磷酸緩沖液進行灌流固定，然后取材小鼠肝臟組織，繼續進行后固定處理；肝組織塊經30 %蔗糖浸泡沉底后，進行恒冷箱冰凍切片，厚度7 μm，涂于載玻片上.根據飽和油紅O染色試劑盒說明書進行操作，用60 %異丙醇浸洗；用油紅O工作液(飽和油紅O染液與蒸餾水3∶2混合)染液染色10 min；再用60 %異丙醇分化至間質清晰；用蒸餾水洗片后，用蘇木素染液染色2 min顯示細胞核；最后蒸餾水洗片后用甘油明膠封片.蔡司顯微鏡照相獲得肝組織油紅O染色圖片.

1.9 數據處理及統計學分析

采用統計學軟件(graphpad prism6)對所得數據進行統計分析，并做柱狀或散點圖.數據均表示為平均值±標準差(SD)，兩組之間差異采用非配對的T檢驗(雙尾檢驗)，P<0.05為顯著差異，P<0.01為極顯著差異.

2 實驗結果

2.1 納歐膠囊可顯著降低糖代謝紊亂小鼠的空腹及餐后血糖

與空白對照組相比，糖尿病模型組小鼠空腹血糖、灌糖后0.5 h、灌糖后2 h的血糖值顯著升高，分別升高29.2 %，80.1 %和59.6 %,表明小鼠模型建立成功(圖1).給模型小鼠灌胃納歐膠囊后，中劑量納歐膠囊能顯著降低糖尿病小鼠空腹血糖(下降10.3 %)，并明顯降低了模型小鼠餐后0.5 h血糖(下降19.4 %).中劑量和高劑量納歐膠囊均能降低模型小鼠餐后0.5 h血糖，尤其是高劑量納歐膠囊的效果更加顯著(血糖下降40.4 %).低、中、高3種不同劑量的納歐膠囊均未對糖尿病小鼠餐后2 h的血糖值產生明顯效果(圖1).血糖下降率與血糖值的變化一致(圖2).

n=8～12,*表示P<0.05，**表示P<0.01.圖1 不同劑量納歐膠囊對模型小鼠空腹血糖和糖耐量的作用Fig.1 The Fasting Blood-glucose and Glucose Tolerance in Diabetes Mice Administrated with Different Dosage of NO Capsule Solution

n=8～12,*表示P<0.05，**表示P<0.01.圖2 不同劑量納歐膠囊對模型小鼠血糖下降率的影響Fig.2 The Reduction of Blood-glucose in Diabetes Mice with Intragastric Administration of NO Capsule Solution

2.2 納歐膠囊可使糖代謝紊亂小鼠的血糖曲線下面積減少

由圖3可知，與空白對照組相比，糖尿病模型對照組小鼠的血糖曲線下面積顯著增加(增加56.4 %)，表示模型組小鼠出現糖代謝紊亂現象.經過灌胃納歐膠囊溶液的處理，與模型對照組相比，服用高劑量納歐膠囊的糖代謝紊亂小鼠血糖曲線下面積明顯降低(下降28.1 %)，說明納歐膠囊對糖代謝紊亂小鼠具有明顯的降血糖作用.

n=8～12，**表示P<0.01.圖3 不同劑量納歐膠囊對糖代謝紊亂小鼠血糖曲線下面積的影響Fig.3 Effects of NO Capsule Solution on the Area of Blood Glucose Curve in Mice with Diabetes

2.3 納歐膠囊對小鼠的血清胰島素及胰島素抵抗指數無影響

胰島素水平或胰島素抵抗指數的變化是糖尿病或高血糖的一個重要指標，由圖4a可見，糖代謝紊亂模型小鼠的胰島素含量并無改變.進一步檢測納歐膠囊對胰島素水平的影響，發現不同劑量的納歐膠囊對糖尿病模型小鼠血清胰島素含量無影響；然而，模型對照組的胰島素抵抗指數相對于空白對照組明顯上升(上升37 %)，表明模型對照組小鼠出現了胰島素抵抗，但不同劑量的納歐膠囊對胰島素抵抗指數無明顯影響(圖4b).

n=8～12，**表示P<0.01.圖4 不同劑量納歐膠囊對小鼠血清胰島素及胰島素(a)抵抗指數(b)的影響Fig.4 Effects of NO Capsule Solution on the Insulin Levels(a) and Insulin Resistance Index(b) in the Serum of Mice with Diabetes

2.4 高劑量納歐膠囊對正常小鼠空腹血糖無影響

為了探究單純的納歐膠囊是否對正常小鼠血糖產生影響，使用高劑量納歐膠囊溶液灌胃空白對照組小鼠，測定空腹血糖，結果發現，與空白對照組小鼠相比，高劑量的納歐膠囊對正常小鼠的空腹血糖值無明顯影響(圖5).

n=11～12，P=0.092 9.圖5 高劑量納歐膠囊對正常小鼠空腹血糖的影響Fig.5 The Fasting Blood-glucose in Healthy Wild Type Mice with Intragastric Administration of high dose of NO Capsule Solution

2.5 納歐膠囊可明顯降低糖脂代謝紊亂小鼠血清總膽固醇

高熱能飼料及腹腔注射四氧嘧啶的小鼠發展成了糖尿病小鼠，為了探究此小鼠的脂代謝變化，檢測了血清總膽固醇含量.由圖6可知，糖尿病模型對照組小鼠的血清總膽固醇含量相較于空白對照組顯著增加(增加159.2 %)，說明該模型組小鼠脂代謝紊亂.進一步探究納歐膠囊是否對模型小鼠脂代謝具有改善作用，發現不同劑量的納歐膠囊均能顯著降低模型小鼠的血清總膽固醇含量，并且中劑量的作用最為顯著(約35.1 %).

**表示P<0.01，n=8～11.圖6 不同劑量納歐膠囊對糖脂代謝紊亂小鼠血清總膽固醇的影響Fig.6 The Level of Total Cholesterol in Serum of Diabetic Mice Treated with Intragastric Administration of NO Capsule Solution

2.6 納歐膠囊能降低糖脂代謝紊亂小鼠的血清鐵水平

為了探究糖脂代謝變化對鐵代謝的影響，以及納歐膠囊是否對鐵代謝有作用，進一步檢測了不同組別小鼠血清鐵水平.如圖7所示，與空白對照組相比，模型組小鼠的血清鐵含量顯著升高(升高53.9 %)，表明模型組小鼠出現了鐵代謝異?，F象.灌胃了低、中劑量的納歐膠囊的模型組小鼠血清鐵含量明顯下降(分別下降32 %和30.1 %)，表明納歐膠囊能降低糖脂代謝紊亂小鼠增加的血清鐵水平，從而具有維持機體鐵穩態的效果.但是，服用高劑量納歐膠囊的模型組小鼠，血清鐵含量反而有升高的趨勢，表明在使用納歐膠囊降低血清鐵水平和降血糖的同時，還要控制其用量.

**表示P<0.01，n=8～11.圖7 不同劑量納歐膠囊對糖脂代謝紊亂小鼠血清鐵的影響Fig.7 The Level of Serum Iron of Diabetic Mice Treated with Intragastric Administration of NO Capsule Solution

2.7 糖脂代謝紊亂模型小鼠下丘腦及肝臟鐵代謝相關蛋白的表達變化

由于糖脂代謝紊亂模型組小鼠血清鐵水平發生異常改變，鐵代謝與糖代謝有著密切的聯系，而下丘腦對糖代謝的調控作用至關重要，肝臟作為儲存糖原器官的同時也對機體維持鐵穩態發揮關鍵作用，因此，本研究檢測了下丘腦和肝臟鐵代謝相關蛋白在糖脂代謝紊亂模型小鼠中的變化.結果發現(圖8)，模型對照組小鼠下丘腦中負責鐵攝取的蛋白TfR1表達沒有變化，細胞內的鐵儲存蛋白FtL，FtH的表達也沒有明顯變化而模型對照組小鼠肝臟TfR1蛋白表達出現了下降的趨勢.這可能是由于機體血清鐵水平雖然發生改變，但不同組織器官響應機體血清鐵水平變化的時長不同，所以其鐵代謝相關蛋白的表達變化不盡相同.

a.下丘腦FtL,FtH和TfR1蛋白表達及統計； b.小鼠肝臟TfR1蛋白的表達及統計.圖8 糖脂代謝紊亂模型小鼠下丘腦及肝臟鐵代謝相關蛋白的表達Fig.8 The Expression of Iron Metabolism Related Protein in Hypothalamus and Liver of Mice with Diabetes

2.8 納歐膠囊可適當抑制糖脂代謝紊亂模型小鼠肝臟脂質增加

肝臟是蛋白質合成、糖代謝和脂代謝的重要器官，從組織學水平檢測小鼠肝組織形態學的變化,結果顯示糖脂代謝紊亂模型組小鼠出現了嚴重的肝臟腫大且組織粘連.由圖9結果可見，正?？瞻讓φ战M小鼠肝組織內油紅O染色細胞數量較少；糖脂代謝紊亂模型組小鼠肝細胞內出現大量油紅O染色的細胞，表明脂質蓄積嚴重；灌胃中劑量和高劑量納歐膠囊的模型小鼠肝組織內油紅O染色變少，表明脂質含量較模型對照組和低劑量組明顯減少.此結果證明了糖脂代謝紊亂模型小鼠的肝臟受到了嚴重損傷，而中、高劑量納歐膠囊起到降低脂質蓄積的作用.

圖9 不同劑量納歐膠囊對糖脂代謝紊亂小鼠肝臟組織結構損傷的改善作用Fig.9 The Damaged Structure of Liver Was Alleviated in Diabetic Mice with Intragastric Administration of NO Capsule Solution

3 討 論

采用飼喂高熱能飼料及四氧嘧啶誘導構建了糖尿病小鼠模型，該模型小鼠空腹血糖、餐后血糖、血清總膽固醇水平均有明顯上升，胰島素水平不變，胰島素抵抗指數顯著增加，證明小鼠模型構建成功，出現了胰島素抵抗和脂代謝紊亂.同時，給予小鼠不同劑量的納歐膠囊混懸液灌胃一個月以上，觀察納歐膠囊對于糖、脂及鐵代謝的影響.結果顯示，納歐膠囊能明顯降低模型小鼠的高血糖.對于血糖的不同指標影響，不同劑量納歐膠囊表現有所不同：對于空腹血糖的影響，中劑量納歐膠囊顯示有降低效果；對于糖耐量測試，在灌糖后0.5 h，中劑量和高劑量均顯示出顯著的降血糖效果，3種劑量納歐膠囊對于餐后2 h血糖值均無明顯影響，血糖下降率也印證了這一結果.對于血糖曲線下面積而言，高劑量納歐膠囊有明顯的降低高血糖小鼠血糖曲線下面積的作用.對于胰島素含量來說，模型組小鼠和施用不同劑量的模型小鼠顯示出相同的胰島素水平.對于胰島素抵抗指數而言，模型組小鼠出現了胰島素抵抗，但不同劑量的納歐膠囊對胰島素抵抗指數無明顯改善作用.

本實驗的小鼠模型中，對于血清總膽固醇的影響，3種劑量的納歐膠囊均顯示降血脂的趨勢，以中劑量組效果最佳.有研究發現，谷氨酰胺和精氨酸均能增強抗炎癥和抗氧化能力，可改善脂質代謝，降低糖尿病人氧化損傷，對維持機體正常生理功能具有重要作用[14,18].維生素C和維生素E在體內保護細胞免受自由基傷害，促進維生素A在肝內的儲藏，保護肝臟免受損傷[15,19].?；撬峥赏ㄟ^改善氧化應激水平而間接降低胰島素抵抗，改善糖脂代謝[16].因此，上述結果中，納歐膠囊的降血糖和降血脂作用可能是膠囊中有效成分發揮了調節糖脂代謝的保健功能的緣故.

已有報道表明，T2DM患者血清鐵蛋白水平較正常人升高[20].近期的研究報道顯示，鐵超載或鐵缺乏均會增加糖尿病患病的風險[21-22]，表明鐵水平的變化可能與糖尿病的發生發展密切相關.本研究中，糖尿病模型小鼠出現了明顯的血清鐵含量上升，負反饋引起肝臟鐵攝取能力下降，這可能是造成模型小鼠血糖升高的重要原因之一；而調控血糖的下丘腦鐵代謝沒有發生變化，可能是不同器官對代謝變化的響應時間不同所致.模型小鼠服用低、中劑量納歐膠囊可以明顯降低血清鐵含量；然而高劑量納歐膠囊處理的模型小鼠的血清鐵含量并沒有比模型對照組下降.因此，本研究的結果表明，納歐膠囊調節的降血糖作用與其能降低糖脂代謝紊亂小鼠高鐵水平有一定的相關性.但是，高水平的血清鐵對人體健康是一種威脅，雖然高劑量的納歐膠囊對正常小鼠的空腹血糖值并無明顯影響，但血清鐵水平的變化也同時提示，服用納歐膠囊需要注意劑量的選擇.與此同時，該糖尿病模型小鼠的肝臟出現了嚴重的損傷，且肝細胞脂質積累嚴重；中、高劑量的納歐膠囊可在一定程度上改善這種情況，使肝細胞內脂質減少.

綜合考量，納歐膠囊作為一種保健品，對于高血糖、高血脂癥具有一定的輔助降血糖、降血脂作用，但在使用時，需要綜合機體鐵代謝等指標，采用適宜的劑量.

4 結 論

1) 本實驗成功制備了糖尿病小鼠模型，含精氨酸和抗氧化成分的納歐膠囊能降低小鼠空腹血糖、餐后血糖和血糖曲線下面積，因而納歐膠囊具有輔助降血糖的作用.

2) 糖代謝紊亂小鼠血清胰島素水平沒有變化，但有胰島素抵抗現象；而納歐膠囊對小鼠的血清胰島素及胰島素抵抗指數無影響.

3) 糖代謝紊亂小鼠血清總膽固醇水平顯著增加，納歐膠囊可明顯降低糖脂代謝紊亂小鼠血清總膽固醇含量.

4) 糖脂代謝紊亂小鼠血清鐵水平顯著增加，納歐膠囊能顯著降低血清鐵水平；糖脂代謝紊亂小鼠以及納歐膠囊對下丘腦轉鐵蛋白受體和鐵蛋白表達沒有影響.因此，糖脂代謝紊亂小鼠不同組織器官的鐵代謝變化程度不同，這可以作為納歐膠囊服用劑量的參考指標.

5) 納歐膠囊可適當抑制糖脂代謝紊亂模型小鼠肝臟脂質的增加.