基于CK抑制劑虛擬篩選的補骨脂鹽炙工藝研究

范冰冰，韓宇，仲人中，郭晏華，馬壯

(1.錦州醫科大學，遼寧 錦州 121000；2.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽110847)

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是多因素所致的以骨含量降低、骨組織的微細構型被破壞為特質，引發骨折、呼吸困難等病癥的一種慢性骨質病癥[1-7]。補骨脂為豆科植物Psoralea corilyfolia L.的干燥成熟果實，以補腎助陽、固精縮尿為主要功效[8]。傳統醫學普遍認為腎藏于精，精足生髓，髓隱于骨中，充溢骨骼。因此，補骨脂通過補腎助陽發揮補腎壯骨的作用，在預防和治療骨質疏松方面具有一定的優勢。補骨脂作為抗骨質疏松癥(OP)的慣用中藥材，需炮制入藥，其鹽炙法始于宋·《局方》，現代鹽炙法為《中國藥典》所收錄。鹽炙走腎，經鹽炮制過的補骨脂可增強補腎納氣作用[9-11]，在抗OP方面有獨特的優勢和開發的潛能。

研究表明，長期性服用借助于促進新生骨質恢復骨量的中藥有增加骨吸收的風險，而CK是最早被發現位于破骨細胞中涉及骨質再吸收的主要酶，被很多學者作為抗OP研究的熱門靶向蛋白酶。CK[12]存在誘發OP的潛在可能性，其蛋白及mRNA的表達水平抑制被證實能夠治療骨質疏松癥[13-14]。補骨脂化學成分復雜，藥理作用廣泛，因而本研究借助蛋白質結構虛擬篩選技術[15-16]，將CK作為預防和治療OP的關鍵靶點，得到補骨脂中抑制破骨細胞活性的成分。以篩選出的成分含量為評分指標，選用星點設計-效應面法甄選補骨脂鹽炙工藝技術，實現補骨脂鹽炙后有效抑制CK而發揮抗OP目的，為補骨脂鹽炙生產工藝的下一階段研究提供理論支撐。

1 材 料

1.1 儀器與軟件

操作軟件UCSF Chimera(http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/)；對接軟件UCSF DOCK6.0(http://dock.compbio.ucsf.edu/DOCK_6/index.htm)；戴爾4核計算機(美國戴爾科技有限公司)；ISIS-Draw軟件Open Bable(http://openbabel.sourceforge.net)。

高效液相色譜儀(日本島津LC-10AT)；紫外檢測器(SPD-10AVP)；紫外-可見分光光度計(UVmini-1240)；電子分析天平(Sartorius CP225D)；超聲清洗器(KQ2200型)。

1.2 試藥

補骨脂素(四川維克奇生物制劑有限公司，批號：wkq14022602)；補骨脂甲素(四川維克奇生物制劑有限公司，批號：wkq14080805)；補骨脂生用品，購于安徽省亳州中藥材市場(遼寧中醫藥大學中藥鑒定教研組翟延君教授鑒別為正品藥材)；食用鹽(遼寧鹽局總廠)；黃酒(紹興水鄉黃酒釀制有限責任公司)；娃哈哈純凈水；乙腈、甲醇(色譜純，科密歐有限公司)，其它化學試劑(分析純)。

2 方 法

2.1 虛擬篩選

本研究采用實驗室自建補骨脂化學成分庫，該數據庫包含補骨脂酚、補骨脂素、補骨脂二氫黃酮等29種化學成分。以mol格式采用ISIS-Draw軟件建構基于補骨脂化學組分的結構信息，充分運用Open Bable應用軟件將分子的2D結構轉變為3D結構，附加氫及Gasteiger電荷于結構，以mol2的格式保存文件。系統分析受體的構型，進而辨認受體的活性分布區域，在活性區域追蹤可能的聯結位點。探求與受體聯結位點相適應的配體分子，獲致備選化合物，對備選化合物展開評估和能量評級，并選取其作為下一階段實驗指標性成分。

2.2 對照品溶液制取

精密稱取適量補骨脂甲素、補骨脂素對照品，依序置10 mL棕色容量瓶中，添至甲醇溶解，制得濃度為113 μg/mL、212 μg/mL的對照品儲備液，稀釋制得每1 mL溶補骨脂甲素21.2 μg、補骨脂素11.3 μg混合對照品溶液，供備用。

2.3 供試品溶液制取

精密稱取補骨脂鹽炙品粉末，過篩(60目)0.2 g，置25 mL容量瓶中，添至20 mL甲醇，超聲波提取30 min，放冷，添入甲醇至刻度，搖勻，靜置，微孔濾膜(0.45 μm)濾過即得。

2.4 色譜條件

色譜柱：Kromasil-C18(4.6 mm×250 mm，5 um)；流動相：乙腈(A)-0.3%冰乙酸(B)，梯度洗脫(0～10 min，63%～55% B；10～20 min，55%～50% B；20～30 min，50%～45% B；30～50 min,45%～35% B)；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：245 nm；進樣量：10 μL。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察

精密汲取4、8、10、12、16、20 μL混合對照品液注入HPLC，精確測量。以混合對照品溶液進樣量(μg)為橫軸(X)，色譜峰面積為縱軸(Y)，繪出標準曲線，得補骨脂素回歸方程Y=7 917 889.8729x + 16 451.5714，相關系數r=0.9992，線性范圍0.0848～0.4240 μg；補骨脂甲素回歸方程Y=2 372 623.9892x+4 983.0000，相關系數r=0.9997，線性范圍0.0848～0.4240 μg。

2.5.2 精密度試驗

精密汲取混合對照品溶液，一日內連續5次進樣，記錄補骨脂素、補骨脂甲素色譜峰面積，計算得RSD分別為0.54%、1.26%，表明儀器精密度良好，見表1。

表1 精密度結果

2.5.3 穩定性實驗

配制供試品溶液，依序置放0、4、8、12、16 h進樣分析，記述補骨脂甲素、補骨脂素的色譜峰面積，計算得RSD分別為2.55%、2.31%，表明供試品溶液在該條件下穩定性良好，見表2。

表2 穩定性結果

2.5.4 重復性實驗

精密稱取同一批次5份鹽炙補骨脂，按照“2.2”項下方法平行配制供試品溶液，進樣分析，記述補骨脂甲素、補骨脂素色譜峰面積，計算得RSD分別為1.98%、0.62%，闡明該方法重復性良好，見表3。

表3 重復性結果

2.5.5 回收率實驗

精密稱取可知含量的6份鹽炙補骨脂，每份依其1:1比例添補骨脂甲素、補骨脂素對照品，按照“2.2”項下方法配制，平均回收率分別為101.2%、98.5%，RSD分別為2.20%、1.90%，闡明此方式回收率較高，見表4。

表4 加樣回收率試驗結果(n=6)

2.6 星點設計與效應面分析

2.6.1 實驗設計

基于Design-Expert 8.0.7.1軟件的Central Composite 實驗參數設計方案，擷取悶潤時間(A)、炒炙時間(B)、炒炙溫度(C)為實驗研究三因素，以補骨脂素、補骨脂甲素兩種成分總含量(mg/g)為響應值(Y)。參照星點設計分析方法，每一因素依次設立5水平，分別以±1.73、±1、0表示其自變量水平。代碼見表5。采行上述軟件展開多元回歸擬合，制取二次多項回歸模型。

表5 星點設計-效應面法實驗設計表

3 結 果

3.1 分子對接

從蛋白質晶體結構數庫PDB(http://www.rcsb.org/pdb)中獲得CK，見圖1，及其配體復合物的晶體結構(PDB code:3KWZ )視作分子對接的受體模型。補骨脂分子庫存在8個分子可與CK順利進行對接，并依循能量由低至高的次序排列，見表6。

圖1 CathepsinK 的晶體結構

表6 分子對接打分表(kcal/mol)

3.2 星點設計及計算結果

見圖7。

表7 星點設計與結果

3.3 模型擬合

Y=2.20+0.27A+0.12B-0.19C-0.0057AB+0.012AC-0.13BC-0.0065A2-0.25B2-0.23C2，其相關系數R2=0.9193，標示Y(兩種成分的總含量)真實值與預估值之間有較優的擬合度，故該模型可用于預判補骨脂鹽炙生產工藝。繪制各因變量曲面圖，見圖2。

圖2 A、B、C三因素對兩種成分總含量影響的效應面3D圖

3.4 方差分析

表8可推斷，在實驗預設的區域范圍內，A、B、C這3個因素對Y皆有顯著影響?；貧w方程失擬檢測并不顯著，闡明實驗結果受未知因素干涉極小。經F值驗證標示總模型方程顯著，此方程與實際情況有較佳擬合度。

表8 回歸分析結果

系統分析，悶潤補骨脂10.22 h，171 ℃炒炙12 min為其理想的鹽炙工藝參數

4 討 論

計算機輔助藥物設計(computer aided drug design，CADD)[17-23]是一種設計和優化先導化合物的方法，以計算機化學為基礎，采取計算機的模擬、計算和預算藥物與受體生物大分子之間的關系。中藥現代化的已然進展，CADD被譽為連接傳統中醫藥和現代科學的重要紐帶，也為中藥的藥效物質基礎研究提供了新方法。本研究將CK三維結構的活性位點和補骨脂中的化學分子進行對接，旨在利用分子虛擬篩選高通量、高速率、高準確性的優勢，尋找中藥補骨脂中CK的抑制劑。傳統藥理實驗證明補骨脂素、補骨脂甲素具有較好的抑制破骨細胞活性作用，其在補骨脂中的含量也較高，分別屬于香豆素類及黃酮類化合物，而豆科植物的黃酮類化合物具有植物雌激素樣作用，可適度調節絕經后婦女的骨含量，是潛在的抗OP有效物質。根據補骨脂虛擬篩選結果和相關文獻報道，進而選取CK抑制劑中的補骨脂素及補骨脂甲素作為后續實驗的目標性成分。與傳統篩選方法相比，省去了繁瑣的實驗步驟、節約實驗成本、減少實驗時間，為目標成分的快速篩選提供有力支撐。

星點設計-效應面法[24-30]是綜合數學分析、統計分析方法復合于一體的援用于線性及非線性數據模型的實驗設計方法，能夠深入研究多因素的交互作用，甄選出相對較優條件，具有實驗次數少、實驗精度及預測性高等優點，彌補了正交設計和均勻設計的不足，使結果更加可靠。本研究采行星點設計-效應面法，采用Design-Expert 8.0.7.1軟件分析，以抑制CK的補骨脂甲素、補骨脂素共含量為評價指標甄選理想鹽炙補骨脂工藝，增強其抗OP作用。悶潤補骨脂10.22 h，171 ℃炒炙12 min為其理想的鹽炙工藝參數，具有科學性和實用性，為補骨脂鹽炙品的擴大生產給予技術參考。