幼蟲、青年和成年日本醫蛭不同生長階段差異表達基因比較分析

閆秀營，任可，馬曉聰，單會荃，鄭雅琳，劉慶友*，周維官，鄭景輝*

（1廣西大學動物科學技術學院/亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧 530004；2廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西南寧 530011；3泰國天然水蛭素股份有限公司，泰國曼谷 10700）

0 引言

【研究意義】日本醫蛭作為傳統中藥已有幾千歷史，是《中國藥典》收錄的唯一一個吸食血液的水蛭（王懿等，2021），含有最強凝血酶天然抑制劑——水蛭素（Koeppen et al.，2014），臨床上可用于治療多種疾病，包括高血壓、高脂血、腦梗死及惡性腫瘤等（黃慧等，2021；李曉文等，2021；王懿等，2021）。除此之外，水蛭的免疫系統含有多種具有殺菌作用的肽，可用于研制新一代的抗菌藥物（余米等，2021b）。水蛭的身體和中樞神經系統均能再生，且其神經細胞結構和作用與人類的神經相似，因此常被用作神經生物學領域研究的模式生物（Meiser et al.，2019；Cohen et al.，2020；Heath-Heckman et al.，2021）。近年來，隨著日本醫蛭生存環境的破壞和捕獵數量的增加，野生水蛭數量逐漸減少。日本醫蛭個體小、繁殖慢，養殖經濟效益遠不如其他水蛭（楊謀等，2018；余米等，2019，2021a），其數量已無法滿足市場需求。因此，開展日本醫蛭轉錄組分析，了解其遺傳信息及生長發育的調控機制，對日本醫蛭基因資源的開發利用及藥用品質提升具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】日本醫蛭從幼苗發育生長到成蟲體型大約需要80 d（張海生，2020），但成熟周期較長、繁殖慢，3年生日本醫蛭才開始產卵。與寬體金線蛭和菲牛蛭相比，日本醫蛭的平均產卵繭數最少（馬燕，2016）。美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，FDA）于2004年6月批準醫用水蛭可作為醫療設備予以應用（Singh and Rajoria，2020），具體是指水蛭療法，即將水蛭含有許多生物活性物質的唾液注入生物體內（Koeppen et al.，2020），用于皮瓣改善、傷口愈合、重建手術、急性靜脈充血恢復，以及對腦缺血再灌注損傷的屏蔽作用（Mumcuoglu，2014；Dong et al.，2016；Mousavi et al.，2016；Sig et al.，2017）。水蛭唾液中最具代表性的水蛭素是一種酸性單鏈多肽，由64~66個氨基酸殘基組成，含有多個二硫鍵，能與凝血酶結合，從而抑制其與纖維蛋白原的結合，發揮抗凝和溶栓作用（王斌等，2017；楊謀等，2018；侯寧，2021）。隨著高通量測序技術的發展，對水蛭分子生物學方面的研究也越來越深入全面。Liu等（2018）對3種不同種水蛭（棒紋牛蛭、寬體金線蛭和洞穴山蛭）進行比較轉錄組學研究，結果發現3種水蛭的嗅覺轉導通路基因存在明顯差異；邢月婷等（2020）對饑餓狀態和取食的日本醫蛭進行轉錄組分析，結果發現許多抗凝和抗炎癥物質；余米等（2021a）基于高通量測序的日本醫蛭轉錄組分析結果表明，不同溫度處理下的日本醫蛭轉錄組和簡單重復序列標記變化較快，且水蛭素、FBXO家族和Dmrt等抗凝血及繁殖相關基因變化較明顯；Tong等（2022）通過比較寬體金線蛭、日本醫蛭和淡水水蛭的基因組，結果發現3種水蛭在同源基因、基因共線性及基因家族方面存在明顯差異?！颈狙芯壳腥朦c】至今，有關日本醫蛭不同生長階段的組學研究鮮見報道，進而制約其基因資源的高效開發利用?！緮M解決的關鍵問題】基于RNA-Seq技術對不同生長發育階段的日本醫蛭進行轉錄組測序分析，并對所得基因進行功能注釋和分類，旨在篩選出大量差異表達基因（Differentially expressed genes，DEGs），為后期開展日本醫蛭養殖、生長發育及相關功能基因研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

供試用日本醫蛭均采集自欽州市展宏中藥材公司，樣品分為幼蟲期（孵化10 d以內，HNL）、青年蟲期（孵化后2個月左右，HNY）和成年蟲期（孵化后2年左右，HNA）。根據日本醫蛭生理學解剖結構將其分為幼蟲前后段、青年蟲前后段、成蟲口吸盤、性腺、尾吸盤和剩余蟲體等24個樣本（表1），經液氮迅速冷凍后置于-80℃冰箱保存備用。同時，另取9個樣品進行組織學觀察，固定于4%多聚甲醛中，4℃保存，每組取3個個體作為生物學重復。

表1 樣品編號Table 1 Sample number

1.2 組織形態學觀察

經常規石蠟包埋、切片及蘇木精—伊紅染色后，通過顯微鏡（EVOS FL Auto）觀察日本醫蛭的組織學特征，并以顯微攝影系統（EVOS Auto）采集圖像。

1.3 cDNA文庫構建及序列數據分析

委托安諾優達基因科技（北京）有限公司進行樣品RNA提取及完成cDNA文庫構建，通過Illumina HiSeq 4000平臺進行測序，獲取長度為150 bp的雙末端序列。使用Fastp對每個樣品進行質量控制（Chen et al.，2018），通過HISAT2將各樣本的Reads映射到參考基因組，以SAMtools（v1.11）對SAM文件進行排序并轉換為BAM文件（Li et al.，2009）。然后應用StringTie進行組裝和去冗余（Pertea et al.，2015），獲得最后的轉錄本；運用GffCompare對轉錄本與GTF中的基因注釋信息進行比對（Pertea and Pertea，2020），以StringTie的選項“-e-B-P20”估計轉錄本豐度，豐度結果以“.balltown”結尾的文件呈現，并使用prepDE.py比較這些文件。

1.4 差異表達基因篩選

采用FPKM法計算各樣本中所有基因的表達量，通過DESeq2篩選不同組間的差異表達基因。篩選原則：錯誤發現率（FDR）＜0.05和|log2FC|＞1的基因即被認為是不同生長階段間的差異表達基因。

1.5 樣本時間序列分析

采用TCseq分析3個生長階段的差異表達基因并進行聚類分析，直觀顯示不同生長階段的不同基因表達模式（Ma et al.，2021）。

1.6 差異表達基因功能富集分析

通過clusterProfiler分別進行差異表達基因的GO功能注釋分析和KEGG信號通路富集分析（Yu et al.，2012），FDR＜0.05即為顯著富集。

2.1 不同生長階段日本醫蛭的發育性狀及組織學觀察結果

經4%多聚甲醛固定的日本醫蛭幼蟲（L）、青年蟲（Y）和成蟲（A），如圖1-A所示。計算不同生長階段日本醫蛭的體質量，其中，幼蟲體質量為0.136 g、青年蟲體質量為1.184 g、成年蟲體質量為1.524 g，不同生長階段日本醫蛭的體質量存在極顯著差異（P＜0.01）（圖1-B）。此外，不同生長階段日本醫蛭的石蠟切片觀察結果（圖1-C）顯示，日本醫蛭成年蟲期切片中的肌纖維明顯多于幼蟲期和青年蟲期。

圖1 日本醫蛭的表型數據及石蠟切片觀察結果Fig.1 Phenotypic data and paraffin section of H.nipponia

2.2 RNA測序分析結果

構建24個日本醫蛭cDNA文庫，將不同生長階段不同部位的數據進行組合，從日本醫蛭幼蟲期、青年蟲期和成年蟲期各獲得3組樣品（HNL1~HNL3、HNY1~HNY3和HNA1~HNA3），共產生541124257條原始序列（Raw reads）；經Fastp質量控制后，獲得517805628條有效序列（Clean reads）。所有樣本的GC含量十分接近，位于41%~45%之間（表2）。以上結果表明測序數據質量較好，可滿足后續分析的要求。

表2 日本醫蛭轉錄組測序數據統計結果Table 2 Summary statistics of H.nipponia transcriptome sequencing

RNA-Seq共組裝出20430個mRNAs轉錄本，其中88個為新發現的mRNAs轉錄本。不同樣本的基因表達情況如圖2-A所示。主成分分析（PCA）結果表明，9個樣品的基因表達量數據分布基本一致（圖2-B），說明不同分組樣本間可較清晰地劃分，組內相關性也較高，可為后續分析提供可靠數據。

圖2 mRNAs表達測序分析結果Fig.2 mRNAs expression sequencing analysis

2.3 差異表達基因及樣本時間序列分析結果

根據FDR＜0.05和|log2FC|＞1的差異表達基因篩選標準，對日本醫蛭不同生長階段進行兩兩對比，結果共獲得1348個差異表達基因。其中，在幼蟲期—青年蟲期（HNL vs HNY）中獲得238個差異表達基因，在幼蟲期—成蟲期（HNL vs HNA）中獲得976個差異表達基因，在青年蟲期—成蟲期（HNY vs HNA）中獲得763個差異表達基因（圖3）?？梢?，成蟲期較其他2個生長期的基因表達差異明顯，表現活躍；而幼蟲和青年蟲間的差異相對較小，表現較穩定，說明生長發育階段對日本醫蛭基因表達影響顯著。進一步分析差異表達基因的表達趨勢，結果（圖4）發現基因表達趨勢表現為：3個樣本（Cluster 2、Cluster 4和Cluster 6）持續下降、2個樣本（Cluster 3和Cluster 5）持續上升、3個樣本（Cluster 1、Cluster 7和Cluster 8）青年期高表達和1個樣本（Cluster 9）青年期低表達。

圖3 日本醫蛭差異表達基因統計結果Fig.3 Statistics of H.nipponia DEGs

圖4 日本醫蛭差異表達基因樣本時間序列分析結果Fig.4 DEGs sample time series analysis of H.nipponia

2.4 差異表達基因樣本時間序列GO功能注釋和KEGG信號通路富集分析結果

為揭示調控日本醫蛭發育的分子機制，對其上調趨勢的Cluster 4（含329個差異表達基因）和下調趨勢的Cluster 5（含176個差異表達基因）進行GO功能注釋分析，結果（圖5）表明，Cluster 4主要注釋在肌球蛋白復合體、運動活動、肌動蛋白絲結合、蛋白運輸及金屬酶等功能條目上，Cluster 5主要注釋于離子轉運、信號傳導及氧運輸等功能條目上。KEGG信號通路富集分析結果（圖6）顯示，差異表達基因樣本時間序列主要富集在氨基酸代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成及原核生物碳固定等通路上，但富集結果顯著性不高（FDR＞0.05）。

圖5 差異表達基因樣本時間序列GO功能注釋分析結果Fig.5 GO functional annotation analysis of sample time series of DEGs

圖6 差異表達基因樣本時間序列KEGG信號通路富集分析結果Fig.6 KEGG signal pathway enrichment analysis of sample time series of DEGs

2.5 不同生長階段差異表達基因GO功能注釋和KEGG信號通路富集分析結果

對不同生長階段差異表達基因進行GO功能注釋分析和KEGG信號通路富集分析，結果發現，幼蟲期與成蟲期相比，上調差異表達基因顯著注釋在肌球蛋白復合體、細胞骨架、金屬肽酶活性和金屬內肽酶活性等GO功能條目上（圖7-A），下調差異表達基因主要注釋在幾丁質代謝過程、對傷害的反應、氧結合、血紅素結合和離子運輸等GO功能條目上（圖7-B）；上調差異表達基因主要富集于氨基酸代謝、糖胺聚糖生物合成—硫酸軟骨素/硫酸皮膚素等KEGG信號通路上（圖7-C），但富集不顯著（FDR＞0.05），下調差異表達基因則顯著富集在丙烯酰胺轉移酶、卟啉與葉綠素代謝、苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸生物合成等KEGG信號通路上（圖7-D）。此外，其他不同生長階段的差異表達基因的GO功能注釋和KEGG信號通路富集分析結果顯示，上調的代謝通路主要富集在能量代謝和肌肉發育方面，而下調的通路富集在代謝和信號傳導方面（表3）。這可能是日本醫蛭幼蟲在生長過程中大量攝食并通過消化、代謝和合成物質為自身發育提供能量，而成年日本醫蛭發育成熟后其脫皮現象已完成，與其生長發育相關的幾丁質代謝過程、生物體必需氨基酸合成通路均下調，尤其是成年日本醫蛭已適應環境，對于環境刺激的敏感度也有所降低。

表3 差異表達基因顯著富集的KEGG信號通路Table 3 KEGG signaling pathway with significant enrichment of DEGs

圖7 日本醫蛭幼蟲期—成年期差異表達基因的功能富集分析結果Fig.7 The DEGs enrichment analysis in HNL vs HNA periods of H.nipponia

2.6 日本醫蛭發育性狀相關的潛在基因

進一步對差異表達基因的富集途徑分析發現，GO功能注釋獲得肌球蛋白復合體、細胞骨架等組分中的差異表達基因在日本醫蛭的生長發育過程中（HNL→HNY→HNA）呈上調趨勢（圖8-A）；而表面蛋白（SPA17）、IQ motif containing G（IQCG）、ACTB、5-羥色胺（5-HT）和HOX基因家族等同源基因可能參與日本醫蛭的性腺發育或產卵調控（圖8-B）；參與神經發育相關的微管蛋白、細絲蛋白A（FLNA）、原鈣黏蛋白（PCDHGA10）、溶質載體家族5成員8（SLC5A8）和NK型同源盒基因轉錄因子2.8（NKX2-8）等基因在各生長階段均有表達，且以在幼蟲期的表達量最高（圖8-C）。本研究還發現，與抗凝相關的蛋白基因在青年蟲中的表達量較高，包括水蛭素（Hirudin）、抗蛋白酶（ANTA）、金屬蛋白酶家族（ADAMTS）、Therostasin和血小板糖蛋白抑制劑（DECO）等（圖8-D）。

圖8 日本醫蛭生長發育相關差異表達基因的表達情況Fig.8 The expression of DEGs related to growth and development of H.nipponia

3 討論

本研究對不同所長階段的日本醫蛭進行轉錄組學分析，以期為研究日本醫蛭發育過程中的生理機制及提高其人工養殖效益提供新的理論依據。在3個生長階段中共發現1348個差異表達基因，且差異表達基因數量隨著日本醫蛭的發育而逐漸減少，可能與3月齡青年蟲已發育至成蟲有關。差異表達基因的GO功能注釋分析及KEGG信號通路富集分析結果表明，肌球蛋白復合體、細胞骨架和細胞生長發育相關信號通路呈上調趨勢，是由于幼蟲和青年蟲時期日本醫蛭生長速度快，需大量攝食以獲得能量，與非生殖階段（攝食階段）成蟲期相比觀察到更積極攝食行為的結論（Xu et al.，2021）一致；下調差異表達基因則主要與信號轉導、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成等信號通路相關，究其原因是隨著日本醫蛭的發育，其對食物的需求度及代謝水平均逐漸下降。

已有研究表明，動物的比生長速率在不同生長階段存在顯著變化，說明潛在的肌肉生長調節機制可能不同（Zhao et al.，2021）。本研究發現，成年日本醫蛭的肌纖維數量明顯多于幼蟲和青年蟲，GO功能注釋分析也顯示HNL vs HNA和HNY vs HNA的上調差異表達基因主要富集在肌球蛋白復合體、細胞骨架等條目上。其中，副肌球蛋白是環節動物的肌肉組成蛋白，在肌肉緊張收縮機制中發揮重要作用（Sonobe et al.，2016；Li et al.，2021）。原肌球蛋白是肌肉細肌絲中與肌動蛋白結合的蛋白，除了完成基本的收縮功能外，還參與完成體內多種生命活動，如胞質分裂及信號轉導等；通過與肌動蛋白的細肌絲螺旋形結合存在，而調節與肌球蛋白間的相互作用（Pavadai et al.，2020）。ACTB是肌動蛋白家族的重要成員之一，幾乎參與所有形式的細胞和細胞器運動，在生長發育、生物調控及修復過程中發揮重要作用（Hammer et al.，2019）。肌球蛋白由MYL和MYH組成，其中，MYH家族是調節肌肉發育的關鍵成員之一，主要通過調節細胞增殖、分化來影響肌肉的生成（Liu et al.，2020；Hill et al.，2021），這些基因均在成年日本醫蛭中高表達。

抗凝血能力是水蛭研究的熱點之一。本研究發現，在日本醫蛭體內除了水蛭素以外，抗凝血基因ANTA和DECO也有表達。水蛭素可抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、組織蛋白酶G和組織激肽釋放酶，但不抑制凝血因子Xa活性（王斌等，2017；Lu et al.，2018）。相反，ANTA是凝血因子Xa的有效抑制劑。DECO能抑制纖維蛋白原表達，與糖蛋白IIb-IIIa復合物上的血小板受體相互作用，防止血液凝結（Kwak et al.，2019）?？鼓蛟谌毡踞t蛭青年期的表達量高于成年，該結論為青年日本醫蛭的藥用提供了理論依據。

水蛭是典型的雌雄同體，雄性腺優先于雌性腺發育成熟。與其他品種水蛭相比，日本醫蛭的繁殖性能較低（馬燕，2016）。本研究通過轉錄組測序分析不同生長發育階段的差異表達基因，篩選出與性腺發育或卵發生相關的候選基因或蛋白。其中，SP17是一類與精子發生和形成、精卵識別及頂體反應等受精活動密切相關的蛋白（Minhas et al.，2020）。余米等（2021a）研究證實，在18℃下SP基因在日本水蛭體內高表達。IQCG也參與精子的發生過程，是纖毛/鞭毛運動的關鍵調節器，與精子運動有關（Harris et al.，2014；Pan et al.，2016）。關于卵巢發育的研究表明，5-HT在性腺成熟和連續產卵方面發揮多種生物學作用，是通過G蛋白偶聯受體超家族5-HT受體發揮作用，調節無脊椎動物和脊椎動物的卵母細胞發育與成熟（Song et al.，2016）。HOX基因是一個調節分子家族且編碼高度保守的轉錄因子，其表達受性類固醇的調控，在生殖道發育、子宮內膜周期生長和胚胎植入中發揮重要作用（Du and Taylor，2015；Kondo et al.，2017）。這些基因在日本醫蛭成年期顯著上調，可能與其繁殖性能相關。

日本醫蛭是研究神經再生機制的理想模型系統，具有在整個生命周期內再生中樞神經系統的能力。此外，日本醫蛭中樞神經元持續擴張，即其生長和增加突觸耦合的機制可能永遠不會被完全關閉（Meriaux et al.，2011；Cohen et al.，2020）。本研究發現，微管蛋白（刁磊等，2019）、FLNA（周翔宇，2021）及軸突生長誘向因子（Netrin）（孟凡偉等，2003）等與神經發育相關的基因在3個生長階段均有表達，其中，FLNA、PCDHGA10（Schoch et al.，2017）和NKX2-8在幼蟲期高表達，故可作為篩選日本醫蛭的候選分子遺傳標記。

4 結論

在幼蟲期—成蟲期（HNL vs HNA）獲得的976個差異表達基因中，上調差異表達基因主要與肌肉發育相關，而與性腺發育或產卵調節及神經發育相關的差異表達基因具有明顯周期特異性，其表達變化均與日本醫蛭的生長發育有關。水蛭素和抗凝相關基因在青年期高表達，因此開展水蛭抗凝血能力研究時宜選用青年日本醫蛭。