益腎化濕顆粒對IgA腎病大鼠PPARγ/NF-κB信號通路的影響

姜 晨，忽星歌，姜 琳，徐榮佳，張佳佳，徐穎慧，郭雨昕，白 雪，黃詩琦

益腎化濕顆粒對IgA腎病大鼠PPARγ/NF-κB信號通路的影響

姜 晨，忽星歌，姜 琳，徐榮佳，張佳佳，徐穎慧，郭雨昕，白 雪，黃詩琦

天津中醫藥大學第一附屬醫院，國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300381

觀察益腎化濕顆粒對IgA腎病模型大鼠的治療作用，并基于過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路探討其作用機制。隨機選取10只SD大鼠作為對照組，其余大鼠以“牛血清白蛋白＋四氯化碳＋脂多糖”聯合用藥免疫誘導的方法建立IgA腎病模型，IgA腎病大鼠隨機分為模型組及益腎化濕顆粒低、高劑量（1.35、5.40 g/kg）組和潑尼松（5.40 mg/kg）組，每組15只。實驗第7～14周，各給藥組ig藥物，對照組和模型組ig蒸餾水，1次/d，觀察大鼠的一般狀態。給藥結束后，檢測各組大鼠24 h尿蛋白，考察各組大鼠腎組織病理情況；采用免疫組化法檢測各組大鼠腎組織腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）蛋白陽性表達情況；采用Western blotting法檢測各組大鼠腎組織PPARγ和NF-κB信號通路關鍵蛋白p65、p-p65蛋白表達情況。益腎化濕顆粒能夠顯著降低IgA腎病大鼠24 h尿蛋白、尿素氮和血肌酐水平（＜0.05、0.01），減少IgA腎病大鼠腎小球系膜區IgA沉積，顯著降低腎組織TNF-α沉積（＜0.05）；益腎化濕顆粒高劑量組大鼠腎組織p65和p-p65蛋白表達水平顯著降低（＜0.05），PPARγ蛋白表達水平顯著升高（＜0.05）。益腎化濕顆粒能夠減少IgA腎病大鼠24 h尿蛋白，改善腎功能及腎組織病理損傷，延緩IgA腎病進展，其作用機制可能與調控PPARγ/NF-κB通路有關。

IgA腎??；益腎化濕顆粒；腎組織損傷；過氧化物酶體增殖物激活受體γ；核因子-κB

IgA腎病是全世界范圍內最常見的原發性腎小球疾?。╬rimary acute glomerulo-nephritis，PCGN），是導致終末期腎臟病的主要原因之一，在亞洲地區尤為高發。以IgA為主的免疫復合物在腎小球系膜區沉積是IgA腎病典型病理表現。沉積在腎小球中的IgA免疫復合物介導細胞釋放促炎細胞因子如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），可誘導炎癥和腎小球硬化[1]，繼而導致腎功能損傷，而這一系列的損傷主要通過各種炎癥通路的激活和能量代謝異常導致的氧化應激、自噬與凋亡失衡而引起。研究表明，在IgA腎病過程中核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）炎癥通路被激活，相關蛋白高表達[2]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）是由配體激活的激素受體家族成員，參與細胞能量的代謝，也是參與腎臟病發生發展的關鍵受體。PPARγ可以選擇性地抑制NF-κB等因子轉錄，從而抑制炎癥反應，提示PPARγ的激活可能是IgA腎病潛在的保護機制之一。因此，調控PPARγ/NF-κB信號對治療IgA腎病有重要意義。

IgA腎病中醫病機以脾腎氣虛為主，兼見濕熱證、水濕證、血瘀證等[3]。益腎化濕顆粒益氣升陽化濕的功效契合IgA腎病的中醫病機特點。既往研究發現，益氣升陽法及益腎化濕顆粒中組方藥物能夠抑制腎病患者體內炎性反應，調節氧化應激和內皮功能，改善患者的腎功能，是治療慢性腎炎的有效方法[2,4]。研究表明，益氣健脾化濕法能夠通過上調PPARγ、抑制NF-κB等炎癥因子的表達，從而抑制炎癥反應及調節免疫，并且能抑制Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）介導的信號轉導，提高機體免疫力，減少炎性細胞造成的黏膜損傷[5-7]。因此，本研究通過建立IgA腎病大鼠模型，觀察腎組織病理以及腎組織PPARγ和NF-κB通路關鍵蛋白表達，從而探討益腎化濕顆粒治療IgA腎病的具體作用機制，為臨床IgA腎病的治療提供新的依據。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠70只，體質量180 g，6周齡，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）2019-0008。動物于天津中醫藥大學動物中心飼養，屏障環境，溫度20～25 ℃，濕度50%～70%，自由進食飲水。動物實驗經天津中醫藥大學倫理委員會批準（批準號TCM- LAEC2020056）。

1.2 藥品與試劑

益腎化濕顆粒（批號20201118，10 g/袋）購自廣州康臣藥業有限公司；醋酸潑尼松片（批號2106023，5 mg/片）購自浙江仙琚制藥股份有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、4%多聚甲醛、PBS溶液、DAPI、抗熒光淬滅封片劑、EDTA抗原修復緩沖液、TBST溶液、ECL發光液購自北京索萊寶科技有限公司；蓖麻油、四氯化碳購自上?；S；尿蛋白檢測試劑盒購自北京雷根生物技術有限公司；肌酐試劑盒（批號AUZ3562）、尿素氮試劑盒（批號AUZ3611）、蘇木素-伊紅（HE）染色套裝、Masson染色套裝（批號AF0003）購自上海碧云天生物技術有限公司；HRP標記的山羊抗兔抗體（批號GB23303）、p65抗體（批號GB11142）、β-actin小鼠單克隆抗體（批號GB12001）購自武漢塞維爾生物科技公司；IL-1β單克隆抗體（批號ab254360）、TNF-α兔單克隆抗體（批號ab215188）購自英國Abcam公司；FITC標記的兔抗大鼠IgA抗體（批號bs-10491R-FITC）購自北京博奧森生物技術有限公司；磷酸化p65（phosphorylated p65，p-p65）抗體（批號AF2006）購自美國Affinity公司；PPARγ抗體（批號16643-1-AP）購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.3 儀器

脫水機、染色機（意大利DIAPATH公司）；冰凍切片機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；凍臺（武漢俊杰公司）；病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；BX51型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物公司）。

2 方法

2.1 動物造模、分組與給藥

70只大鼠適應性喂養7 d后，隨機選取10只作為對照組，從實驗開始之日起ig蒸餾水（600 mg/kg），隔日1次，連續8周；實驗第6周和第8周尾iv 0.2 mL 0.9%氯化鈉溶液，1次/周。其余大鼠使用免疫誘導復合方法建立實驗性IgA腎病模型[8]：從實驗開始之日起ig BSA（600 mg/kg），隔日1次，連續8周；頸部sc 0.1 mL四氯化碳和0.3 mL蓖麻油，1次/周，連續8周；實驗第6周和第8周尾iv LPS（250 μg/kg），1次/周。第8周末測量每只大鼠尿蛋白水平，隨機取模型組和對照組大鼠各2只，取腎組織，包埋、固定，采用光鏡和免疫熒光檢測腎臟組織病理，觀察到模型組大鼠腎小球系膜細胞增生和基質增多，系膜區IgA沉積顯著，并伴有蛋白尿，而對照組無上述明顯表現，則確認造模成功[9]。

將IgA腎病模型大鼠隨機分為模型組、益腎化濕顆粒低、高劑量（1.35、5.40 g/kg）組和潑尼松（5.40 mg/kg）組，每組15只。益腎化濕顆粒溶于蒸餾水配制成質量濃度為0.40 g/mL的溶液；醋酸潑尼松片溶于蒸餾水配制成質量濃度為1.00 mg/mL的混懸液。各給藥組ig相應藥物，對照組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續8周。

2.2 益腎化濕顆粒對IgA腎病大鼠尿蛋白的影響

給藥結束的前2 d，大鼠禁食不禁水，置入代謝籠，記錄24 h尿量，收集約10 mL中層尿液，離心，采用麗春紅比色法測定尿蛋白濃度，計算24 h尿蛋白含量。

2.3 益腎化濕顆粒對IgA腎病大鼠腎功能的影響

給藥結束后，大鼠禁食12 h，吸入2.5%異氟烷麻醉，腹主動脈采血8 mL，離心取血清，于?80 ℃冰箱保存，使用全自動生化分析儀檢測血清中肌酐和尿素氮水平。

2.4 益腎化濕顆粒對IgA腎病大鼠腎組織病理的影響

大鼠處死后，取左腎組織，于4%多聚甲醛中固定，乙醇脫水、透明、浸蠟后，石蠟包埋并切片（厚3 μm），分別進行HE、Masson染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 益腎化濕顆粒對IgA腎病大鼠腎組織IgA免疫熒光的影響

取各組大鼠腎組織石蠟切片，沖洗、修復后，加入IgA抗體孵育，用PBS溶液沖洗3遍；避光滴加FITC標記的兔抗大鼠IgA抗體，37 ℃避光孵育50 min，用PBS溶液洗滌3次，稍甩干后，再滴加DAPI染液，室溫避光孵育10 min；滴加抗熒光淬滅劑后，用中性樹膠封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。熒光強度分級半定量參照國際通用的五級半定量法判定[10]。

2.6 益腎化濕顆粒對IgA腎病大鼠腎組織IL-1β、TNF-α蛋白表達的影響

取各組大鼠腎組織石蠟切片，二甲苯常規脫水、抗原修復，加入3%雙氧水溶液，室溫孵育40 min；再加入3% BSA，室溫封閉30 min；分別加入IL-1β、TNF-α抗體，4 ℃孵育過夜；加入HRP標記的山羊抗兔抗體，室溫孵育50 min；DAB顯色并水洗后，蘇木素復染3～5 min，梯度乙醇脫水、二甲苯透明并中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察并拍照，細胞核為藍色，陽性表達為黃色。

2.7 益腎化濕顆粒對IgA腎病大鼠腎組織PPARγ、p65和p-p65蛋白表達的影響

取各組大鼠右腎組織，置于5 mL凍存管中，于 ?80 ℃冰箱保存。加入裂解液研磨提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度，煮沸5 min使蛋白變性。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入脫脂牛奶，室溫封閉30 min；加入PPARγ、p65、p-p65和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜，加入TBST溶液洗滌5次，5 min/次；加入FITC標記的兔抗大鼠IgA抗體，室溫孵育90 min，加入TBST溶液洗滌5次，5 min/次；加入ECL發光液顯影，曝光后使用Alpha軟件分析條帶。

2.8 統計方法

3 結果

3.1 大鼠的一般情況

實驗過程中模型組大鼠死亡2只，潑尼松組死亡1只，解剖顯示大鼠皮下及腹腔膿腫。對照組大鼠在精神狀態、活動性、皮毛光澤度、飲食情況以及大小便方面表現良好。模型組大鼠則出現不同程度的精神不佳、食量減少、活動減少、皮毛光澤度下降及顏色較黃等情況，體質量較對照組有所降低。模型組sc四氯化碳時，皮下會有硬結出現，且脫毛較為嚴重；并且在尾iv LPS后會出現較之前更為嚴重的精神不振、食欲下降以及活動減少等現象。給予藥物干預后，各給藥組大鼠精神狀態、活動情況、飲食情況都較之前有所改善。

3.2 益腎化濕顆粒對IgA腎病大鼠24 h尿蛋白定量分析

如表1所示，與對照組相比，模型組大鼠24 h尿蛋白明顯增加（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠24 h尿蛋白均顯著降低（＜0.01）。益腎化濕顆粒兩組與潑尼松組無顯著差異。

3.3 益腎化濕顆粒對IgA腎病大鼠腎功能的影響

如表1所示，與對照組相比，模型組大鼠血肌酐、尿素氮均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血肌酐、尿毒氮水平顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.4 益腎化濕顆粒對IgA腎病大鼠腎組織病理的影響

HE染色和Masson染色結果（圖1）顯示，模型組大鼠的腎組織呈現不同程度的系膜細胞增生、系膜基質增多的病理改變，部分可見毛細血管襻受壓，管腔狹窄及球囊黏連。各給藥組腎小球系膜細胞增生和基質增多的狀況稍有緩解。

如圖2所示，模型組大鼠腎小球系膜區可見分支及顆粒狀IgA沉積，表明IgAN模型制備成功。除對照組外，其余各組IgA免疫熒光染色結果評分分級大多處于＋～＋＋，各給藥組腎小球系膜區IgA熒光強度明顯減弱。

表1 各組大鼠24 h尿蛋白及腎功能相關指標水平()

Table 1 24 h urine protein and renal function-related index levels of rats in each group ()

組別劑量/(g·kg?1)n/只24 h尿蛋白/mg血肌酐/(μmol·L?1)尿素氮/(mmol·L?1) 對照—828.88±6.8331.74±4.074.98±0.69 模型—1195.84±12.33##64.35±19.04##8.90±2.97## 益腎化濕顆粒1.351534.81±6.51**31.13±2.25**5.95±1.26* 5.401525.87±9.45**28.94±4.06**5.68±0.99* 潑尼松0.005 41429.26±9.77**29.30±1.35**5.41±0.50*

與對照組比較：##＜0.001；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01

##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group

圖1 各組大鼠腎組織病理變化

3.5 益腎化濕顆粒對IgA腎病大鼠腎組織IL-1β、TNF-α蛋白表達的影響

如圖3所示，與對照組相比，模型組大鼠腎組織IL-1β、TNF-α陽性表達顯著增加（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織TNF-α沉積顯著減少（＜0.05），IL-1β沉積呈下降趨勢。

3.6 益腎化濕顆粒對IgA腎病大鼠腎組織PPARγ/NF-κB信號通路關鍵蛋白的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組大鼠腎組織p65和p-p65蛋白表達水平顯著升高（＜0.05），益腎化濕顆粒高劑量組和潑尼松組大鼠腎組織p65和p-p65蛋白表達水平明顯降低（＜0.05）。然而，模型組大鼠腎組織PPARγ蛋白表達水平與對照組無顯著差異，但存在升高趨勢；益腎化濕高劑量組PPARγ蛋白表達水平顯著升高（＜0.05）。提示益腎化濕顆粒高劑量組可能上調PPARγ蛋白表達，抑制NF-κB信號通路。

圖2 各組大鼠腎組織IgA沉積情況

與對照組比較：#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05，下圖同

圖4 各組大鼠腎組織p65、p-p65和PPARγ蛋白表達情況

4 討論

IgA腎病是一種自身免疫性疾病，各種原因導致的含IgA的免疫復合物的沉積以及免疫復合物介導的原位系膜細胞氧化應激、炎癥反應、促硬化介質生成及足細胞凋亡等是IgA腎病發病的主要機制。中醫認為IgA腎病以脾腎氣虛為本，兼見濕熱證、水濕證、血瘀證及風濕證，歷代各醫家也善用益氣健脾化濕之法治療IgA腎病[11-13]?！帮L”“濕”等致病因素在現代醫學中被認為是導致免疫炎癥反應的重要因素，而脾虛運化障礙下，水谷精微轉運異常，引發能量代謝障礙，可促使細胞線粒體功能及結構發生改變，影響正常細胞代謝和調節功能[14]。益腎化濕顆粒是健脾化濕代表方劑，重用黃芪為君，以升陽固表、益氣利水；配伍人參、白術、茯苓、炙甘草補氣養胃；柴胡、獨活、羌活、防風為升舉清陽、祛風除濕；半夏、陳皮、澤瀉、黃連除濕清熱；白芍固護陰液，防升陽祛風燥濕太過；全方共奏益腎健脾、升陽化濕、祛風利水之功效[15]，契合IgA腎病病因病機。本研究結果顯示，益腎化濕顆?？梢悦黠@改善IgA腎病大鼠24 h尿蛋白及腎功能，對IgA腎病有明顯的治療作用。從微觀病理學角度，益腎化濕顆粒能明顯減輕腎小球系膜細胞增生、基質增多及免疫復合物的沉積。

NF-κB通路被稱為炎癥的中央信號傳導途徑[16]，參與免疫應答、炎癥等生命過程，通常被活性氧、TNF-α和IL-1β等多種細胞外應激刺激所激活[17]。研究表明，NF-κB信號通路的活化是終末期腎病和IgA腎病疾病發展的關鍵[18-21]。生理狀態下，NF-κB主要位于細胞質中，與NF-κB抑制蛋白（inhibitor ofNF-κB，IκB）構成的復合物不活躍；當細胞受到刺激后，由IκB蛋白的信號誘導降解，造成NF-κB的活化，進而引起p65釋放和核易位[17]。雖然這種暴露引起的p65誘導激活通常是短暫的，但足以上調具有多種活性的靶基因的反式激活，包括細胞增殖、炎性細胞因子、趨化因子、凋亡介體的上調[21]。PPAR家族調控參與細胞增殖、分化以及炎癥和免疫相關蛋白的表達。PPARγ主要在脂肪組織、腸、腎上皮和免疫系統中表達，其編碼蛋白PPARγ可抑制p65的磷酸化和核易位從而調控NF-κB表達，進一步降低TNF-α水平，在炎癥反應及IgA腎病的發生和發展中發揮重要治療作用[22]。在巨噬細胞中，PPARγ還可作為炎癥的負調節劑[23]。此外，脂代謝異常與腎間質纖維化、腎功能衰竭密切相關，PPAR家族（PPARα、PPARβ、PPARγ）同時也是參與調控脂肪細胞分化和葡萄糖穩態關鍵細胞因子[24]，抑制PPARα/類視黃醇X受體α（retinoid X receptor α，RXRA）通路后，氧化脂肪酸水平下調繼而血清三酰甘油升高，促進IgA腎病腎小球硬化進展[25-26]。

本研究結果證明了益腎化濕顆粒能夠降低NF-κB信號通路關鍵因子的蛋白表達，其治療IgA腎病的機制可能通過上調PPARγ蛋白從而調控NF-κB信號通路。結果顯示，模型組大鼠腎組織p65、p-p65蛋白表達水平顯著升高，佐證了NF-κB信號通路的活化參與IgA腎病的發展過程。益腎化濕顆粒和潑尼松均能有效降低p65和p-p65的蛋白表達，通過調控炎癥經典通路治療IgA腎病。PPARγ蛋白檢測結果中，潑尼松并沒有發揮調節PPARγ的作用，而益腎化濕顆粒高劑量組能夠顯著升高PPARγ蛋白表達水平，從而體現了對疾病的正向反饋作用。益腎化濕顆粒是否確實通過調控PPARγ抑制NF-κB信號通路發揮抗炎、調節免疫的作用有待進一步驗證。

綜上所述，益腎化濕顆粒能改善IgA腎病大鼠蛋白尿及腎組織病理損傷，從而保護腎臟功能，其機制可能與調控PPAR-γ/NF-κB信號通路有關。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of Yishen Huashi Granules on regulation of PPARγ/NF-κB signaling pathway in IgA nephropathy rats

JIANG Chen, HU Xing-ge, JIANG Lin, XU Rong-jia, ZHANG Jia-jia, XU Ying-hui, GUO Yu-xin, BAI Xue, HUANG Shi-qi

First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, National Clinical Research Center for Chinese Medicine Acupuncture and Moxibustion, Tianjin 300381, China

To investigate the therapeutic effect of Yishen Huashi Granules (益腎化濕顆粒) on IgA nephropathy rats, and explore its mechanism based on peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ)/nuclear factor-κB (NF-κB) signaling pathway.Ten SD rats were randomly selected as control group. IgA nephropathy models were established in other rats by immune induction with the combination of bovine serum albumin, carbon tetrachloride and lipopolysaccharide. IgA nephropathy rats were randomly divided into model group, Yishen Huashi Granules low-, high-dose (1.35, 5.40 g/kg) groups and prednisone (5.40 mg/kg) group, with 15 rats in each group. During 7—14 weeks, rats in each administration group were ig drugs, rats in control group and model group were ig distilled water, once a day, the general state of rats were observed. After administration, 24 h urine protein of rats in each group was detected, and pathological condition of kidney tissue of rats in each group were investigated; Protein positive expressions of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) were detected by immunohistochemical method; Western blotting was used to detect the protein expressions of PPARγ and NF-κB signaling pathway key proteins p65 and p-p65 in kidney tissues of rats in each group.Yishen Huashi Granules significantly reduced 24 h urine protein, urea nitrogen and blood creatinine levels of IgA nephropathy rats (< 0.05, 0.01), reduced IgA deposition in glomerular mesangial area of ??IgA nephropathy rats, and significantly reduced TNF-α deposition in renal tissue (< 0.05); Protein expression levels of p65 and p-p65 in kidney tissue of rats in Yishen Huashi Granules high-dose group were significantly reduced (< 0.05), and PPARγ protein expression level was significantly increased (< 0.05).Yishen Huashi Granules can reduce 24 h urine protein in rats with IgA nephropathy, improve renal function and renal tissue pathological damage, and delay the progression of IgA nephropathy. Its mechanism may be related to the regulation of PPARγ/NF-κB pathway.

IgA nephropathy; Yishen Huashi Granules; kidney tissue damage; peroxisome proliferator-activated receptor γ; nuclear factor-κB

R285.5

A

0253 - 2670(2022)03 - 0751 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.03.014

2021-11-11

益腎化濕顆粒臨床應用研究和基礎研究開放課題（康藥合字2020第336號）

姜 晨（1982—），女，博士，副主任醫師，博士生導師，研究方向為中西醫結合治療腎臟病。Tel: 18622662919 E-mail: jcdoctor_tcm@163.com

[責任編輯 李亞楠]