小檗堿/殼聚糖季銨鹽納米粒的制備及其表征

單璐，張維芬

(1.錦州醫科大學附屬第三醫院藥劑科，遼寧 錦州 121000；2.濰坊醫學院藥學院，山東 濰坊 261053)

小檗堿(berberine，Ber)是從黃連、三角、三顆針等中草藥中提取的異喹啉類生物堿[1]，無臭、味苦、黃色粉末，有明確的化學結構。臨床上常作為清熱解毒、抗感染藥物，是一種傳統的用于治療細菌感染性胃腸道疾病的良藥[2]。近年來研究發現，小檗堿有抗潰瘍性結腸炎[3]、降血糖[4]、抗腫瘤[5]、抗阿爾茨海默病[6]、保護心腦血管[7]等多種藥理活性。然而，鹽酸小檗堿極性較大，臨床中常用劑型為片劑和注射劑，片劑口服吸收差、維持時間短[8-9]；注射劑代謝快，需要增加注射頻次。小檗堿難以達到有效治療濃度，而大劑量易引起藥疹、過敏性休克等不良反應。因此，研發新型小檗堿制劑，以克服其難溶性、增加其吸收率，延長給藥間隔，降低給藥劑量，是目前亟待解決的問題。

納米粒(nanoparticles，NPs)由于其精細尺寸，具有良好的分散性和被細胞吞噬的特點，對難溶性藥物，能提高其溶解度和穩定性；調控釋藥速度、延長體內滯留時間，減少不良反應[10]。以納米粒作為載體，可以解決小檗堿上述缺點。

殼聚糖(chitosan，CS)作為天然的堿性多糖，具有生產成本低、良好的生物降解性及粘膜吸附性等特點，因此廣泛應用于新劑型的藥物載體材料[11-13]。近年來，CS作為新劑型材料微球、凝膠、納米粒等應用中備受關注[14]。然而，殼聚糖在堿性條件下溶解性下降使其應用受到局限。殼聚糖季銨鹽又稱N-(2-羥丙基)三甲基氯化銨殼聚糖(N-(2-hydroxyl)propyl-3-trimethyl ammonium chitosan chloride，HTCC)，不僅提高了水溶性，又保留了其優良特性[15-16]。

本實驗采用離子交聯法制備小檗堿/殼聚糖季銨鹽納米粒，并研究其理化特性，考察其作為新型給藥系統的可行性，為小檗堿新劑型的開發提供依據。

1 一般資料

1.1 儀器與試劑

冷凍干燥機FD-1D-50(北京博醫康實驗儀器有限公司)，HC-3618R高速冷凍離心機(科大創新股份有限公司中佳分公司)，UV-8000/8000A/8000S雙光束紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司)，FT-IR Avater-360傅里葉變換紅外光譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)，JEM-1200EX透射式電子顯微鏡(日本電子)，NanoZS90型納米粒度儀(Malvern Instruments Ltd. UK)。殼聚糖季銨鹽(取代度85%，純度80%；濰坊醫學院藥劑教研室提供)，磷酸二氫鈉(天津市科密歐化學試劑有限公司，批號20080114)，磷酸氫二鈉(天津市科密歐化學試劑有限公司，批號20070829)。

1.2 實驗方法

1.2.1 小檗堿/殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

1.2.1.1 殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

精密稱取適量HTCC和三聚磷酸鈉(tripolylphosphate，TPP)溶于蒸餾水中，得1.6 mg/mL的HTCC和1.0 mg/mL的TPP水溶液。水溶液室溫下磁力攪拌過夜后，高速離心(5000 r/min)10 min取上清液。

1.2.1.2 制備條件的優化

考察HTCC和TPP在不同質量比、不同pH條件下制得的納米粒，通過NanoZS90型納米粒度儀測量納米粒的平均粒徑和多分散系數(PDI)，測量3次取平均值，得二者最佳反應條件。

1.2.1.3 小檗堿/殼聚糖季銨鹽納米粒的制備

精密稱取不同量的Ber，室溫攪拌下溶于等量的HTPP NPs混懸液，得藥物/載體比例為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8混懸液，通過NanoZS90型納米粒度儀測量納米粒的平均粒徑和PDI，得反應最優比。將優化的納米粒溶液4 ℃超速離心(12 000 r/min)30 min，分離納米粒子，冷凍干燥得Ber/HTCC納米粒。

1.2.2 小檗堿/殼聚糖季銨鹽納米粒的表征

1.2.2.1 形態學表征：用銅網沾取適量優化后制得Ber/HTPP NPs混懸液，待自然風干后，用透射電鏡觀察銅網上納米粒的形態和粒徑并拍照記錄。透射電鏡的工作電壓為100 kV。

1.2.2.2 紅外表征：分別取適量HTCC、Ber、HTCC NPs和Ber/HTCC NPs樣品粉末，采用KBr壓片法進行紅外光譜掃描檢測，掃描范圍400～4000/cm。

1.2.2.3 載藥量和包封率：分別取1.5 mL不同藥物/載體比例的Ber/HTCC NPs混懸液，4 ℃下高速離心(12 000 r/min)10 min，水洗3次，收集上清液，定容至50 mL容量瓶中。紫外可見分光光度計測定421 nm下吸光度A，代入標準曲線計算游離小檗堿的量(n=3)。按下式計算納米粒的載藥量和包封率：

載藥量(drug loading，DL)=

包封率(encapsulation efficiency，EE)=

1.2.2.4 體外釋放：分別將Ber溶液和不同藥物/載體比例的Ber/HTCC NPs混懸液移入透析袋(8000～12 000 Da)內，置于盛有PBS(pH=7.4)緩沖溶液的錐形瓶中，放入轉速100 r/min的搖床中恒溫震蕩(37±0.5)℃，定時取釋放液，以空白納米粒溶液為對照，在421 nm處測定吸光度，根據標準工作曲線計算釋放的Ber濃度。代入下列公式計算納米粒中藥物的累計釋放率。

1.2.3 統計學方法

采用 SPSS 22.0軟件進行單因素方差統計學分析，所有實驗結果均以均數±標準差表示。各組間采用LSD檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 制備HTCC NPs的最優條件

實驗觀察，滴入TPP后反應迅速，當在中性環境中HTCC和TPP質量比為5∶1時，生產淡藍色乳光的透明混懸液，見圖1，且丁達爾效應明顯。測得平均粒徑為122.2 nm，見圖2，PDI=0.128，粒徑均一，分散均勻，不易沉淀。pH =7時，PDI最小，混懸液最穩定。pH>7，混懸液出現白色絮狀沉淀，見圖3。

圖1 HTCC NPs混懸液的狀態

圖2 HTCC NPs粒徑分布圖

圖3 HTCC NPs粒徑隨pH的變化

2.2 Ber/HTCC NPs的粒徑、PDI、載藥量及包封率

Ber/HTCC NPs的載藥量和包封率隨藥物/載體比例變化情況見表1，隨著藥物/載體比例逐漸增加納米粒的載藥量和包封率也在增大，且各比例之間載藥量和包封率比較均有顯著性差異(P<0.05)。當藥物/載體比例為1∶2時，納米粒分散性較差，易聚集，不利于保存。本實驗優選藥物/載體比例為1∶4條件，Ber/HTCC NPs的平均粒徑為(296.8±5.3)nm，PDI為0.181±0.017，載藥量為(14.27±0.017)%，包封率為(94.17±0.11)%。

表1 不同藥物載體比例小檗堿/殼聚糖季銨鹽納米粒的載藥量、包封率

2.3 Ber/HTCC NPs的體外釋放

體外釋放結果見表2，由表可知，不同藥物/載體比例的納米粒A(1∶8)、B(1∶6)、C(1∶4)、D(1∶2)在最初2 h內累計釋放量分別為23.22%、23.42%、18.39%和34.70%，沒有突釋現象。24 h時累計釋放量分別為71.07%、58.56%、52.63%和78.55%，納米粒中Ber釋放緩慢，納米粒具有緩釋作用。48 h時累計釋放量分別為71.59%、62.26%、55.46%和79.46%，隨著時間的延長，納米粒中Ber釋放速率降低。

表2 不同藥物載體比例小檗堿納米粒的體外釋放

2.4 Ber/HTCC NPs的形貌與結構

2.4.1 透射電鏡觀察

圖4A為最優條件制得的HTCC Nps 透射電鏡圖，空白納米粒大小均勻，粒徑均一，呈圓整球型，觀察粒徑50 nm左右，小于動態光散射法測得的平均粒徑；圖4B為最優條件制得的Ber/HTCC NPs 透射電鏡圖，載藥納米粒呈類球型，粒徑均勻，分散均一，顆粒皺縮有水泡，粒徑130 nm左右，較動態光散射法測得的平均粒徑小。

A：HTCC NPs(50 000×)；B：Ber/HTCC NPs(100 000×)

2.4.2 紅外表征

紅外光譜如圖5所示，Ber在1568.29/cm為苯環骨架彎曲振動，1600.72/cm、1506.26/cm分別代表為亞胺基和呋喃基特征峰，1388.11/cm附近為C-N伸縮振動峰，1231.07和1037.02/cm為C-O-C特征振動峰。HTCC在3409.68/cm處為-NH伸縮振動峰，2923.13/cm處為-OH特征吸收峰，2131.13/cm處為亞甲基的伸縮振動峰，1480.53/cm處為N上羥丙基三甲基銨基的彎曲振動峰，1416.16/cm處為氧橋伸縮振動吸收峰和N-H拉伸振動，1383.97/cm處為O-H彎曲振動峰[15-17]。HTCC Nps 與HTCC相比1655.54/cm處吸收峰移至1649.52/cm，1563.15/cm處吸收峰消失，1575.21/cm處產生新的吸收峰，說明TPP的磷酸基團連接到了HTCC的氨基位點上。Ber/HTCC NPs與HTCC Nps相比1500～1600/cm處為Ber苯環骨架彎曲振動峰，800/cm附近處為苯環C-H的彎曲振動，表明Ber被成功包裹在納米粒中。

圖5 納米粒的紅外光譜圖

3 討 論

離子交聯法制備條件溫和，過程簡單，重復性好，不需要其它有機溶劑，降低毒性[18-19]。本實驗采用離子交聯法制備納米粒，TPP作交聯劑，室溫下即與CS分子間的相反電荷相互交聯形成納米粒[20-21]，且安全無毒。Calvo[22]等人是首次描述用TPP通過離子交聯法制備CS Nps的，他們發現當CS和交聯劑在特定的濃度可以形成粒徑300～1000 nm的納米顆粒。納米粒作為藥物載體，空白納米粒粒徑越小其載藥量可能越高。納米載藥后粒徑會不同程度增大，因此，制備超小粒徑空白納米粒(<100 nm)是關鍵。

CS衍生物—HTCC，改善了CS的水溶性，引入正電基團，增強了CS分子鏈的正電性，從而促進其與TPP離子交聯制得納米粒。正、負電基團比例嚴重影響納米粒粒徑大?。篢PP濃度大時，反應體系局部濃度過高，CS分子大量瞬間聚集，生成大顆粒絮狀物；CS為高分子多糖，其濃度影響溶液的粘度和分子鏈的狀態[23]，CS濃度大，溶液粘度增加，表面張力增大，擴散速度減慢，生成的納米粒粘附聚集，進而影響混懸液顆粒粒徑的大小。反應物濃度過高，顆粒碰撞接觸機會增多，從而使顆粒發生聚集幾率增大。PDI是評價納米混懸液穩定性和粒徑均勻性的指標，反應粒徑分布范圍：PDI值高，粒徑差異大，分布范圍廣；PDI值低，粒徑大小均勻，分布范圍窄。當PDI<0.3時，納米粒粒徑大小分布比較集中，分散均勻[24]。Masarudin[25]等人研究發現，PDI越小，混懸液穩定且粒徑均勻；PDI大，穩定性差，易發生聚集。

pH影響納米粒內電荷分布，pH較小，顆粒上電荷增加，粒子內相互排斥，從而粒徑增大，分散不均勻。pH中性時，粒子排斥減弱，粒徑減小，分散均一。實驗發現，pH=5時，混懸液PDI指數大，溶液不穩定；pH=8時，溶液中即產生白色絮狀物；pH=7時，PDI最小，混懸液穩定，顆粒粒徑大小分布較集中，分散性好，不易聚集，利于保存，可作為實驗最優條件。

空白納米粒載藥后粒徑明顯增大，預實驗發現當藥物/載體比例為1∶1時，超出載體載藥范圍，Ber聚集沉淀。隨著投藥量的增加，納米粒的載藥量和包封率增加，且各組之間比較均有統計學差異(P<0.05)。當藥物/載體比例為1∶2時，PDI>0.3，體系不穩定[26-27]。

HTCC Nps 透射電鏡顯示，納米粒呈圓整球型，大小均勻，觀察實際粒徑50 nm左右，與粒度儀分析結果有偏差。因為透射電鏡樣品經過了干燥，而粒度儀樣品是在溶脹條件中進行測定；另一方面，粒度儀是利用顆粒對光的散射數據計算出的結果，即小顆粒散射角小，大顆粒散射角大，即使顆粒之間有輕度粘連也會影響計算結果。載藥后納米粒粒徑顯著增大，一方面可能因為Ber與HTCC Nps表面或核心發生吸附，另一方面可能由于Ber是水溶性，在樣品干燥過程中失水皺縮、團聚。樣品經過干燥處理后發生了釋水、收縮，導致透射電鏡觀察到的載藥納米粒形態不圓滑。研究發現，離子交聯法制得的小檗堿/殼聚糖納米粒突釋效應小，可能是因為Ber與CS發生電荷作用[28]。本實驗制得的納米粒在2 h內累計釋放量未超過20%，48 h累計釋放量達50%。說明納米粒初始階段釋放緩慢，沒有突釋現象，隨著時間延長，藥物緩慢釋放，有緩釋作用，可制成緩控釋制劑進一步供臨床應用研究。

綜上所述，本實驗用離子交聯法成功制備了Ber/HTCC NPs，該納米粒粒徑均勻，不易聚集，載藥量高，有緩釋作用，提高生物利用度，減少毒副作用，具有一定研發前景，但在后續工作中，提高藥物包封率、藥物的靶向性、減少體內外毒性等問題有待進一步研究。