15 株湖南省豬圓環病毒2 型全基因組測序與遺傳進化分析

何世成，王紫微，2，丁朝陽，胡巧云，唐小明，王衛國，謝怡靈，王昌建

（1.湖南省動物疫病預防控制中心，湖南長沙 410014；2.衡陽技師學院，湖南衡陽 421101；3.婁底市動物疫病預防控制中心，湖南婁底 417000）

豬圓環病毒（porcine circovirus，PCV）是圓環病毒科圓環病毒屬成員，具有環狀單股負鏈DNA 基因組，是較小的動物病毒之一[1]，目前已發現PCV1、PCV2、PCV3 及PCV4 等4 種血清型[2]。

PCV2 基因組全長1 767 或1 768 bp，包含11個潛在開放閱讀框（ORF），其中ORF1、ORF2為主要的開放閱讀框。ORF1 的主要功能是編碼與復制酶相關的Rep 蛋白和Rep'蛋白[3]，ORF2 主要編碼衣殼蛋白（Cap 蛋白），而Cap 蛋白與病毒感染及免疫原性密切相關。PCV2 根據系統進化樹，可分為PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d 等8 種基因亞型[4]。1991 年，Clark 等[4]在加拿大西部地區表現斷奶仔豬多系統衰竭綜合征的病豬體內分離出一種PCV，發現其與PCV1 的抗原性和致病性均存在差異，因此將該病毒命名為PCV2。此后，全球多國豬場發現了PCV2 感染。1995 年，我國臺灣地區首次發現PCV2 感染[5]。目前我國PCV2感染率較高，流行廣泛，其中PCV2d 為優勢流行亞型[6-8]。

本研究通過了解湖南省PCV2 的遺傳變異情況，以期為PCV2 感染的免疫防控、疫苗研究和實驗室診斷提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

在湖南省821 份臨床病料和屠宰場豬淋巴結樣品中，通過檢測獲得30 份PCV2 陽性Ct ≤30的樣品核酸。

1.2 主要試劑和設備

PCV1 和PCV2 型雙重實時熒光PCR 檢測試劑盒，購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司；2×TaqMaster Mix，購自安諾論生物科技有限公司；50×TAE 緩沖液，購自北京索萊寶科技有限公司；Agarose，購自BIOWEST 公司；Super GelRed 核酸凝膠染料10 000×，購自蘇州宇恒生物科技有限公司；DL 2 000 DNA Marker 和DNA 凝膠回收試劑盒，購自東盛生物科技有限公司；PCR 擴增儀，購自西安天隆科技有限公司；瓊脂糖凝膠電泳儀，購自北京六一儀器廠；紫外凝膠成像儀，購自北京賽智創業科技有限公司。

1.3 引物設計

PCV2 全基因P1 和P2 擴增引物對，根據Gagnon 等[9]設計的引物合成（表1）。

表1 PCV2 全基因PCR 擴增的引物信息

1.4 全基因組擴增及測序

PCV2 擴增反應總體系為25.0 μL：無菌無核酸酶水7.5 μL，2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA 模板3.0 μL。PCV2 擴增反應程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性20 s，59 ℃（P1）/56 ℃（P2）退火30 s，72 ℃延伸1 min，共37 次循環；72 ℃延伸10 min。反應完成后取5.0 μL 擴增產物于1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳35 min，紫外凝膠成像儀中觀察結果、拍照。陽性條帶切膠回收后編號，送擎科生物有限公司進行雙向測序。

1.5 遺傳進化分析

將同一編號的4 個不同測序結果，通過DNAstar 中SeqMan 軟件進行拼接獲得全基因序列，選取國內外22 株PCV2 序列作為參考（表2），利 用NCBI 的BLAST 比對分析。PCV2 全基因及ORF2 的核苷酸序列同源性，利用DNAstar 中MegAlign 軟件進行比對；系統遺傳進化樹，使用MEGA-X64 生物軟件繪制，通過軟件中Clustal W比對方法進行比對；采用Neighbor-Joining法構建進化樹。

表2 PCV2 參考序列

2 結果與分析

2.1 全基因組擴增

使用P1、P2 引物，對PCV2 陽性樣品進行全基因組擴增，成功擴增出亮帶，產物與預期片段一致，分別為1 045、1 254 bp（圖1）。共獲得15株PCV2 全基因組（表3）。

表3 PCV2 分離株的來源信息

2.2 遺傳進化分析

對本試驗中獲得的15 株PCV2 全基因組與國內外上傳至GenBank 中的22 株PCV2 全基因組序列及ORF2 序列使用MEGA-X64 生物軟件繪制系統遺傳進化樹。

PCV2 全基因組遺傳進化樹（圖2）可看出，所有序列分為了4 個分支，而本研究獲得的15 株PCV2 全基因組分布在其中的3 個分支。其中：PCV2d 分支中的全基因組分布較散；PCV2b 中的PCV2-SY54-2017 全基因組單獨分列1 個分支，PCV2-CS139-2018 與外國的Po/PCV2/KNA/K-TB60/2013（MN935183.1）遺傳關系更近，另2株PCV2b 全基因組與國內分離株更接近；PCV2a中，本研究獲得的2株PCV2a全基因組在同一分支，并與國外分離株分列2 個分支。

進一步構建ORF2 遺傳進化樹（圖3）發現：PCV2 的ORF2 遺傳進化樹與PCV2 全基因組遺傳進化樹的分支基本相同，僅PCV2-SY54-2017 根據全基因組進化樹分析位于PCV2b 分支，而根據ORF2 進化樹分析位于PCV2d 分支中。最終以ORF2 進化樹分析結果為標準，將其此歸類為PCV2d分支，說明該毒株正在發生進化。根據ORF2 進化樹進行分型，本研究獲得的15 株全基因組可以分為10 株PCV2d、3 株PCV2b 和2 株PCV2a。

根據來源樣品的采集時間，對本研究獲得的15 株全基因組分析發現，2017 年分出3 株PCV2d亞型、1 株PCV2b 亞型，2018 年分出2 株PCV2d亞型、2 株PCV2b 亞型，2019 年分出2 株PCV2d亞型、1 株PCV2a 亞型，2020 年分出3 株PCV2d亞 型，1 株PCV2a亞型（表4），說 明2017—2020 年湖南省的PCV2 優勢基因亞型是PCV2d，并可能繼續保持下去。

表4 根據年份統計的15 株PCV2 全基因組基因亞型結果 單位：株

2.3 全基因組同源性分析

對本試驗獲得的15 株PCV2 全基因組序列及國內外上傳至GenBank 中的22 株PCV2 全基因組序列，運用DNAstar 軟件中的MegAlign 軟件進行同源性分析。

結果（圖4）顯示：本研究獲得的15 株PCV2全基因組的核苷酸序列同源性為94.7%～99.9%，與國內外的PCV2 全基因組同源性為93.1%～100%。不同基因亞型之間的同源性相差較大，PCV2a 與PCV2c之間的遺傳距離較遠，同源性最低。本研究獲得的2株PCV2a（PCV2-XX332-2020 和PCV2-CS865-2019）全基因組核苷酸大小均1 768 bp，與參考的國內外的PCV2a 分離株同源性為96.7%～99.9%。本研究獲得3 株P C V 2 b 亞型基因組，大小均為1 767 bp，與參考的國內外PCV2b 亞型分離株同源性為98.4%～99.9%，其中PCV2-CS139-2018 與Po/PCV2/KNA/K-TB60/2013（MN935183.1）分離株同源性最高，為99.9%。本研究獲得的10 株PCV2d亞型基因組，大小均為1 767 bp，與參考的國內外PCV2d 亞型毒株同源性為96.9%～100%，其中PCV2-LD398-2020 與2011 年河南登封分離的DF-1（JN119255.1）分離株同源性最高，為100%。

2.4 ORF2 氨基酸序列比對

本研究獲得的15 株PCV2 全基因組中，ORF2編碼的Cap 蛋白由233 或234 個氨基酸組成。PCV2 ORF2 氨基酸序列比對結果見圖5。

從圖5 可以看出，PCV2 的4 個亞型PCV2a、PCV2b、PCV2c 和PCV2d 都在部分位點具有保守的氨基酸。PCV2a 的第77、86～91、151、206 和222 位點的氨基酸與PCV2 其他亞型存在差異，第123、191 和206 位點僅在PCV2a 中存在部分全基因組的位點突變。PCV2b 在第57、89 及210 位點與其他亞型存在差異，在第59 位點存在K 和R 的差異。PCV2d 在第53、68、121、134 和215 位點上與其他亞型具有差異性，而在第169 位點存在不同方向的氨基酸突變，在最末端的234 位多1 個K。

本研究獲得的2 株PCV2a 亞型ORF2 氨基酸與參考的PCV2a 分離株相比較為穩定，在第8、47、63、130 和133 位點與參考 株KX960947 具有相同的突變。本研究獲得的3 株PCV2b 亞型的ORF2 氨基酸與其他參考分離株氨基酸序列無明顯差異。本研究獲得的10 株PCV2d 亞型中，除在第169 位點存在不同的氨基酸突變外，僅PCV2-HH192-2020 在第117 位點存在M →L 的突變；較為特別的是PCV2-SY54-2017，其在ORF2 遺傳進化樹分型中屬于PCV2d，但在第63、68、90、190、210 和215 位點存在PCV2b 保守的氨基酸，在第121 和134 位點具有PCV2d 保守的氨基酸。

3 討論

PCV2 可造成嚴重的臨床癥狀，且陽性率較高，給生豬養殖業帶來較大經濟損失。PCV2 基因亞型較多[4]，對其進行分子學研究可以為PCV2 疫苗開發及診斷技術建立提供依據。閆春春[10]擴增湖北省的部分PCV2 陽性樣品，獲得10 株PCV2分離株，其中有6 株PCV2d、4 株為PCV2b。夏德利[11]從2015—2018 年國內6 個省份的病料中，擴增了66 株PCV2 分離株，其中有40 株PCV2d、17 株PCV2b 和9 株PCV2a。李金鳳[12]擴增2017—2019 年廣西地區陽性樣品，共擴增到18個PCV2 全基因組序列和26 個ORF2 序列，其中包 括25 株PCV2d、15 株PCV2b 和4 株PCV2a。而本試驗獲得的15 株PCV2 分離株中，10 株屬于PCV2d 亞型，3 株屬于PCV2b 亞型，另2 株屬于PCV2a 亞型，并顯示出地理差異。本研究表明，PCV2d 已成為目前湖南省的主要流行基因型，其次為PCV2b，與我國其他省份研究結論相同。

PCV2 中的衣殼蛋白（Cap）與病毒抗原性和致病性相關，不同基因型編碼的氨基酸差異性較大[13-14]，因此不同亞型的PCV2 的同源性也具有較大差異。本研究中也顯示出不同亞型的PCV2 核苷酸之間的同源性差異較大。

調查[8]發現，目前市場上PCV2 商品化疫苗主要是基因亞型為PCV2a/b 的全病毒滅活疫苗。該疫苗對PCV2a 感染具有一定的交叉保護作用[15]。目前的研究[16-17]表明，存在對PCV2d 具有一定的交叉保護作用的疫苗。此外也有研究[18]證明，單獨使用PCV2b 或PCV2d 的VLPs 時，針對PCV2b 和PCV2d 的交叉保護效果不明顯，而在單獨免疫時效果較好，但疫苗是否真正對PCV2d 存在交叉保護還需要更多研究去證實。目前PCV2d亞型已成為流行株，對其流行的控制就需要更加重視。

PCV2 的Cap 蛋白存在6 個抗原表位，分別位于第69～83、113～127、156～162、169～183、193～207 和231～233 位[19]。根據氨基酸序列比對可看出，PCV2 的4 個亞型PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d 都在部分位點具有保守的氨基酸，不同亞型之間差異較大。其中PCV2d 在C 端的234 位點多1 個K，這可能會導致PCV2 衣殼表面構象表位的改變，造成免疫失敗[20]。本研究獲得的毒株全基因組在所處亞型之間的差異不大，基因較為穩定，存在的部分位點突變在其他參考株中也有出現。

綜上所述，PCV2d 已成為湖南省目前主要的流行基因亞型；PCV2 的4 個亞型PCV2a、PCV2b、PCV2c 和PCV2d 之間的差異較大，突變較為復雜；不同亞型之間的氨基酸序列差異較大，但在各亞型中，毒株間的ORF2 氨基酸序列無明顯突變。