以2b-RAD技術構建凡納濱對蝦遺傳連鎖圖譜及生長性狀QTL定位

王怡悅，劉紅*，徐姚

（1上海水產養殖工程技術研究中心（上海海洋大學），上海 201306；2上海市水產動物良種創制與綠色養殖協同創新中心（上海海洋大學），上海 201306；3水產科學國家級實驗教學示范中心（上海海洋大學），上海 201306）

0 引言

【研究意義】凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）是世界上最重要的養殖蝦種之一，也是目前選擇育種最廣泛的蝦種。凡納濱對蝦因其廣鹽性特性已在全球海水、淡水等水域大規模養殖，其中淡水養殖具有集約化程度高、便于管理等優點，在凡納濱對蝦養殖生產中的應用越來越廣泛，因此耐低鹽群體經濟性狀的遺傳改良工作顯得十分重要。傳統的選育方法易受環境因素影響，且時間成本高；而分子標記輔助育種（Molecular marker-assisted breeding，MAS）可通過分子標記對目標性狀基因型進行選擇，更準確地定位目的基因，加速遺傳育種進度（熊建華等，2011）。生長相關基因參與調節生物體的生長、發育等過程，通過現代分子生物技術手段對生長性狀相關數量性狀位點（Quantitative trait locus，QTL）進行定位，挖掘與QTL連鎖的生長相關功能基因，對促進性狀改良具有重要意義。遺傳連鎖圖譜在動植物經濟價值相關性狀的QTL和功能性狀鑒定中扮演著重要角色，與大西洋鮭（Salmo salar）、羅非魚（Oreochromis niloticus）等其他水產品種相比，凡納濱對蝦的生長相關標記和基因信息非常有限（Yu et al.，2019）。因此，亟待構建遺傳連鎖圖譜為凡納濱對蝦生長相關基因的篩選及分子標記輔助選育等研究提供理論參考?！厩叭搜芯窟M展】目前，遺傳連鎖圖譜構建及鑒定性狀相關QTL的方法已廣泛應用于各種水生生物育種研究。戴歡等（2017）在半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevi）遺傳圖譜定位到3個與抗哈維氏弧菌病性狀相關的QTL區間；周童（2018）構建了合浦珠母貝（Pinctada fucata）高密度遺傳連鎖圖譜，并根據表型數據定位獲得與7個生長性狀相關的13個主效QTL區間；Liu等（2020a）從烏鱧（Channa argus）遺傳連鎖圖譜的5個連鎖群（Linkage group，LG）中鑒定出14個與體質量和體長相關QTL及1個性別決定QTL。生長相關基因與生物體的生長、發育緊密相關，具體是指與體型大小、體質量、生長速度等性狀調控相關的基因。在現有的凡納濱對蝦遺傳連鎖圖譜研究中，已定位出部分生長相關QTL（Andriantahina et al.，2013；Yu et al.，2015，2019），但有關生長相關基因發掘的研究報道較少。隨著高通量測序技術的快速發展，傳統的擴增片段長度多態性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）、隨機擴增多態性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）及簡單重復序列（Simple sequence repeat，SSR）等分子標記已逐漸被快捷、高效的SNP（Single nucleotide polymorphisms，SNP）分子標記取代（Liu et al.，2020b）。簡化基因組技術2b-RAD是基于IIB型限制性內切酶的大規模SNP分子標記開發和分型手段，具有更加快速、便捷的優點，可低成本獲得目標區域內的SNP標記信息，已廣泛應用于群體遺傳學、遺傳連鎖圖譜及QTL定位等研究領域（胡景杰和任紅艷，2018）。王偉峰等（2019）通過2b-RAD技術對遺傳雌性半滑舌鰨樣本開發大量SNP分子標記，以了解半滑舌鰨當前的群體遺傳結構，結果表明有效群體大小隨其連鎖不平衡程度衰減而呈下降趨勢；Liu等（2020b）以花鱸（Lateolabrax maculatus）全同胞F1家系為作圖群體，基于2b-RAD技術構建了首張花鱸高密度遺傳連鎖圖譜，并鑒定出24個生長相關QTL區間；常雪晴等（2022）利用2b-RAD技術對三門灣海域7種代表性無脊椎動物進行遺傳結構和遺傳多樣性分析，結果發現該海域7個物種的遺傳多樣性水平較低，可能是受人工增殖放流等因素的影響?！颈狙芯壳腥朦c】2b-RAD作為一種改進的測序技術，具有標簽數目可控、分型準確率高的優點（Wang et al.，2012），但至今鮮見基于2b-RAD技術構建凡納濱對蝦遺傳連鎖圖譜的研究報道。相對于選育家系，野生群體具有更豐富的遺傳多樣性及更高的雜合度和等位基因數，因此，構建凡納濱對蝦野生群體遺傳連鎖圖譜，挖掘生長相關基因，對促進凡納濱對蝦經濟性狀改良及其分子標記輔助育種具有重要意義?！緮M解決的關鍵問題】以世代選育耐低鹽家系的凡納濱對蝦與厄瓜多爾野生凡納濱對蝦雜交獲得的子一代及親本為作圖群體，基于2b-RAD技術構建高密度遺傳連鎖圖譜，結合生長性狀表型數據鑒定生長相關QTL區間并對QTL附近基因進行功能注釋，篩選生長相關候選基因；通過測定耐低鹽群體和一般群體差異表達基因的相對表達量，進一步驗證可能與凡納濱對蝦生長性狀相關的候選基因，為后續開展凡納濱對蝦分子標記輔助育種、生長相關功能基因精細定位研究等提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 構建作圖群體及DNA提取

選擇上海海洋大學洋山基地耐低鹽選育凡納濱對蝦（EB）×（CE）為父本、厄瓜多爾野生凡納濱對蝦（Y）為母本，單尾交配，以親本及F1代為作圖群體用于構建遺傳連鎖圖譜。2020年11月獲得的F1代蝦苗在上海海洋大學洋山基地進行養殖，并測量記錄親本的體長及體質量，剪取其附肢置于95%乙醇中，提取DNA，-80℃保存備用。F1代4月齡時隨機選取150尾分別測量并記錄其體長、體質量等信息，用于生長性狀相關QTL分析。剪取肌肉組織分裝于凍存管中，液氮速凍保存，運回實驗室提取基因組DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000檢測DNA質量和濃度，檢測合格的DNA樣品用于下一步測序。

1.2 2b-RAD文庫構建及測序

采用2b-RAD測序方法：以2b-RAD五標簽串聯技術對2個親本及150個F1子代個體的DNA進行測序并構建文庫，所有樣品均采用標準型5'-NNN-3'接頭與酶切標簽連接?；蚪MDNA采用IIB型限制性內切酶進行酶切，酶切產物分別加入5組不同接頭，T4 DNA連接酶連接；通過PCR擴增連接產物，最后根據接頭信息將5個標簽按順序進行串聯；連接產物添加barcode序列，混合文庫。文庫制備完成后進行質量檢測，通過Illumina Hiseq×Ten平臺以Illumina nova為策略進行Paired-end測序。

1.3 數據篩選及基因分型

對原始數據進行質量控制，利用Pear v0.9.6將成對的Raw reads進行拼接，過濾刪除含N堿基比例大于8%和低質量的Reads。依據建庫時各樣品所在位置，提取出各樣品對應的Reads，過濾刪除不含酶切識別位點的Reads，得到各樣品的高質量測序Reads，即為Enzyme reads。利用SOAP將各樣品的Enzyme reads比對至參考基因組（GCF_003789085.1）上進行數據分析，最后各樣品數據經過濾和校正后，利用最大似然法進行SNP標記分型。原始SNP數據按以下標準進行篩選：（1）剔除等位基因只含有1種或大于2的位點；（2）剔除基因組堿基為N和同一位置存在2種分型的位點；（3）篩選掉樣品中基因分型率低于80%的位點；（4）排除包含多個SNP的標簽；（5）選擇出等位基因頻率大于0.05，缺失率小于0.2；（6）保留nn×np（母本雜合子）、lm×ll（父本雜合子）和hk×hk（雙親雜合子）的SNP類型。最后使用SnpEff對獲得的SNP進行注釋分析。

1.4 圖譜構建

篩選父本雜合、母本純合或雜合的位點構建父本圖譜，篩選母本雜合、父本純合或雜合的位點構建母本 圖 譜，JoinMap 5.0設LOD（Logarithm of the odd）為2~15得到父母本圖譜。經連鎖群劃分后對每個連鎖群采用回歸算法進行排序，運用Kosambi函數將重組率轉換為遺傳距離（cM）；最終以MergeMap（http://138.23.178.42/mgmap/）將父母本圖譜合并得到整合圖譜。

1.5 QTL定位

對作圖群體雜交F1代取樣的同時，測量其體質量、全長、體長、頭胸甲長、頭胸甲寬、頭胸甲高、第一腹節長、第一腹節寬、第一腹節高、第二腹節長、第二腹節寬、第二腹節高及尾節長共13個生長相關性狀對應的表型數據。在SPSS 20.0中完成每個性狀的極值、平均值、標準差及性狀間的相關分析。其中體質量表型極端值較多，為使表型分布更接近正態分布，故對該性狀去除極端值前后的表型分別進行分析，最終以14個性狀為數據進行后續分析。結合得到的凡納濱對蝦高密度遺傳圖譜，利用MapQTL 6.0對生長性狀進行QTL定位。數據導入后利用置換檢驗1000次重復，估算單個連鎖群及基因組范圍內α=0.05水平上的LOD閾值，然后以區間作圖法進行QTL分析。

1.6 生長相關候選基因篩選

對獲得的生長性狀相關QTL區間標記上、下游1 kb內基因進行GO功能注釋分析和KEGG信號通路富集分析，篩選出與凡納濱對蝦生長相關的候選基因。根據前期研究已知，在低鹽條件下洋山耐低鹽世代選育群體較對照群體生長更快。為了驗證候選基因在凡納濱對蝦中的表達情況，以洋山耐低鹽世代選育凡納濱對蝦群體為試驗組，選擇與其遺傳關系較遠的凡納濱對蝦群體為對照組，2個群體蝦苗在上海海洋大學金山基地進行生長對比養殖試驗。2個群體仔蝦進行為期7 d的降鹽試驗后，各設3組平行放入鹽度約為1‰的水泥池繼續養殖，養殖期間各池條件保持一致。養殖100 d試驗結束后，每池隨機撈取50尾對蝦測量其體長、體質量，并采集眼柄、肝胰腺、肌肉、鰓、腸道、胃組織等樣品，液氮速凍后分別提取總RNA。以18S為內參基因，進行實時熒光定量PCR檢測，擴增引物見表1，并根據2-ΔΔCt法換算凡納濱對蝦生長相關候選基因的相對表達量。對候選基因在凡納濱對蝦肝胰腺、眼柄、肌肉、鰓、腸道、胃組織中的相對表達量進行分析，篩選相對表達量最高的組織為材料，進一步研究候選基因在低鹽條件生長速度不同群體對蝦中的表達量情況。

表1 4個候選基因及內參基因的實時熒光定量PCR擴增引物序列信息Table 1 Primer sequence information of 4 candidate genes and reference gene in real-time quantitative PCR

2 結果與分析

2.1 2b-RAD測序結果

經2b-RAD測序共產生23.74億條Raw reads，包括母本的1391萬條Raw reads、父本的1391萬條Raw reads及150個F1代的23.46億條Raw reeds（平均每個子代1564萬條Raw reads）。過濾后，選用20億條Clean reads進一步分析，結果表明，親本平均測序深度為17.64倍，F1代平均測序深度為13.60倍。所有樣本的比對率均超過24.00%（表2）。

表2 凡納濱對蝦的2b-RAD測序結果Table 2 2b-RAD sequencing results of L.vannamei

2.2 SNP篩選及遺傳連鎖圖譜構建情況

從2個親本和150個F1代中初步篩選獲得28836個SNPs標記，為增加分型準確率，進一步篩選后獲得6577個SNPs標記。在這些SNPs標記中，劃分出nn×np、lm×ll和hk×hk 3種分離類型。首先分別構建母本和父本各自的遺傳連鎖圖譜，然后整合二者共有的SNPs標記以獲得中性圖譜（圖1），最終構建的凡納濱對蝦遺傳連鎖圖譜包括3136個SNPs標記，可劃分為44個連鎖群?？倛D譜長度為5430.54 cM，平均圖距為1.73 cM（表3）。

表3 凡納濱對蝦遺傳連鎖圖譜信息統計結果Table 3 Statistics of L.vannamei genetic linkage map

圖1 凡納濱對蝦遺傳連鎖圖譜Fig.1 L.vannamei genetic linkage map

2.3 生長性狀QTL定位結果

結合14個生長性狀的表型數據，對所有作圖群體個體進行QTL分析，最終在LG1、LG3、LG4、LG5、LG6、LG8、LG9、LG11、LG13等23個連鎖群上共鑒定出79個QTLs（表4）。LOD范圍為3.00~11.04，可解釋的表型變異值范圍為9.0%~28.8%，其中最主效的QTL為TZ_original.8。采用R語言LinkageMapView包，將QTL區間標注于遺傳連鎖圖譜上，不同顏色代表不同性狀，同顏色的標記分別為QTL區間的左右標記，圖2為TZ.1、TZ.2、TZ.3和TZ.4共4個QTLs在遺傳連鎖圖譜中的位置。

圖2 體質量性狀QTL在遺傳連鎖圖譜中的位置Fig.2 Position of body mass trait-related QTL on the genetic linkage map

表4 凡納濱對蝦生長性狀相關QTL定位信息Table 4 QTL mapping information of growth-related traits of L.vannamei

2.4 候選基因功能分析結果

從52個QTLs定位獲得26個基因，GO功能注釋分析發現這些基因主要注釋到細胞組成、細胞過程、生長、代謝過程及生物調節等功能條目上，而KEGG信息通路富集分析結果表明主要富集在過氧化物酶、RNA降解、軸突指導、神經活性配體—受體相互作用等通路上。根據GO功能注釋及KEGG信號通路富集分析結果，最終選定TOB2、CRAT、CCT6、KLF4共4個基因為凡納濱對蝦生長相關候選基因，具體基因信息見表5。通過為期100 d的凡納濱對蝦養殖試驗，結果（表6）發現試驗組凡納濱對蝦的終末體質量、終末體長、日增重率、體長日增長率及特定生長率均顯著高于對照組凡納濱對蝦（P＜0.05，下同），表明耐低鹽世代選育凡納濱對蝦群體的生長情況優于常規的凡納濱對蝦群體。

表5 凡納濱對蝦生長相關候選基因信息Table 5 Information of growth-related candidate genes of L.vannamei

表6 不同群體凡納濱對蝦養殖100 d后的生長指標Table 6 Growth indexes of L.vannamei of different populations at 100 d of culture

以18S為內參基因，采用實時熒光定量PCR檢測4個候選基因在凡納濱對蝦眼柄、鰓、腸道、胃、肌肉和肝胰腺組織中的相對表達量。結果表明，4個候選基因在6種組織中均普遍表達（圖3），其中，CRAT和TOB2基因在肝胰腺組織中的相對表達量最高，KLF4和CCT6基因則以腸道組織中的相對表達量最高。圖4為4個候選基因在低鹽條件不同生長速度凡納濱對蝦群體中的表達情況，CCT6、KLF4和TOB2基因在試驗組凡納濱對蝦中的相對表達量高于對照組凡納濱對蝦，其中CCT6基因表達差異達顯著水平；對照組凡納濱對蝦中的CRAT基因相對表達量略高于試驗組凡納濱對蝦，但差異不顯著（P＜0.05）。

圖3 4個候選基因在凡納濱對蝦眼柄、鰓、腸道、胃、肌肉及肝胰腺組織中的表達情況Fig.3 Expression of 4 candidate genes in eyestalk，gill，intestine，stomach，muscle，and hepatopancreas of L.vannamei

圖4 4個候選基因在不同凡納濱對蝦群體中的表達情況Fig.4 Expression of 4 candidate genes in different L.vannamei populations

3 討論

3.1 遺傳連鎖圖譜

遺傳連鎖圖譜已成為遺傳學研究的強有力工具，廣泛應用于目的基因定位、比較基因組及分子標記輔助育種等研究領域。與傳統的遺傳圖譜構建方法（RAPD、AFLP和SSR）相比，2b-RAD技術在大規模SNP挖掘和基因分型方面具有高密度、高通量、高效率和低成本等優點；且2b-RAD測序中所有酶切片段均用于測序，從而減少片段選擇導致的部分信息缺失，因其簡單靈活的優點，已廣泛應用于遺傳圖譜構建、群體遺傳學及系統進化研究等。目前，應用2b-RAD技術已成功構建櫛孔扇貝（Chlamys farreri）（Jiao et al.，2014）、白鰱（Hypophthalmichthys molitrix）（Wang et al.，2019）、紅尾鯰（Hemibagrus wyckioides）（Zhou et al.，2021）等水生生物的高密度遺傳連鎖圖譜。王星火等（2021）采用2b-RAD技術對三門灣海域3種優勢魚種進行群體分析，結果表明3種魚類群體的遺傳多樣性總體上處于較低水平，應當加強資源保護，也進一步證實了2b-RAD技術用于群體多樣性分析的可行性。

已構建的凡納濱遺傳連鎖圖譜作圖群體均選用選育家系為親本（表7），而本研究選擇耐低鹽家系與野生蝦為親本構建的F1代群體。野生群體較選育群體的雜合度和等位基因數更高，具有更豐富的多態信息含量。以往的研究主要利用RAPD、AFLP和SSR等方法建立凡納濱對蝦的遺傳圖譜，在圖譜相鄰標記間的平均距離為7.6~17.1 cM（Pérez et al.，2004；張留所，2006；Andriantahina et al.，2013）。本研究采用2個親本及150個F1代共152個凡納濱對蝦個體，基于2b-RAD技術構建遺傳連鎖圖譜，結果發現共有3136個SNPs標記定位在44個連鎖群上，連鎖群數目與已構建凡納濱對蝦圖譜（Yu et al.，2015；Zeng et al.，2020）的連鎖群數目相同，且與凡納濱對蝦單倍體染色體數目（Campos-Ramos，1997）相符合。本研究中的凡納濱對蝦遺傳連鎖圖譜全長5430.54 cM，優于Yu等（2015）、Huang等（2020）所構建的遺傳連鎖圖譜長度（4271.43和4161.55 cM），但精細程度不及這2張遺傳連鎖圖譜，標記平均遺傳距離（1.73 cM）相對更大。圖譜精細程度存在差異的原因可能是構圖群體不同導致遺傳變異情況不同，另一方面可能是構圖群體規模相對偏小。

表7 近十年凡納濱對蝦遺傳連鎖圖譜研究進展Table 7 Advancements in L.vannamei genetic linkage maps in the recent decade

3.2 QTL定位

QTL定位分析可有效識別與動植物重要經濟性狀相關的分子標記，挖掘QTL，利用與目標性狀緊密連鎖的分子標記進行分子標記輔助選擇育種，從而促進對性狀的遺傳改良。近年來，隨著動物基因組研究的快速進展，遺傳連鎖圖譜和QTL定位分析已廣泛應用于水生生物研究領域。Song等（2012）利用94個半滑舌鰨F1子代定位獲得4個生長相關QTLs；Xiao等（2015）選用大黃魚72個F1子代，分別對體質量、全長和體高進行QTL定位，結果得到11個生長性狀相關QTLs；Wang等（2016）利用106個牡蠣F1子代定位到5個生長性狀的27個QTLs，分布于整合圖譜的8個連鎖群上。遺傳標記可直接用于優良品種選育，QTL定位則為這些分子標記的識別提供了有效途徑。本研究結合已構建的遺傳連鎖圖譜，對與凡納濱對蝦生長相關性狀（體長、體質量、頭胸甲長、頭胸甲寬、頭胸甲高、第一腹節長、第一腹節寬、第一腹節高、第二腹節長、第二腹節寬、第二腹節高和尾節長等重要指標）進行QTL分析，探究性狀間的相互關系，確定每個性狀在連鎖群上的位置及效應，以期找到與性狀緊密連鎖的分子標記，為下一步分子標記輔助選擇育種奠定基礎。結果表明，共有79個生長性狀QTLs分散于44個連鎖群上，其中3個QTLs（TZ_original.4、TZ_original.8和TZ_original.14）解釋的表型變異率大于20.0%。Huang等（2020）對凡納濱對蝦體質量性狀進行QTL定位，發現LOD平均值為2.74，PVE平均值為9.65。本研究中的凡納濱對蝦體質量相關QTL的LOD平均值（5.55）和PVE平均值（15.56），均高于Huang等（2020）的研究結果。在連鎖群LG24上定位到所有生長性狀相關QTL，其中體長性狀有2個QTLs位于連鎖群LG24上，表明在凡納濱對蝦育種中其體長、體質量、頭胸甲長、頭胸甲寬、頭胸甲高、第一腹節長、第一腹節寬、第一腹節高等生長性狀間存在較高的表型相關性，某個性狀的選育均會影響另一性狀。此外，本研究中的LOD值范圍為3.00~11.04，體現出較高的定位水平，所定位的QTL均為主效QTL；可解釋的表型變異率范圍為9.0%~28.8%，則表明本研究定位的QTL較準確。

續表4凡納濱對蝦生長性狀相關QTL定位信息Continued Table 4 QTL mapping information of growth-related traits of L.vannamei

3.3 候選基因篩選

數量性狀相關候選基因可通過QTL定位進行挖掘。Huang等（2020）通過dd-RAD測序與QTL標記的對比，結合高pH轉錄組數據挖掘出HIF1B、TAF3、ENPEP、DDR2、SGMS1、H2AFV共6個凡納濱對蝦高pH耐受相關候選基因；Zeng等（2020）使用QTL分析及耐受氨氮能力最高和最低的凡納濱對蝦群體轉錄組進行分析，確定了與氨氮耐受相關的候選基因ATP5M；曹景龍和王衛民（2021）對團頭魴遺傳圖譜進行性別QTL定位，通過對QTL區間內SNP分子標記上、下游基因的篩選和功能注釋，挖掘到DCTN2基因為團頭魴性別決定的重要候選基因；劉峰等（2022）以羅非魚全同胞家系為對象，采用SSR分子標記鑒定出15個羅非魚耐鹽QTLs，發現NKCC2基因位于可解釋19.1%雄性耐鹽差異的QTL區間峰值處，即該基因可作為羅非魚耐鹽選育的重要候選基因。本研究通過GO功能注釋和KEGG信號通路富集分析，分別從QTL區間TZ_original.6、QC.1、TXJK.4和TXJG.2中注釋到CCT6、KLF4、TOB2和CRAT共4個候選基因。

T-復合多肽1ζ亞基（T-complex protein 1 subunit zeta，CCT6）基因編碼含TCP1復合物的伴侶蛋白（Chaperonin containing TCP1 complex，CCT）。CCT是伴侶素家族的重要成員之一，發生異常時會影響細胞骨架的形成和降解。CCT6是一種參與肌動蛋白、微管蛋白和轉導蛋白等各類蛋白結合及介導的伴侶蛋白（段芳蕾等，2011；楊春紅等，2015）。在哺乳動物中，關于CCT6基因的研究已有較多報道，且推測該基因與腫瘤細胞的增殖相關（王廷峰等，2009），但在水產動物研究中鮮見報道。本研究結果表明，從體質量相關QTL（TZ_original.6）中定位到CCT6基因，該QTL可解釋的表型變異為13.8%，LOD為4.83；在凡納濱對蝦眼柄、肝胰腺、鰓、胃、腸道、肌肉等組織中均能檢測到CCT6基因表達，且以腸道中的相對表達量最高，其次是肝胰腺。腸道和肝胰腺作為消化吸收的主要場所，對凡納濱對蝦生長發育至關重要（姜永華等，2003；田娟等，2018）。本研究選擇耐低鹽世代選育凡納濱對蝦群體為試驗組，與常規的凡納濱對蝦群體（對照組）在同一條件進行低鹽養殖試驗，養殖100 d后采集腸道組織檢測CCT6基因表達情況，結果發現耐低鹽世代選育凡納濱對蝦群體的CCT6基因相對表達量顯著高于常規的凡納濱對蝦群體，且對蝦生長指標也優于常規的凡納濱對蝦群體，故推測CCT6基因在凡納濱對蝦生長過程中發揮重要作用，但CCT6基因參與的具體功能和作用機理還需進一步探究。

Krüppel樣 因 子4（Krueppel-like factor luna，KLF4）是轉錄因子Krüppel家族（KLFs）的一員，參與多種細胞增殖、分化和凋亡的調控，在哺乳動物的多種腫瘤細胞轉移中發揮調節作用（龔海英等，2022）。KLF4基因在腸道中高表達，主要調節細胞的增殖與分化，可通過抑制凋亡來促進細胞生存，還參與細胞DNA損傷修復（楊帆和馮心河，2020）。本研究中，KLF4基因在凡納濱對蝦腸道組織中的相對表達量最高，提示KLF4基因可能對腸道組織細胞的增殖、分化產生影響。ErbB2轉錄因子2（Transducer of ErbB2，2，TOB2）編碼的蛋白屬于BTG/TOB增殖蛋白家族，該家族成員基因表達與細胞增殖和細胞分裂周期有關（何洪杰和于景翠，2015）。Suzuki等（2012）研究發現TOB基因有助于維持細胞的存活，降解時會導致DNA損傷，從而引發細胞凋亡；還有研究表明TOB2基因在斑馬魚（Shi et al.，2004；Xiong et al.，2006）、小鼠（Chen et al.，2015）的胚胎發育過程中發揮重要作用。本研究結果表明，TOB2基因在凡納濱對蝦6個不同組織中均有表達，其中以肝胰腺組織中的相對表達量最高，推測TOB2基因對肝胰腺組織細胞的增殖、分化產生影響。肉堿乙酰轉移酶（Carnitine acetyltransferases，CRAT）是能量穩態和脂肪代謝的重要酶類，對于脂肪酸的β-氧化過程必不可少，因此在真核生物的能量代謝中發揮重要作用（Cordente et al.，2004；王會征和蘭玉彬，2020）。CRAT基因功能可解釋本研究中該基因在凡納濱對蝦肝胰腺中的相對表達量最高，與中華絨螯蟹肝胰腺組織中crat基因表達量最高的結果（劉麗等，2018）一致。本研究中，CRAT基因在不同凡納濱對蝦群體中的相對表達量差異不顯著，可能是CRAT基因對低鹽環境的響應不敏感。

4 結論

基于2b-RAD技術構建的凡納濱對蝦遺傳連鎖圖譜鑒定出79個與生長性狀相關的QTLs，并篩選出4個與凡納濱對蝦生長性狀相關的候選基因（CCT6、KLF4、TOB2和CRAT）?？梢?，以2b-RAD技術結合QTL定位能高效、快捷挖掘出凡納濱對蝦生長性狀相關候選基因，為開展分子標記輔助育種、生長相關功能基因精細定位研究等提供技術支持。