甘草酸通過HMGB1/TLR4/JNK信號通路抗豬急性腹瀉綜合癥冠狀病毒感染的研究

馮書風，時洪艷，張記宇，陳建飛，張 鑫，張燎原，馮廷帥，景朝陽，季朝陽，石 達，馮 力

（中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069）

2019 年12 月新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus dis?ease 2019，COVID-19）的暴發，給人類的健康造成了致命的威脅[1]。2017 年在廣東省清遠某豬場首次分離鑒定出一種新發病毒[2]，經過測序發現該病毒與甲型冠狀病毒屬的菊頭蝠冠狀病毒HKU2 序列同源性高達95%，命名為豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS-CoV）[2-3]，該病的暴發造成數個大型豬場約兩萬仔豬死亡；據Li 等報道2018 年在福建省某豬場也出現了SADS-CoV[4]；2019 年2 月在廣東省再次出現了SADS-CoV 的感染，導致將近2 000 頭仔豬死亡[2]。豬急性腹瀉綜合征（SADS）的暴發給養豬業造成了嚴重的經濟損失。SADS-CoV 屬于套式病毒目、冠狀病毒科、α-冠狀病毒屬成員，是有囊膜的單股正鏈RNA 病毒，基因組約27 kb，有4 個結構蛋白，分別為纖突蛋白S、囊膜蛋白E、膜蛋白M 和核衣殼蛋白N[5]。除此之外，還包括復制酶ORF1a、ORF1b及非結構蛋白NS3a、NS7a、NS7b 等。SADS-CoV 物種嗜性廣泛，可以感染蝙蝠、雞、小鼠甚至人類的多種細胞系，同時有學者也建立了SADS-CoV 感染的小鼠模型[6]，在一定程度上說明該病毒能夠跨物種傳播，因此更應重視該病的防控。截止目前，尚無針對SADS-CoV 的特效藥或有效疫苗，甘草酸（Glyc?yrrhizin，GLY）是從甘草中提取的一種毒性較低的天然藥物，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗癌癥、免疫調節、增強其他藥物活性等作用[7-8]。GLY 還可以減少因外界刺激或病原侵入而引起的炎癥因子的產生，因而具有治療作用。因此，本研究利用western blot、TCID50和間接免疫熒光試驗（IFA）等方法探究GLY 抗SADS-CoV 體外感染的信號通路，為SADS 的防制提供新的參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料SADS- CoV/GDWT/CN 株（MG557844.1）由華南農業大學馬靜云教授惠贈；豬回腸上皮細胞（IPI-2I）和非洲綠猴腎細胞（Vero E6）由本實驗室保存；GLY、瑞沙托維（TAK）和JNK 抑制劑SP600125 購自MedChemExpress 公司；胎牛血清購自金源康生物科技有限公司；DMEM 購自Gibco 公司；Cell Counting Kit-8 購 自Dojindo 公 司；Prime ScriptTMⅣ1st strand cDNA Synthesis Mix 購自寶生物工程（大連）有限公司；X-tremeGENE siRNA 轉染試劑和兔源GAPDH 單克隆抗體（MAb）購自Sigma公司；SADS-CoV N 蛋白MAb 由本實驗室制備；兔源RAGE MAb、p-p38 MAb、p-JNK MAb、p-ERK1/2 MAb、p38 MAb、JNK MAb、ERK1/2 MAb、HMGB1 MAb、HA PAb 均購自Ab?cam 公司；羊抗鼠IgG-Dy680、羊抗兔IgG-Dy680 購自Invitrogen公司。

1.2 GLY 對SADS-CoV 感染影響的檢測將DMSO（對照組）和不同濃度的GLY（0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L）加入生長至約60%密度的Vero E6 和IPI-2I 細胞中培養24 h，每孔加入CCK-8 溶液，作用1 h 后用酶標儀測定OD450nm值，分析GLY 對細胞活性的影響。在Vero E6 和IPI-2I 細胞傳代約48 h 后，用無菌的PBS清洗細胞，加入維持液，并用不同濃度的GLY 預處理2 h；洗去藥物，分別感染SADS-CoV（MOI 0.1、MOI 1、MOI 5），作用1 h 后加入維持液和GLY，當細胞出現病變后，收獲細胞上清液和細胞樣品。對收獲的細胞上清液用Vero E6 細胞測定TCID50，即每個細胞孔中加入100 μL 10 倍倍比稀釋的細胞上清液（101～108），設定8 個重復孔，在37 ℃培養4 d～5 d，試驗重復3 次并統計結果，通過Spearman-Karber 法計算病毒的滴度；將收獲的蛋白樣品利用western blot 檢測病毒N 蛋白表達量的變化，即分別以SADS-CoV N 蛋白MAb（1∶1 000）、兔源GAPDH MAb（1∶5 000）為一抗，羊抗鼠IgG-Dy680（1∶10 000）、羊抗兔IgG-Dy680（1∶10 000）為二抗，經近紅外熒光掃描成像系統成像，分析GLY 對SADS-CoV 體外感染的影響。

1.3 GLY 對病毒在Vero E6 和IPI-2I 細胞侵入和復制影響的檢測將病毒液加入平皿中在超凈臺紫外照射12 h 滅活后不具有復制的能力[9]。利用不同濃度（見1.2）的GLY 分別對Vero E6 和IPI-2I 細胞預處理2 h后，感染MOI 1 的滅活病毒置于4 ℃作用1 h，加入不同濃度（見1.2）的GLY，37 ℃共孵育1 h 后收獲細胞樣品裂解后，以SADS-CoV N 蛋白MAb（1∶1 000）為一抗，羊抗鼠IgG-Dy680（1∶10 000）為二抗，經近紅外熒光掃描成像系統成像，檢測N 蛋白表達量的變化，分析GLY 對該病毒侵入的影響；選取0.4 mmol/L的GLY 對Vero E6 和IPI-2I 細胞預處理2 h 后，利用SADS-CoV（MOI 1）分別感染細胞2 h、6 h、12 h 后收獲細胞上清液和細胞樣品，按照1.2 的方法檢測N 蛋白和病毒滴度，分析GLY 對病毒復制的影響。

1.4 HMGB1與其受體TLR4和RAGE的結合對SADSCoV 感染影響的檢測采用軟件SnapGene 設計HMGB1 以及其關鍵位點突變的引物，利用HMGB1 引物（HMGB1-U：GCATCGATATGGGCAAAGGAGATCCTA A/HMGB1-L： GCCTCGAGTTATTCATCATCATCATCTT）從Vero E6 細胞全基因組擴增HMGB1 基因，將其克隆于pCAGGS-HA 載體中構建重組真核表達質粒pHAHMGB1。以上述擴增的HMGB1 基因為模板，采用如下引物（HMGB1（C45S）-U：ACTTCTCAGAGTTTTCTAA GAAGAGCTCAGAGAGGTGGAAGACCATGTCT/HMGB1（C45S）-L：AGACATGGTCTTCCACCTCTCTGAGCTCTT CTTAGAAAACTCTGAGAAGT；HMGB1（C106S）-U：CT CCTTCGGCCTTCTTCCTGTTCAGCTCTGAGTATCGCCC AAAAATCAAA/HMGB1（C106S）-L：TTTGATTTTTGG GCGATACTCAGAGCTGAACAGGAAGAAGGCCGAAGG AG）經PCR 擴增HMGB1 的3 個突變體（C45S、C106S、C45/106S）基因，將其克隆于pCAGGS-HA 載體分別構建重組真核表達質粒pHA-HMGB1-C45S、pHAHMGB1-C106S、pHA-HMGB1-C45/106S，并由庫美生物科技有限公司測序鑒定。將上述測序正確的3 個HMGB1 的突變真核表達質粒分別轉染Vero E6 細胞48 h 后，感染SADS-CoV（MOI 0.1）24 h 后收獲細胞樣品和上清液；將合成有效的干擾小RNA（siRNA）和X-tremeGENE siRNA 轉染試劑按照1∶1 比例混勻，加入密度約為30%的Vero E6 細胞中（HMGB1 和RAGE 的siRNA 靶序列如下：HMGB1：GGGAGGAGCAUAA GAAGAATT； RAGE： GCUGGAAUGGAAACUGAAUT T），感染SADS-CoV（MOI 0.1）24 h 后收獲細胞樣品和上清液。設置未處理組（No treat）以及加入轉染試劑的Mock 組，按照1.2 的方法利用western blot 和TCID50檢測N 蛋白變化量和病毒滴度的變化，分析HMGB1與TLR4、RAGE 的結合對該病毒感染的影響。

1.5 SADS-CoV 感染對細胞MAPK 信號通路影響的檢測將Vero E6 和IPI-2I 細胞傳代約48 h，感染SADS-CoV（MOI 0.1），分別于0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 收獲細胞樣品，經細胞裂解液處理后分別以N 蛋白MAb（1∶1 000）、兔源p-p38 MAb（1∶1 000）、p38 MAb（1∶1 000）、p-JNK MAb（1∶1 000）、JNK MAb（1∶1 000）、p-ERK1/2 MAb（1∶1 000）、ERK1/2 MAb（1∶1 000）、GAPDH MAb（1∶5 000）為一抗，以羊抗鼠IgG-Dy680（1∶10 000）、羊抗兔IgGDy680（1∶10 000）為二抗，利用western blot 檢測p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、N、GAPDH 蛋白的表達量，分析該病毒感染對MAPK 信號通路的影響。

1.6 GLY、TAK、HMGB1 對細胞MAPK JNK 信號通路影響的檢測利用不同濃度的GLY（0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L）和TAK（0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L）對Vero E6 和IPI-2I細胞預處理2 h 后，感染SADS-CoV（MOI 0.1），24 h后收獲細胞樣品，按照1.5 的方法采用western blot 檢測p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、N、GAPDH 蛋白的表達量，分析GLY 和TAK 對該通路的影響。將SADS-CoV（MOI 0.1）感染Vero E6 細胞并加入不同劑量（0.1 μL、0.5 μL、1 μL）的商品HMGB1中和抗體；將構建的3 種HMGB1 突變真核表達質粒以 及HMGB1 的siRNA 分 別 轉 染Vero E6 細 胞48 h 后感染SADS-CoV（MOI 0.1），設置未處理組（No treat）以及加入轉染試劑的Mock組，24 h后收獲細胞樣品，分別以N 蛋白MAb（1∶1 000）、兔源p-JNK MAb（1∶1 000）、GAPDH MAb（1∶5 000）為一抗，以羊抗鼠IgG-Dy680（1∶10 000）、羊抗兔IgG-Dy680（1∶10 000）為二抗，利用western blot 檢測p-JNK、N、GAPDH 蛋白的表達量，分析HMGB1 對JNK 磷酸化的影響。

1.7 JNK 的競爭性抑制劑SP600125 對SADS-CoV感染影響的檢測將不同濃度的SP600125（1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L）對Vero E6 和IPI-2I 細胞預處理2 h，再感染SADS-CoV（MOI 0.1），作用24 h 收獲細胞上清液和細胞樣品，按照1.2 的方法采用western blot 和TCID50檢測N 蛋白表達量和病毒滴度的變化。當SADS-CoV（MOI 0.1）感染Vero E6 細胞約24 h 并出現病變時，棄上清液，甲醇固定30 min；加入5%的脫脂乳常溫封閉2 h；以SADS-CoV N蛋白MAb（1∶1 000）為一抗，以488熒光標記的羊抗鼠IgG為二抗（1∶5 000），按照1∶1 000的比例稀釋DAPI 染核，最后加入1 mL 的PBS 避光保存，于倒置熒光顯微鏡下觀察病毒的復制情況，采用IFA分析SP600125 對該病毒感染的影響。將不同濃度的SP600125（1 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L）加至約60%密度的Vero E6 和IPI-2I 細胞中培養24 h，每孔加入CCK-8 溶液，作用1 h 后用酶標儀測定OD450nm值，分析SP600125 對細胞活性的影響。

1.8 數據分析采用Image J 和Graph Pad prism 8.0軟件分析結果并繪制柱狀圖，*：P＜0.05 表示差異顯著，**：P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 GLY 對SADS-CoV 感染細胞影響的檢測結果利用CCK8 進行了細胞活性試驗，結果顯示不同濃度（見1.2）的GLY 與DMSO 對照組相比，細胞活性無差異（圖1A），表明所添加的GLY 對Vero E6 和IPI-2I 的細胞活性無明顯影響。用不同濃度（見1.2）的GLY 處理Vero E6 和IPI-2I 細胞2 h，感染SADSCoV（MOI 0.1），利用western blot 檢測N 蛋白表達量的變化。結果顯示N 蛋白表達量呈劑量依賴性減少（圖1B、圖1C），表明GLY 對MOI 0.1 的SADS-CoV抑制效果顯著（P＜0.05）。收取上述細胞上清液進行TCID50測定，結果顯示病毒滴度減少，表明GLY 抑制病毒的復制（P＜0.05）（圖1D）。為了進一步觀察GLY 的抑制效果，利用MOI 1 和MOI 5 的SADS-CoV再次進行驗證，western blot 結果顯示N 蛋白表達量呈劑量依賴性減少（P＜0.05，圖1F、圖1E），表明GLY 對MOI 1 和MOI 5 的SADS-CoV 抑制效果顯著。

圖1 GLY對SADS-CoV感染細胞影響的檢測結果Fig.1 Antiviral effect of GLY against SADS-CoV infection

2.2 GLY對病毒在Vero E6和IPI-2I細胞侵入和復制影響的檢測結果利用紫外滅活病毒檢測GLY 對病毒侵入細胞的影響，western blot 結果顯示，在GLY濃度為0.8 mmol/L時，N蛋白的表達量減少，表明濃度高的GLY 對病毒的侵入抑制效果顯著（P＜0.05，圖2A、圖2B）。在病毒復制的早期收獲不同時間點的細胞樣品檢測發現N 蛋白表達量減少（P＜0.05，圖2C、圖2D 和圖2E），表明GLY有效抑制病毒的侵入及復制。

圖2 GLY對病毒在Vero E6和IPI-2I細胞侵入和復制影響的檢測結果Fig.2 Effects of GLY on SADS-CoV entry and replication

2.3 HMGB1 與其受體TLR4 和RAGE 的結合對SADS-CoV 感染影響的檢測結果GLY 通過競爭細胞受體抑制HMGB1 發揮功能。當HMGB1 結合TLR4發揮作用時，可在Cys23和Cys45之間形成二硫鍵，也會影響Cys106位點。將1.4 構建的HMGB1 關鍵位點突變的真核表達質粒轉染Vero E6 細胞后感染病毒，收獲細胞上清液和細胞樣品。Western blot 試驗結果顯示，N 蛋白的表達量比Mock 組均顯著減少（P＜0.05）（圖3A），TCID50結果顯示，病毒滴度比Mock 組均顯著下降（P＜0.05）（圖3B），表明HMGB1 和受體的結合與病毒復制有關。HMGB1 的另一受體是RAGE，將該受體的siRNA 轉染Vero E6 細胞48 h 后接種病毒，收獲細胞樣品和細胞上清液。Western blot 和TCID50結果分別顯示，N 蛋白表達量比未處理組、Mock 組和SiScr 3 個對照組顯著減少（P＜0.05），且病毒滴度顯著下降（P＜0.05）（圖3C、圖3D），表明HMGB1和RAGE的結合影響了病毒的復制。

圖3 HMGB1與其受體TLR4和RAGE的結合對SADS-CoV感染影響的檢測結果Fig.3 Detection of the effect of binding of HMGB1 to its receptors TLR4 and RAGE on SADS-CoV infection

2.4 SADS-CoV 感染對MAPK 信號通路影響的檢測結果為探究GLY 影響SADS-CoV感染的具體信號通路，首先檢測SADS-CoV 感染細胞后激活的細胞信號通路，分別將SADS-CoV感染Vero E6和IPI-2I 細胞均并于不同時間點收獲蛋白樣品，經western blot檢測MAPK信號通路的下游蛋白時發現p-p38、p-JNK、p-ERK 在病毒感染的早期和晚期均被激活（圖4A 和圖4B），表明MAPK 信號通路在病毒感染時被激活。

圖4 病毒感染Vero E6 細胞（A）和IPI-21細胞（B）后MAPK信號通路相關蛋白表達量變化的western blot檢測結果Fig.4 Western blot analysis of MAPK pathway related protein expression changes in Vero E6 cells(A)and IPI-21 cells(B)infected with virus

2.5 GLY、TAK、HMGB1 對MAPK 信號通路影響的檢測結果利用不同濃度（見1.6）的GLY 和TAK 分別對Vero E6 和IPI-2I 細胞預處理2 h，然后接種SADS-CoV（MOI 0.1），24 h 后收獲細胞樣品。West?ern blot 試驗結果顯示，與Mock 組相比N 蛋白和磷酸化的JNK 表達量均呈劑量依賴性減少，但p38 和ERK的磷酸化無明顯變化（圖5A、圖5E），表明GLY 和TAK 通過影響JNK 的磷酸化發揮抗病毒的作用。隨后用HMGB1 中和抗體、轉染HMGB1 關鍵位點突變的真核表達質粒以及利用siRNA 敲低HMGB1 分別對Vero E6 細胞進行處理，再接種病毒之后收獲細胞樣品，利用western blot 檢測JNK 磷酸化的變化情況，結果顯示，與Mock 組相比，p-JNK 蛋白水平均顯著降低（P＜0.05）（圖5B、圖5C、圖5D）。以上結果表明，GLY、TAK 和HMGB1 在SADS-CoV 感染后通過影響MAPK信號通路下游激酶JNK的磷酸化發揮作用。

圖5 GLY、TAK、HMGB1對磷酸化JNK蛋白表達量影響的結果Fig.5 Effects of GLY,TAK and HMGB1 on the expression of phosphorylated JNK protein

2.6 SP600125 對SADS-CoV 感染影響的檢測結果利用JNK 的抑制劑SP600125 對Vero E6 和IPI-2I細胞預處理2 h 后，接種SADS-CoV（MOI 0.1），作用24 h后收獲細胞樣品，利用western blot 檢測N 蛋白表達量變化，結果顯示與Mock 組相比N 蛋白表達量呈劑量依賴性減少（圖6A）；TCID50試驗結果顯示病毒滴度下降，IFA 試驗結果顯示SP600125 能顯著抑制病毒的復制（P＜0.05）（圖6B、圖6C）；CCK-8 試驗結果顯示不同濃度SP600125 對Vero E6 和IPI-2I 的細胞活性無影響（圖6D）。綜上所述，SADS-CoV 的感染能夠激活JNK 信號通路并起負調控作用，也表明JNK 信號通路對于該病毒復制是至關重要的。

圖6 SP600125對SADS-CoV感染影響的檢測結果Fig.6 Antiviral effect of SP600125 against SADS-CoV infection

3 討 論

SADS-CoV 是近幾年新出現的動物冠狀病毒，關于其治療的有效方法還未見報道?；谠摬《疽鹱胸i高死亡率且可在多種細胞系中增殖，存在跨物種傳播的潛在風險，所以對其有效藥物的開發極其重要[6]。

GLY 是甘草的主要成份，具有抗病毒、抗炎和抗腫瘤等作用，通過宿主的免疫調節可有效抑制多種病毒的復制[10]。GLY 是HMGB1 的競爭性抑制劑，通過影響病毒和細胞的結合進而抑制病毒的復制。根據文獻報道，GLY 能夠抑制多種呼吸道病毒的復制[11-12]，如對呼吸道合胞病毒，其主要阻止病毒的粘附。然而，GLY 對引起腸道感染的SADS-CoV 的作用機制尚無報道。本研究首次報道了GLY 抑制SADSCoV 在Vero E6 和IPI-2I 細胞中侵入和復制的機制。

GLY 是HMGB1 的競爭性抑制劑，而HMGB1 通過與不同受體的相互作用激活細胞內不同的信號應答，激活其先天免疫反應。TLR4 和RAGE 是已知的HMGB1 細胞因子功能受體。HMGB1 與TLR4 聯合誘導細胞因子釋放通過HMGB1 中C106以及C23與C45之間的二硫鍵發揮作用[13]。HMGB1 突變體的實驗證實，HMGB1 與TLR4 的結合促進了SADS-CoV 的感染，提示HMGB1 的正確構象對SADS-CoV 的復制至關重要。本研究還通過RAGE 基因敲除試驗證實RAGE參與了SADS-CoV 的感染過程。

因為病毒的生命周期最終取決于宿主細胞，所以MAPK 信號通路可在病毒感染中被激活。當病毒感染細胞時，會在不同時期引起細胞信號通路的改變，已有學者利用單細胞示蹤技術對PEDV 實時示蹤，解析了PEDV 早期入胞的動態過程[14]。同時，MAPK 級聯反應可還參與病毒感染細胞的免疫應答和凋亡的調節[15]。MAPK 通路可作為病毒復制的正調控或負調控因子，利用外源性MAPK 通路激活因子促進自身的復制。結果表明，SADS-CoV 在Vero E6和IPI-2I細胞感染早期可激活JNK、ERK和p38 MAPK通路。

本研究進一步探究GLY對SADS-CoV 感染的作用機制。據報道，MAPK 信號通路的激活對冠狀病毒至關重要。ERK途徑已被證明在病毒的生物合成和促進PDCoV的復制中發揮關鍵作用[16]。有研究表明，PEDV感染后期激活細胞中的p38 MAPK和JNK[17]。這兩種激酶是PEDV 體外有效復制所必需的。本研究結果表明，GLY 可以顯著降低SADS-CoV 誘導的MAPK 通路的激活，這意味著該信號通路可能也參與了GLY的抗SADS-CoV 過程。此外，通過使用HMGB1 中和抗體、轉染HMGB1 關鍵位點突變的真核表達質粒以及利用siRNA 技術敲低HMGB1 等方法對Vero E6 細胞預處理后接種病毒，western blot 檢測發現以上處理均抑制了JNK 的磷酸化水平。實驗結果表明，GLY 阻斷了HMGB1與TLR4的結合，抑制了TLR4的活性。與這些發現一致的是，GLY 依賴于TLR4 的激活降低JNK 的活性。本研究使用TLR4 的競爭性抑制劑TAK 對細胞處理后western blot 的結果顯示，TAK 也降低了JNK的磷酸化水平但并不影響ERK 和p38 的磷酸化，表明JNK 的激活可能在SADS-CoV 感染過程中起重要作用。本研究中JNK 抑制劑SP600125 抑制SADS-CoV感染的試驗結果也再次證實了JNK 的作用。

綜上所述，本研究表明細胞外HMGB1 與TLR4的相互作用導致JNK 的激活，而ERK 和p38 的激活并不會促進SADS-CoV 的感染。GLY 阻止HMGB1 與TLR4 結合，抑制SADS-CoV 體外感染，其作用主要依賴于HMGB1/TLR4/JNK 信號通路。本研究為研發抗SADS-CoV 新型藥提供了理論支持。