長鏈非編碼RNA與膽囊癌發生和發展以及化療耐藥的研究進展

胡小強，陳 煒,

膽囊癌是膽囊上皮細胞來源的惡性腫瘤，位居消化系統惡性腫瘤發病率第6 位[1]，全球膽囊癌發病率約為2/10 萬[2]，中國2014 年膽囊癌發病率為3.82/10 萬[3]。雖然膽囊癌的發病率并非最高，但其惡性程度較高，5 年生存率僅為5%～15%[4]。手術切除仍是目前可治愈膽囊癌的唯一方法。大樣本回顧性臨床研究的結果顯示，可手術切除膽囊癌患者的5 年生存率為39.6%，不可手術切除的晚期膽囊癌患者以及接受姑息性手術的膽囊癌患者的5 年生存率分別為5.4%和4.7%[4]。由于膽囊癌的早期癥狀不典型，因此不易被發現，常導致喪失最佳的手術時機。此外，針對中晚期膽囊癌的治療方法有限，并且易發生遠處轉移和多藥耐藥[5]。因此，研究膽囊癌細胞的增殖、侵襲、轉移和化療耐藥的機制尤為重要。

人類全基因組測序發現，在人類基因組中，僅有2%的序列是編碼蛋白質的序列，其余98%的序列是不翻譯蛋白質的非編碼序列，而其中絕大多數可轉錄為長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）。lncRNA 是指長度超過200 個核苷酸且不編碼蛋白質的由RNA 聚合酶Ⅱ從獨立啟動子轉錄而來的RNA（盡管已經發現一些lncRNA 可以編碼小分子肽）。與蛋白編碼基因類似，lncRNA 的基因組位置以轉錄起始位點的H3K4 三甲基化富集以及整個基因體富集H3K36 三甲基化為特征。lncRNA 轉錄本由多個外顯子組成，這些外顯子通過典型機制剪接成熟，通常包括3’poly(A)和5’帽結構[6]。lncRNA 具有多種功能：（1）一些lncRNA 可與鄰近基因相互作用，招募染色質修飾因子以增強或抑制轉錄，也可以影響其他染色體上基因的轉錄；（2）一些lncRNA 會形成亞核結構域，將某些蛋白質招募至這些位點，形成的結構域作為多功能基因調控結構，影響轉錄和轉錄后調控；（3）還有一些lncRNA 被輸出至細胞質中，在細胞質中與特定的蛋白質相互作用，影響信號通路，調節特定mRNA 的翻譯或充當“miRNA 海綿（miRNA spong）”，與miRNA 形成競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）關系[7]。隨著高通量測序和微陣列芯片等技術的發展，已發現腫瘤組織中存在大量異常表達的lncRNA，其中一些高表達且促進腫瘤發生和發展的lncRNA 被稱為促癌lncRNA；相應地，低表達且抑制腫瘤發生和發展的lncRNA 被稱為抑癌lncRNA。目前有關膽囊癌相關lncRNA 的功能學和機制學研究正不斷深入，但仍有許多異常表達的lncRNA 的功能尚未厘清，有待進一步研究。本文圍繞膽囊癌細胞增殖和轉移相關lncRNA 以及化療耐藥相關lncRNA 的功能和作用機制進行綜述，以期為臨床診治膽囊癌提供新的思路。

1 與膽囊癌細胞增殖和轉移相關的lncRNA

逃避細胞凋亡、無限自我復制以及轉移和浸潤是惡性腫瘤的3 大基本特征[8]。隨著研究的逐漸深入，越來越多的證據表明，多種lncRNA 在膽囊癌組織中表達異常，并且可以介導膽囊癌細胞的增殖、轉移和侵襲等過程。多種lncRNA 與miRNA形成ceRNA 關系，共同調節癌基因或抑癌基因的表達，從而影響膽囊癌的發生和發展（圖1）。

1.1 HOTAIR

HOTAIR 是首個被證明具有反轉錄調控作用的基因間區lncRNA，其在多種惡性腫瘤中高表達。TANG 等[9]通過應用shRNA 敲低胰腺癌細胞系中HOTAIR 的表達，可以抑制Wnt/β-cantein 信號通路，從而削弱上皮-間質轉化，抑制胰腺癌細胞的轉移和侵襲。DENG 等[10]研究證實，HOTAIR 可以通過抑制miR-34a 而激活JAK2/STAT3 信號通路，從而促進胰腺癌細胞的轉移和侵襲。由此提示，HOTAIR 可能通過多種不同的機制影響胰腺癌的發生和發展。

Fig.1 Potential mechanism of kinds of long non-coding RNAs (lncRNAs) in gallbladder carcinoma (GBC).A: LncRNA,as a miRNA spong,regulates target gene expression via interacting with miRNA;B and C:Transcription factor binds to the promoter region of lncRNA gene and induces its transcription,and c-Myc and SP1 bind to the promoter region of HOTAIR and LINC00152 genes and induce their transcription respectively;D: FOXD2-AS1 could potentially recruit methyltransferase DNMT1 to the promoter region of the MLH1 gene and induce the resultant MLH1 transcription inhibition.CeRNA: Competing endogenous RNA.圖1 膽囊癌相關lncRNA 的作用機制

通過檢測65 例膽囊癌組織及其癌旁組織，MA 等[11]發現HOTAIR 在膽囊癌組織中高表達，并且與T 分期以及淋巴結轉移均密切相關；通過在線轉錄因子預測軟件發現HOTAIR 可能受轉錄因子c-Myc 的直接調節，在GBC-SD 細胞中敲低c-Myc 的表達或使其過表達，HOTAIR 在RNA 水平的表達與c-Myc 的表達呈正相關；進一步采用雙熒光素酶報告基因實驗和ChIP 實驗，發現c-Myc 可以直接結合至HOTAIR 啟動子區域，從而上調HOTAIR 的表達（圖1B）；此外，在下游機制方面，HOTAIR 的促膽囊癌活性是通過直接負性調節miR-103a 的表達而實現的。

1.2 LINC00152

LINC00152 又被稱為細胞骨架調節RNA（cytoskeleton regulator RNA，CYTOR），其 在多種惡性腫瘤細胞中高表達，促進惡性腫瘤細胞的增殖和上皮-間質轉化。在乳腺癌中，研究人員發現LINC00152 可以直接結合KLF5 并增強其穩定性；同時，KLF5 也可以直接結合至LINC00152 啟動子區以激活后者轉錄，形成正反饋關系[12]。在胃癌中，LINC00152 通過結合EZH2 以調節CXCL9/CXCR3 軸介導的腫瘤組織中CD8+T 淋巴細胞的浸潤[13]。在食管癌中，LINC00152 同樣與EZH2 互相作用，通過提高ZEB1 的表達，增強食管癌上皮-間質轉化以及對奧沙利鉑的耐藥[14]。

有研究發現，LINC00152 在膽囊癌中的表達水平顯著升高，并且與腫瘤進展、淋巴結轉移和TNM 分期相關。實驗發現，LINC00152 能夠明顯促進膽囊癌細胞的增殖、轉移和侵襲。機制研究發現，LINC00152 可以通過PI3K/AKT 通路以發揮促癌作用，并且轉錄因子SP1 可誘導其過表達[15]（圖1C）。

1.3 H19

H19 基因位于11 號染色體靠近胰島素樣生長因子2 基因的印跡區，在膀胱癌、乳腺癌和肺癌等多種惡性腫瘤中均為高表達，不僅與惡性腫瘤的生物學行為有關，還參與化療耐藥。H19 不僅與p53 以及基因組的穩定性有關，還與惡性腫瘤的上皮-間質轉化有關[16]。LUO 等[17]發現H19 在膀胱癌組織中高表達，可與EZH2 相互作用，抑制E-鈣黏蛋白的表達，激活Wnt/β-catenin 信號通路。乳腺癌研究發現，H19 在他莫昔芬耐藥的乳腺癌細胞系和乳腺癌組織中均為高表達，敲低H19 的表達可以在體內外水平增強乳腺癌細胞對他莫昔芬的敏感性，并且證實H19是通過SAHH/DNMT3B 軸誘導自噬以增強乳腺癌細胞對他莫昔芬的耐藥[18]。在三陰性乳腺癌中，H19 通過拮抗p53，提高腫瘤壞死因子α 誘導蛋白8 的表達水平，從而促進乳腺癌細胞的上皮-間質轉化[19]。在獲得性表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑耐藥的肺癌體外模型和組織標本中，研究人員發現H19 是一種表達顯著下調的lncRNA，同時證實表達下調的H19 通過上調丙酮酸激酶M2 的表達且與之相互作用，促進AKT磷酸化，進而促進肺癌細胞對厄洛替尼的耐藥[20]。

WANG 等[21]檢測了35 例膽囊癌以及正常膽囊組織中H19 的表達水平，結果發現H19 的表達水平升高；進一步研究發現，H19 可以通過ceRNA 作用，負性調節miR-342-3p，共同作用于靶基因FOXM1 以促進膽囊癌細胞的增殖、轉移和侵襲。

1.4 MINCR

MINCR 即Myc 誘導的lncRNA，最早于Myc 陽性淋巴瘤中被鑒定出來。研究人員利用Myc 誘導的細胞系以及有或無基因突變所致Myc 過表達的B 細胞淋巴瘤樣本開展交叉RNAseq，結果發現13 種差異表達的lncRNA，其中一種在Myc 陽性淋巴瘤中與Myc 表達強烈相關的lncRNA 被命名為MINCR。敲低MINCR 的表達后，包括細胞因子調節激酶AURKA/B 和CDT1 等在內的細胞周期相關基因的表達均下調，因此MINCR 被認為是通過調節細胞周期相關基因的表達以調節細胞周期的進展[22]。在非小細胞肺癌中，MINCR 扮演著ceRNA 的作用，與miR-126 競爭性調節靶基因SLC7A5 的表達，從而促進非小細胞肺癌細胞的增殖和轉移，并且抑制細胞凋亡[23]。在結腸癌中，MINCR 與miR-708-5p 構成ceRNA上調靶基因CTNNB1的表達，并且激活Wnt/β-catenin 信號通路，促進結腸癌的發展[24]。

研究人員發現，MINCR 在膽囊癌中同樣為高表達，并且其表達水平與腫瘤大小、淋巴結轉移和總生存率均密切相關；敲低MINCR 的表達可以顯著抑制膽囊癌細胞的增殖、轉移和侵襲，同時促進細胞凋亡。研究還發現，MINCR 與miR-26a-5p 可形成ceRNA 作用，調節EZH2 的表達，進而影響膽囊癌細胞的增殖和轉移[25]。

1.5 PVT1

PVT1 在多種血液系統惡性腫瘤和實體瘤中均表現為過表達或拷貝數增加，是一種候選癌基因（candidate oncogene）。研究發現，PVT1 可以通過穩定核仁蛋白NOP2 以促進肝癌細胞的增殖，并且獲得干細胞樣特性[26]。在胃癌中，KONG 等[27]證實PVT1 與EZH2 相關，通過表觀調節p15 和p16 基因的表達以促進胃癌細胞的生長。在胰腺癌中，研究人員發現PVT1 通過激活Wnt/β-catenin 信號通路和競爭miR-619-5p 以調節Pygo2 和ATG14 軸的自噬途徑，從而促進胰腺癌對吉西他濱的耐藥[28]。

通過對GEO（Gene Expression Omnibus）數據庫和臨床樣本進行分析，發現PVT1 在膽囊癌中同樣高表達，并且其表達水平與TNM 分期、遠處轉移和預后均密切相關。敲低PVT1 的表達后可以抑制膽囊癌細胞的增殖、轉移和侵襲能力。進一步研究發現，PVT1 通過結合miR-143 并且抑制其表達，共同調節HK2 的表達，參與調節膽囊癌細胞的糖代謝[29]。還有研究發現，PVT1可以通過結合EZH2，將DNMT1 招募至miR-18b-5p 基因啟動子區，通過DNA 甲基化抑制miR-18b-5p 基因轉錄；PVT1 與miR-18b-5p 相互競爭，共同調節HIF1α 的表達，進而調控膽囊癌細胞的增殖、轉移和侵襲[30]。

1.6 FOXD2-AS1

FOXD2-AS1 是FOXD2 基因反義鏈形成的一個轉錄本。研究發現，在膀胱癌中，FOXD2-AS1 與AKT/E2F1 形成負反饋環。FOXD2-AS1與TRIB3 啟動子區形成RNA-DNA 復合物，抑制TRIB3 基因的轉錄活性，促進E2F1 的表達，而E2F1 是細胞周期中G/S 期轉變的重要轉錄因子。同時，E2F1 可與FOXD2-AS1 啟動子區結合，增強FOXD2-AS1 的轉錄活性[31]。在結直腸癌中，FOXD2-AS1 通過與miR-185-5p 相互作用，促進結直腸癌的發生和發展[32]。

利用GEO 數據庫進行分析，發現與癌旁正常組織相比，FOXD2-AS1 在膽囊癌組織中明顯高表達，而敲減FOXD2-AS1 的表達后，可抑制膽囊癌細胞系GBC-SD 的增殖、轉移和侵襲，促進細胞凋亡。機制研究發現，FOXD2-AS1 通過招募DNMT1 以促進MLH1 啟動子區甲基化，從而抑制其表達，進而促進膽囊癌的進展[33]（圖1D）。

2 與膽囊癌化療耐藥相關的lncRNA

以吉西他濱為代表的一線化療藥物是局部進展期或轉移性膽囊癌患者的主要治療方法，但是往往化療后不久即發生腫瘤迅速進展，或是出現復發和轉移，與膽囊癌對吉西他濱耐藥有關。腫瘤細胞耐藥包括固有耐藥和獲得性耐藥[34]，涉及耐藥基因突變、腫瘤細胞異質性和表觀遺傳學等機制[35]。研究發現，非編碼RNA 在多種惡性腫瘤中介導腫瘤細胞的化療耐藥[36]。在膽囊癌中已發現與耐藥相關的lncRNA，包括GBCDRlnc1 和SSTR5-AS1，其在膽囊癌的化療耐藥中扮演重要角色。

2.1 GBCDRlnc1

GBCDRlnc1 是一種新命名的lncRNA。研究人員首先構建了多柔比星耐藥的膽囊癌細胞株，與多柔比星敏感細胞株同時進行測序，獲得差異表達的lncRNA，其中GBCDRlnc1（ENST00000425894）是增強自噬活性以及與耐藥潛能最相關的lncRNA，并且GBCDRlnc1 在膽囊癌中明顯高表達，與預后顯著相關。機制研究發現，GBCDRlnc1 與PGK1 直接相互作用，通過抑制PGK1 泛素化而上調其蛋白的表達水平，誘導細胞自噬以增強化療耐藥[37]（圖2A）。

2.2 SSTR5-AS1

SSTR5-AS1 是SSTR5 基因反義鏈的一個轉錄本。研究發現，SSTR5-AS1 在膽囊癌組織和細胞系中均表達升高，尤其是在吉西他濱耐藥的膽囊癌細胞系中的表達顯著升高，并且其表達水平與膽囊癌患者的生存率呈負相關。研究證實，SSTR5-AS1 通過抑制腫瘤細胞凋亡以促進吉西他濱耐藥，而敲低SSTR5-AS1 的表達可以增強膽囊癌耐藥細胞株對吉西他濱的敏感性。SSTR5-AS1 可與NONO 蛋白特異性結合，而NONO蛋白是一種參與轉錄調節和RNA 剪接的RNA 結合蛋白，可以通過蛋白酶體途徑降解。SSTR5-AS1 通過與NONO 蛋白結合后抑制其降解，從而升高NONO 蛋白的水平，參與膽囊癌細胞的化療耐藥[38]（圖2B）。

Fig.2 The potential mechanism of chemoresistance-associated long non-coding RNAs (lncRNAs) in gallbladder carcinoma (GBC).A: GBCDRlnc1 promotes drug-resistance by interacting with PGK1 and inhibiting its ubiquitin-mediated degradation;B: SSTR5-AS1 enhances gemcitabine resistance via binding to NONO protein and inhibiting its degradation.圖2 膽囊癌相關lncRNA 耐化療機制

3 小結與展望

lncRNA 在惡性腫瘤的發生和發展中具有不可忽視的作用。越來越多的證據表明，lncRNA不僅在細胞的生長和分化以及胚胎發育等生理現象中扮演重要角色，也在惡性腫瘤的發生和發展中發揮關鍵作用。

lncRNA 在膽囊癌中的定位、表達、作用機制和功能的總結見表1。盡管數十年來的非編碼基因研究已揭示出許多重要的lncRNA，但尚有大量潛在的lncRNA 有待發現和研究。膽囊癌是惡性程度極高的惡性腫瘤，目前治療方法有限，治療效果差。鑒于當前包括lncRNA 在內的非編碼RNA 的高質量研究還較少，研究的深度和廣度均不足，因此今后迫切需要開展更多高質量的研究以揭示膽囊癌的發生和發展機制以及轉移、侵襲和耐藥的機制，提高膽囊癌的治療效果，延長患者的生存期。

表1 lncRNA 在膽囊癌中的定位、表達、作用機制和功能Table 1 The localization,expression,mechanism and function of long non-coding RNAs (lncRNAs) in gallbladder carcinoma (GBC)