20種溪蟹線粒體COI基因比較分析及系統發育研究

劉東東，高佳怡，張璐瑤，龔理

（浙江海洋大學海洋科學與技術學院/海洋生物種質發掘與利用國家地方研究中心，浙江舟山 316022）

0 引言

【研究意義】線粒體基因組作為細胞核外能獨立進化的遺傳系統，具有結構簡單、呈母系遺傳、進化速率快且不同結構進化速率不一致等特點，已廣泛應用于物種鑒定、群體遺傳結構、適應性進化和系統發育進化分析等研究領域（石林波等，2013；Wang et al.，2019；羅純等，2021；Zhang et al.，2021）。DNA條形碼首次由Hebert等（2003a，2003b）提出，經過近20年的發展現已普遍應用于物種分類鑒定和生物多樣性評估等領域，在海關、法醫鑒定、市場監督及生物多樣性保護中心等行業部門發揮著重要作用（張瑞玲等，2017；劉娟等，2019；熊娟等，2020）。溪蟹科（Potamidae）是短尾次目（Brachyura）中物種十分豐富的類群，由于溪蟹生境復雜、近緣種形態接近、研究起步較晚，導致其分類及系統進化關系長期存在爭議（鄒節新等，2013；Zhang et al.，2020）。因此，建立溪蟹科DNA條形碼數據庫，輔以形態學特征，有望解決溪蟹物種長期存在的鑒定問題，為溪蟹科系統進化研究及其他類群物種鑒定提供參考依據?！厩叭搜芯窟M展】自2003年Hebert等（2003a，2003b）首次提出DNA條形碼概念以來，作為分類鑒定的有效技術手段在從低等的真菌、藻類和無脊椎動物到高等的兩棲爬行類、魚類和哺乳類動物均已得到證實（孔曉瑜等，2001；孟瑋等，2010；王淑英等，2014；張瑞玲等，2017；徐巖等，2019）?？讜澡さ龋?001）通過比較分析黃河口和珠江流域中華絨螯蟹與日本絨螯蟹間的COI基因序列差異，結果發現黃河口和珠江流域的中華絨螯蟹COI基因序列完全一致，但二者與日本絨螯蟹的COI基因序列差異較明顯，支持存在中華絨螯蟹和日本絨螯蟹或二者為不同地理亞種的觀點；Ortman等（2010）基于COI基因序列分析1種立方水母、10種缽水母和84種水螅水母的遺傳距離，結果證實了DNA條形碼間隔的存在，并提出COI基因可作為水母亞門種類鑒定的分子標記，類似方法在根口水母科（Rhizostomatidae）物種鑒定中同樣有效（李玉龍等，2017）；王淑英等（2014）在研究鰈形目鰨科（Soleidae）魚類物種鑒定時發現，COI基因在種內和屬內種間的平均遺傳距離分別為0.33%和19.91%，二者的遺傳差異約60倍（個別最小相差19倍），符合Hebert等（2003a，2003b）提出的物種鑒定標準；張瑞玲等（2017）基于線粒體COI基因序列，通過遺傳距離和系統發育進化樹對蚊、蠅、蜱、蟑螂等主要醫學媒介生物進行鑒定，證實了DNA條形碼技術在這些媒介生物鑒定中的可行性；徐巖等（2019）基于COI基因序列對中國沿海相手蟹（Sesarmidae）進行分子系統發育分析，結果表明相手蟹為多系起源，且日本的無齒螳臂相手蟹（Chiromantes dehaani）與我國長江口的無齒螳臂相手蟹（C.neglectum）雖然在形態上存在一定差異，但分子數據顯示二者為同種異名。此外，孟瑋等（2010）將線粒體COI基因序列作為基因條形碼運用于三種鮭科魚類（亞東鮭、大西洋鮭和紅點鮭）鑒定，其系統發育進化樹顯示亞東鮭和大西洋鮭首先聚為一類，再與紅點鮭聚類，表明線粒體COI基因序列對鮭科魚類物種鑒定具有一定的可行性和有效性，類似的方法在刀鱭（Coilia nasus）、湖鱭（C.nasus taihuensis）、短頜鱭（C.branchygnathus）、七絲鱭（C.grayii）、鳳鱭（C.mystus）（楊巧莉，2012）及裂腹魚亞科（Schizothoracinae）（周建設等，2019；迪麗娜·茹斯坦木，2021）等物種鑒定中也得到證實?！颈狙芯壳腥朦c】我國溪蟹物種資源豐富，但研究起步較晚，且主要集中在形態學分類、生態習性及生長繁殖等方面（戴愛云和陳國孝，1981；楚克林等，2018）。雖然目前針對溪蟹科已有分子方面的相關研究，但涉及的物種不多（鄭芳等，2006；石林波等，2013；Ji et al.，2016），關于溪蟹科物種分類及其內部親緣關系至今尚未得到較全面系統研究?！緮M解決的關鍵問題】通過擴增測定2種溪蟹代表種［長安龍溪蟹（Longpotamon changanense）和龍溪蟹未定種（Longpotamonsp.）］的COI基因全序列，結合GenBank中已公布的18種溪蟹科COI基因序列，比較分析20種溪蟹的線粒體COI基因序列，評估其序列多態性，探究COI基因作為分子標記在溪蟹物種鑒定中的適用性；同時基于COI基因序列構建溪蟹科系統發育進化樹，分析不同種類間的親緣關系，為溪蟹科的物種鑒定及系統發育研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2種溪蟹樣品分別采自陜西洛南（東經110°07′41.36″，北緯34°06′17.43″）和湖南新化（東經111°20′23.68″，北緯27°43′40.19″）附近溪流，將新鮮樣品用酒精固定后運回實驗室；根據形態學特征并輔以NCBI中的線粒體COI基因序列進行鑒定，其中，陜西洛南采集到的樣品鑒定為長安龍溪蟹，湖南新化采集的樣品可能為龍溪蟹屬新紀錄種。由于該新紀錄種樣品采集數量有限，故暫命名為龍溪蟹未定種。

1.2 基因組DNA提取及檢測

取2種溪蟹螯足肌肉組織約30 mg，剪碎后放入離心管中，利用鹽析法提取2種溪蟹的基因組。以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組完整性，并采用核酸定量儀（NanoDrop）檢測其純度，-20℃保存備用。

1.3 PCR擴增及測序

基于NCBI已公布的蟹類線粒體基因組COI序列，設計擴增2種溪蟹線粒體COI基因序列的通用引物（F-COI：5'-ATGCAACGATGATTTTTTTCYA-3'；R-COI：5'-TARCGGTTGATHARGAGT-3'）。PCR擴增反應體系33.0 μL：PCR Mix酶（北京溪洋匯智科技有限公司）15.0 μL，ddH2O 13.5 μL，正、反向引物各1.5 μL，DNA模板1.5 μL。擴增程序：95℃預變性3 min；95℃30 s，48~54℃50 s，68℃1~3 min，進行35個循環；68℃延伸10 min。PCR擴增產物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，電泳緩沖液為1×TAE（pH 8.0）、電壓為4 V/cm，以EB核酸染料染色，于凝膠成像系統下觀察并拍照，回收目的片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序；無法直接測序的片段則通過分子克隆后再測序。

1.4 序列分析及系統進化樹構建

運用CodonCode Aligner 5.1.5將各目的基因序列進行拼接，并輔以手工校對；再以Sequin v15.10（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Sequin/）對線粒體COI基因全序列進行注釋，利用ClustalX對測定的2種溪蟹和GenBank已公布的其他溪蟹線粒體COI基因核苷酸及其推導氨基酸序列進行比較分析（Larkin et al.，2007），利用MEGA X計算其堿基組成、保守位點和遺傳距離（Kumar et al.，2018），采用MatGAT 2.02進行多序列相似性比較分析（Campanella et al.，2003），并以PhyloSuite構建貝葉斯樹（BI）和最大似然樹（ML）（李加愛等，2021），探究溪蟹科物種內部親緣關系。

2 結果與分析

2.1 20種溪蟹COI基因全序列比較分析結果

長安龍溪蟹和龍溪蟹未定種的線粒體COI基因序列全長分別為1534和1539 bp，均以ATG為起始密碼子，分別連續編碼511和512個氨基酸殘基，不存在堿基插入或缺失；長安龍溪蟹以不完全終止密碼子T為終止密碼子，龍溪蟹未定種以常見的TAA為終止密碼子。2種溪蟹的堿基含量差異不明顯，4種堿基的含量分別為36.7%~38.3%（T）、18.4%~19.2%（C）、28.1%~28.6%（A）和15.3%~15.4%（G）。為了比較溪蟹科線粒體COI基因序列多態性，從GenBank下載18種溪蟹科COI基因全序列，對這20種溪蟹的COI基因序列差異進行比較分析。結果（表1）顯示，COI基因序列全長1534~1539 bp，連續編碼511~512個氨基酸殘基；所有物種均以ATG為起始密碼子，6種以不完全終止密碼子T為終止密碼子，其余均以TAA為終止密碼子（圖1）。20種溪蟹的堿基含量略有不同（表1），分別為35.9%~40.7%（T）、16.4%~20.2%（C）、26.8%~28.9%（A）和14.7%~17.2%（G），呈明顯的AT偏向性。核苷酸序列比較分析結果（圖1）顯示，共有962個保守位點，577個變異位點（約占37.3%）；基因序列變異主要發生在密碼子的第3位密碼子上（452個變異位點），第1位密碼子存在100個變異位點，第2位密碼子非常保守，僅有25個變異位點。將核苷酸翻譯成氨基酸序列再進行比較分析，結果（圖2）顯示僅有98個變異位點，變異位點率僅占19.0%，遠低于核苷酸序列變異率?？梢?，線粒體COI基因第3位密碼子具有搖擺性，但第3位密碼子變異并不一定改變氨基酸種類，該現象稱為遺傳密碼簡并性。

圖1 20種溪蟹線粒體COI基因核苷酸序列比較分析結果Fig.1 Alignment of nucleotide sequence of mitochondria COI gene of 20 Potamidae species

圖2 20種溪蟹線粒體COI基因推導氨基酸序列比較分析結果Fig.2 Alignment of deduced amino acid sequence of mitochondria COI gene of 20 Potamidae species

表1 構建系統發育進化樹的物種信息Table 1 List of the species to build phylogenetic tree

2.2 遺傳距離及相似分析結果

基于COI基因核苷酸序列計算20種溪蟹科物種的遺傳距離及其序列相似性（表2），結果顯示，近溪蟹屬（Potamiscus）的易武近溪蟹（P.yiwuensis）與山區近溪蟹（P.montosus）間的遺傳距離最?。?.007），二者對應的序列相似性最高（99.4%）；其次是澤蟹屬（Geothelphusa）的漢氏澤蟹（G.dehaani）與澤蟹未定種（Geothelphusasp.），二者的遺傳距離為0.028，對應的序列相似性為97.3%；最大遺傳距離出現在龍溪蟹未定種（Longpotamonsp.）和泰王中印溪蟹（Indochinamon bhumibol）間（0.234），對應的序列相似性最低（80.7%）。值得注意的是：小石蟹屬（Tenuilapotamon）中的寬腹小石蟹（T.latilum）與龍溪蟹屬中的小龍溪蟹（L.parvum）遺傳距離最?。?.110），序列相似性最高（89.6%），而寬腹小石蟹與玉溪小溪蟹（Tenuipotamon yuxiense）間的遺傳距離為0.199（大于0.110），序列相似性僅為83.0%（低于89.6%），小龍溪蟹與同屬其他物種的遺傳距離最小為0.122（與長安龍溪蟹），序列相似性最高為88.7%（與長安龍溪蟹）。類似現象也存在于近溪蟹屬物種中，近溪蟹屬中的永勝近溪蟹（P.yongshengense）與小溪蟹屬（Tenuipotamon）的玉溪小溪蟹（T.yuxiense）間的遺傳距離（0.135）低于永勝近溪蟹與同屬的易武近溪蟹和山區近溪蟹間的遺傳距離（均為0.188）；永勝近溪蟹與玉溪小溪蟹間的COI基因序列相似性（88.1%）高于永勝近溪蟹與易武近溪蟹（84.2%）和山區近溪蟹（84.3%）間的相似性。此外，長安龍溪蟹和龍溪蟹未定種間的遺傳距離最?。?.088），序列相似性最高（91.5%）。

表2 20種溪蟹科物種的線粒體COI基因遺傳距離及其序列相似性Table 2 The genetic distance and sequence similarity based on mitochondria COI gene in 20 Potamidae species

2.3 系統發育進化分析結果

基于線粒體COI基因及線粒體基因組中的13個蛋白編碼基因序列，以束腹蟹科（Parathelphtlsidae）中的波陽束腰蟹（Somanniathelphusa boyangensis）和壩王束腰蟹（S.bawangensis）為外類群，同時構建溪蟹科貝葉斯樹和最大似然樹，結果顯示，基于COI基因構建的2種系統發育樹（圖3和圖4）略有不同，而基于13個蛋白編碼基因構建的貝葉斯樹和最大似然樹拓撲結構（圖5）完全一致，且基于COI基因構建的系統發育進化樹與基于蛋白編碼基因構建的系統發育進化樹也存在一定差異。雖然采用不同方法基于不同數據集構建的系統發育進化樹在拓撲結構上有所不同，但所有樹型均顯示長安龍溪蟹與同屬的龍溪蟹未定種親緣關系最近，除了小龍溪蟹與寬腹小石蟹聚在一起外，其余4種龍溪蟹屬物種聚為一支，表明龍溪蟹屬為非單系群；近溪蟹屬4個物種中，易武近溪蟹與山區近溪蟹的親緣關系最近，聚為一支，而其他2個物種［永勝近溪蟹和墨脫近溪蟹（P.motuoensis）］分散在系統發育進化樹不同分支中，且永勝近溪蟹與玉蟹小溪蟹間的親緣關系明顯比永勝近溪蟹與墨脫近溪蟹間的親緣關系近，說明近溪蟹屬也是非單系群；澤蟹屬中的漢氏澤蟹和澤蟹未定種聚在一起，二者存在較近的親緣關系。

圖3 基于線粒體COI基因序列構建的溪蟹科貝葉斯樹Fig.3 Bayesian tree of Potamidae species based on mitochondria COI gene sequence

圖4 基于線粒體COI基因序列構建的溪蟹科最大似然樹Fig.4 The maximum likelihood tree of Potamidae species based on mitochondria COI gene sequence

圖5 基于13種蛋白編碼基因核苷酸序列構建的溪蟹科的貝葉斯樹和最大似然樹Fig.5 Bayesian tree and the maximum likelihood tree of Potamidae species based on 13 protein coding genes nucleotide sequence

續圖1 20種溪蟹線粒體COI基因核苷酸序列比較分析結果Continued Fig.1 Alignment of nucleotide sequence of mitochondria COI gene of 20 Potamidae species

3 討論

線粒體是細胞核外獨立的遺傳系統，能自主進行DNA復制、轉錄和翻譯。線粒體基因組具有分子量小、結構簡單、編碼效率高、進化速度快等優點，在物種鑒定和分類、遺傳多樣性分析及系統進化研究等領域發揮著重要作用（Wang et al.，2019；羅純等，2021；Zhang et al.，2021；Sultana et al.，2022）。在眾多線粒體基因中，COI基因因具有易擴增、進化速度適中等特點已廣泛應用于不同類群生物分類和鑒定，很大程度上彌補了形態學分類的不足，尤其為形態特征極其相似的隱存種及形態界限模糊不清或形態破損不易區分的近緣種鑒定提供了有效依據（范蔓樺等，2020；唐富江等，2020；張格等，2020）。Hebert等（2003a）最早比較分析了13320種不同門類動物的COI基因序列，提出COI基因用于物種鑒定的標準是種內遺傳距離小于2%，且種間遺傳距離顯著大于種內遺傳距離（通常在10倍以上）。目前該標準在大量生物類群（甲殼類、兩爬類、魚類和哺乳類等）中已得到驗證（Hebert et al.，2003b）。唐富江等（2020）通過比較分析烏蘇里江260個魚卵樣本的線粒體COI基因序列，發現其中有213條序列與Gen-Bank已知物種參考序列的相似性超過99%，能有效鑒定到種；7條序列與已知物種參考序列的相似度為95%~99%，能鑒定到屬；進一步分析還發現烏蘇里江中下游漂流性卵魚類以銀鮈（Squalidus argentatus）、銀鲴（Xenocypris argentea）、貝氏（Hemiculter bleekeri）和花斑副沙鰍（Parabotia fasciatus）等小型魚類為主，資源量較大，而大中型魚類中以翹嘴鲌（Culter alburnus）的資源量最豐富，該結論為魚類資源開發和利用提供了便捷有效的分子參考。同樣的方法在長江口海域夏季魚卵、仔稚魚種類組成及多樣性分析中也得到廣泛應用。張格等（2020）研究表生長、代謝過程及生物調節等功能條目上，而KEGG信息通路富集分析結果表明主要富集在過氧化物酶、RNA降解、軸突指導、神經活性配體—受體相互作用等通路上。根據GO功能注釋及KEGG信號通路富集分析結果，最終選定TOB2、CRAT、CCT6、KLF4共4個基因為凡納濱對蝦生長相關候選基因，具體基因信息見表5。通過為期100 d的凡納濱對蝦養殖試驗，結果（表6）發現試驗組凡納濱對蝦的終末體質量、終末體長、日增重率、體長日增長率及特定生長率均顯著高于對照組凡納濱對蝦（P＜0.05，下同），表明耐低鹽世代選育凡納濱對蝦群體的生長情況優于常規的凡納濱對蝦群體。

我國溪蟹物種資源豐富，是全球多樣性最豐富的國家，很多種類還是我國的特有物種（楚克林等，2018）。但由于溪蟹研究起步相對較晚，長期以來溪蟹科分類及系統進化一直存在較大爭議（石林波等，2012；鄒節新等，2013；Ma et al.，2019；Zhang et al.，2020）。本研究同時基于線粒體COI基因和線粒體基因組13個蛋白編碼基因序列構建至今為止涵蓋物種最多的溪蟹科系統發育進化樹，結果顯示，基于2個數據集構建得到的溪蟹科系統發育進化樹拓撲結構具有一定差異，主要表現在基于蛋白編碼基因構建的系統發育進化樹支持率（Bootstrap valve）和后驗概率（Posterior probability）普遍高于基于COI基因構建的系統發育進化樹，表明前者具有更高的可信度。究其原因是單個基因攜帶的有效遺傳信息明顯少于多基因串聯序列，也是越來越多研究趨向于利用線粒體基因組全序列進行系統發育進化分析的原因。雖然采用不同方法基于不同數據集構建的系統發育進化樹在拓撲結構上有所不同，但所有樹型均顯示長安龍溪蟹與同屬的龍溪蟹未定種親緣關系最近，同時暗示龍溪蟹屬和近溪蟹屬為非單系群，今后可基于更多的物種數量及更多基因序列進行重點驗證。此外，本研究擴增的COI基因序列包含有效信息位點太少，對于進化地位尚有爭議的物種解析度略顯不足；同時比較分析的溪蟹代表種較少，某些屬（卷肢溪蟹屬Lophopotamon）僅包括1個物種，因此今后需進一步擴大取樣范圍，同時篩選更多的分子標記以厘清溪蟹科系統發育進化關系。

4 結論

20種溪蟹的線粒體COI基因序列平均種間遺傳距離為0.173，均具有區別于其他種類的特異位點，即線粒體COI基因序列可作為溪蟹科物種鑒定的分子標記。