circ_0091581靶向miR-136對皮膚鱗狀細胞癌細胞生物學行為的影響

周 鈺，黎曉紅，袁雪萍，段亞菊，湯舒玲，羅 詠，王 簡

0 引 言

類皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC)惡性程度高，腫瘤細胞增殖、轉移等與CSCC發生及發展密切相關，分子靶向治療成為治療CSCC的潛在治療方式[1-2]。環狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類單鏈非編碼RNA，在腫瘤發生和發展中起關鍵作用[3]。據報道，circRNA在CSCC中表達異常，并可能作為CSCC治療的潛在靶點[4]。circ_0091581是一種在肝細胞癌中高表達的circRNA，對肝細胞癌細胞增殖及轉移有促進作用，并可抑制細胞凋亡[5]。但circ_0091581與CSCC相關研究報道相對較少。Circular RNA Interactome預測顯示circ_0091581與miR-136存在結合位點。研究表明miR-136-5p在CSCC中表達下調[6]。因此，本研究主要探討circ_0091581是否可通過靶向調控miR-136而調節CSCC細胞生物學行為。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 臨床資料收集2019年10月至2020年2月本院收治的39份CSCC患者的癌組織及癌旁組織標本，保存于-80℃冰箱。所有標本均經病理診斷確診為CSCC。

1.1.2試劑人CSCC細胞SCL-1購自美國ATCC；反轉錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購自北京天根生化；si-NC、si-circ_0091581、miR-136 mimics、miR-NC、anti-miR-136、anti-miR-NC購自廣州銳博生物；甲基噻唑基四唑(MTT)、細胞凋亡檢測試劑盒、Transwell小室購自北京Solarbio。

1.2方法

1.2.1 實驗分組于6孔板接種1×105個SCL-1細胞。參照美國Thermo Fisher公司的Lipofectamine2000說明書，將si-NC、si-circ_0091581、miR-NC、miR-136 mimics、si-circ_0091581與anti-miR-NC(共轉染)、si-circ_0091581與anti-miR-136(共轉染)分別轉染至融合至70%的SCL-1細胞，分別記為si-NC組、si-circ_0091581組、miR-NC組、miR-136組、si-circ_0091581+anti-miR-NC組、si-circ_0091581+anti-miR-136組。

1.2.2qRT-PCR檢測基因的表達水平CSCC組織、癌旁組織與各組SCL-1細胞的總RNA通過Trizol試劑提取，反轉錄合成cDNA，通過SYBR Green試劑盒行PCR擴增反應檢測circ_0091581、miR-136相對表達量。

1.2.3甲基噻唑基四唑(MTT)檢測細胞增殖于96孔板中接種各組SCL-1細胞(3×103個)，用MTT溶液(20 μL/孔)與SCL-1細胞反應4 h，以DMSO(150 μL/孔)振蕩孵育5 min終止反應，應用酶標儀讀取SCL-1細胞吸光度(A)值，波長490 nm。

1.2.4平板克隆形成實驗各組SCL-1細胞接種于6孔板(500個/孔)，于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱內培養14 d棄培養基，預冷PBS洗滌，500 μL甲醇固定SCL-1細胞20 min，400 μL 1%結晶紫染色液染色SCL-1細胞15 min，觀察克隆形成數。

1.2.5Transwell實驗檢測細胞遷移取各組SCL-1細胞接種于上室(1×105個/孔)，將600 μL含10%胎牛血清的培養液加至下室，于37℃、體積分數5%CO2培養箱內培養48 h，遷移的細胞固定后用1%結晶紫染色，10 min后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，于顯微鏡下統計穿膜細胞數。

1.2.6流式細胞術檢測細胞凋亡率收集各組SCL-1細胞參照細胞凋亡檢測試劑盒的說明，重懸于500 μL結合緩沖液，之后與Annexin V-FITC和PI暗室反應10 min，于FACS Calibur流式細胞儀分析凋亡率。

1.2.7雙熒光素酶報告實驗檢測circ_0091581與miR-136的靶向關系用Lipofectamine2000在SCL-1細胞中共轉染WT-circ_0091581與miR-NC或miR-136 mimics、以及共轉染MUT-circ_0091581與miR-NC或miR-136 mimics。轉染48 h后雙熒光素酶活性檢測系統測量SCL-1細胞的熒光素酶活性。

2 結 果

2.1 circ_0091581和miR-136在CSCC組織中的表達circ_0091581在CSCC組織中的表達量(2.45±0.37)較癌旁組織(0.93±0.16)增多(P<0.05)，miR-136在CSCC組織中表達量(0.43±0.06)較癌旁組織(0.99±0.11)降低(P<0.05)。

2.2下調circ_0091581對SCL-1增殖、凋亡、遷移的影響與si-NC組比較，si-circ_0091581組miR-136的表達量和細胞增殖抑制率升高(P<0.05)，circ_0091581表達量、克隆形成數和遷移細胞數均降低(P<0.05)，細胞凋亡率升高(P<0.05)，見圖1，表1。

a：下調circ_0091581處理后SCL-1凋亡的檢測；b：下調circ_0091581處理后SCL-1遷移的檢測

表 1 下調circ_0091581抑制SCL-1增殖、遷移及誘導凋亡

2.3circ_0091581和miR-136靶向關系circ_0091581與miR-136存在結合位點，見圖2。雙熒光素酶結果顯示，與miR-NC和WT-circ_0091581共轉染細胞的熒光素酶活性(1.02±0.11)相比，miR-136和WT-circ_0091581共轉染細胞的熒光素酶活性(0.38±0.03)顯著降低(P<0.05)；與miR-NC和MUT-circ_0091581共轉染細胞的熒光素酶活性相比，miR-136和MUT-circ_0091581共轉染細胞的熒光素酶活性(0.98±0.08)差異無統計學意義(P>0.05)。表明circ_0091581可靶向結合miR-136。

2.4miR-136對SCL-1增殖、凋亡、遷移的影響miR-136組細胞增殖抑制率高于miR-NC組(P<0.05)，克隆形成數和遷移細胞數少于miR-NC組(P<0.05)，細胞凋亡率高于miR-NC組(P<0.05)，見圖3，表2。

2.5抑制miR-136對下調circ_0091581處理的SCL-1增殖、凋亡、遷移的影響si-circ_0091581+anti-miR-136組細胞增殖抑制率比si-circ_0091581+anti-miR-NC組降低(P<0.05)，克隆形成數和遷移數比si-circ_0091581+anti-miR-NC組增多(P<0.05)，細胞凋亡率比si-circ_0091581+anti-miR-NC組降低(P<0.05)，見圖4，表3。

圖 2 circ_0091581和miR-136的互補序列

a：miR-1361處理后SCL-1凋亡的檢測；b：miR-136處理后SCL-1遷移的檢測

表 2 miR-136抑制SCL-1增殖、遷移及誘導凋亡

表 3 抑制miR-136可逆轉下調circ_0091581對SCL-1增殖、凋亡、遷移的作用

3 討 論

circRNA通過與miRNA結合而抑制靶基因表達發揮作用[7]，并參與CSCC發生及發展過程，還可能作為CSCC診斷的潛在生物學標記物及治療的潛在靶點[8-11]。

circ_0091581在膠質瘤[12]、肝細胞癌[13]中表達上調，下調其表達可抑制細胞增殖、遷移及侵襲。本研究數據表明，circ_0091581在CSCC組織中高表達，暗示circ_0091581在CSCC發生及發展過程中可能發揮癌基因作用。本研究隨后利用si-circ_0091581干擾其在CSCC細胞中的表達，發現干擾circ_0091581后，CSCC細胞增殖、克隆形成及遷移被抑制減弱，細胞凋亡被促進。

本研究初步證實circ_0091581可吸附miR-136，并可充當miR-136的海綿分子。研究表明miR-136在黑素瘤[14]、乳腺癌[15]、子宮內膜癌[16]、胃癌[17]中表達水平降低，上調其表達可減弱細胞增殖、遷移及侵襲能力。本研究結果顯示，干擾circ_0091581表達可促進miR-136表達，circ_0091581可通過靶向調控miR-136的表達而促進CSCC細胞增殖及轉移進而參與CSCC發生及發展過程。

綜上所述，CSCC組織中circ_0091581表達上調，miR-136表達下調，circ_0091581可通過充當miR-136的海綿分子而調節CSCC細胞生物學行為，包括細胞增殖、克隆形成、遷移及凋亡，還可為CSCC的治療提供潛在靶點。但circ_0091581是否可通過靶向調控其他miRNA而參與CSCC發生及發展過程尚需進一步探究。