ZEB1和ZEB2在子宮腺肌癥患者中的表達及意義

朱虹，吳綠，黃文倩，鄒霞，李云鳳，高軍

（1.南昌市第一醫院婦產科；2.南昌大學第三臨床醫學院，南昌 330006）

子宮腺肌癥作為一種常見的婦科疾病，其特征是子宮肌層內存在間質和子宮內膜腺體，伴隨著與子宮肌層相鄰的結締組織的增生和肥大，最常見的癥狀是進行性痛經、異常子宮出血、慢性盆腔疼痛和月經過多[1]，但其發病機制和病因目前還不清楚。子宮腺肌癥是一種良性疾病，但其生物學行為類似于惡性腫瘤，如異常增殖、遷移和侵襲[2]。有研究表明子宮腺肌癥的發生發展與上皮間質轉化（EMT)密切相關[3]。EMT是指上皮細胞獲得間質細胞的特性，失去上皮細胞的表型，以增強其侵襲及抗細胞凋亡能力的過程[4-5]。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）主要分布于上皮細胞中，與維持上皮細胞的表型密切相關，是一種關鍵的細胞粘附分子，E-cadherin表達減少是EMT的一個重要標志[6-7]。E-cadherin的下調被幾個轉錄因子抑制，包括ZEB1、ZEB2、SNAI1、SNAI2、Twist1、Twist2和E12/E47[8]。其中，ZEB家族(ZEB1/ZEB2)為鋅指轉錄因子代表，作為EMT的核心轉錄因子，與啟動子中E-box相互結合，抑制E-cadherin的表達，促進EMT的發生[9]。本研究中，我們通過免疫組化方法檢測ZEB1、ZEB2在子宮腺肌癥內膜及正常子宮內膜的表達差異，為子宮腺肌癥的發病機制提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年6月至2020年3月于南昌市第一醫院婦科就診的35例子宮腺肌癥患者行全子宮切除的子宮內膜組織作為實驗組，10例因宮頸上皮內瘤變行全子宮切除的內膜組織作為對照組。通過查詢南昌市第一醫院病歷信息系統，收集子宮腺肌癥患者的臨床特征包括患者的年齡、痛經情況、絕經狀態、孕次、產次、月經周期、血清CA125水平等內容。其中子宮腺肌癥患者的年齡范圍36～55歲，平均年齡為（45.26±4.455歲）。

1.2 主要試劑 本試驗采用HE染色和免疫組織化學方法檢測；兔源ZEB1多克隆抗體、兔源ZEB2多克隆抗體購自美國Abcam公司；DAB顯色試劑、免疫組化SP試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 HE染色 組織經石蠟包埋，切片后，烤片，然后脫蠟，水化。將已放入蒸餾水后的切片放入蘇木精(AR1180-1，博生德)水溶液中染色3 min，鹽酸乙醇分化液分化15 s，稍水洗，Scott返藍液(G1865，Solarbio)返藍15 s，流水沖洗，伊紅(AR11800-2，BOSTER)染色3 min，流水沖洗，脫水，透明，封片，鏡檢。

1.3.2 免疫組化 組織石蠟切片水化后使用檸檬酸緩沖液高壓加熱修復抗原。3%雙氧水室溫孵育10 min，以去除內源性過氧化物酶封閉液。在玻片上滴加5%BSA，37°C封閉30 min。每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗：ZEB1（1∶200）、ZEB2（1∶500），放入濕盒中，4°C孵育過夜。之后滴加二抗工作液，37°C孵育30 min。DAB顯色5~10 min；蘇木精復染3 min，鹽酸酒精分化，返藍；自來水沖洗1 min，脫水、透明、封片、鏡檢。

1.4 結果判定 免疫組化結果判定指標為細胞漿／細胞膜內棕黃色顆粒狀著色即為陽性。判定標準采用半定量評分法。免疫組化標記結果結合細胞染色的百分比及染色強度進行判定。染色強度：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞百分比：無陽性細胞為0分，l%～為1分，10%～為2分，50%～為3分，75%～。為4分。2項評分乘積≤4為陰性，＞4分為陽性。免疫組化結果由兩位經驗豐富的病理醫生通過雙盲法判定。

1.5 統計分析 所有數據均用SPSS19.0進行統計分析，組間采用卡方檢驗，ZEB1、ZEB2與患者的臨床病理特征的相關性采用Pearson相關性分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ZEB1、ZEB2蛋白在子宮腺肌癥中的表達情況ZEB1在子宮腺肌癥內膜和正常子宮內膜中的陽性表達率分別為74.29%（26/35）、30.00%（3/10）；ZEB2在子宮腺肌癥內膜和正常子宮內膜中的陽性表達率分別為22.86%（8/35）、20.00%（2/10）見圖1～2。ZEB1在子宮腺肌癥子宮內膜中陽性表達顯著高于正常子宮內膜（P=0.027）；而ZEB2在子宮腺肌癥子宮內膜中的陽性表達與正常子宮內膜相比沒有顯著差異（P=0.848）見表1～2。

2.2 ZEB1、ZEB2蛋白陽性表達與子宮腺肌癥臨床特征的相關因素分析 子宮腺肌癥子宮內膜組織中ZEB1、ZEB2的表達與患者的年齡、痛經、月經周期、孕次、產次、血清CA125水平均無明顯相關性（P＞0.05），見表3～4。

圖1 子宮腺肌癥和正常子宮內膜組織HE染色（HE200×）

3 討論

圖2 ZE B1、ZE B2在子宮腺肌癥和正常子宮內膜組織表達

表1 ZE B1在各組子宮內膜中的表達情況

表2 ZE B2在各組子宮內膜中的表達情況

表3 ZE B1在子宮腺肌癥子宮內膜中表達的相關因素分析

表4 ZE B2在子宮腺肌癥子宮內膜中表達的相關因素分析

子宮腺肌癥是一種常見的婦科疾病，其發病機制和病理生理學尚不清楚。有研究表明上皮-間質轉化(EMT)可能在子宮腺肌癥的發展中起作用，導致子宮腺肌癥上皮細胞的侵襲傾向增加[7]。EMT的一個關鍵初始步驟是E-cadherin的下調，E-盒結合鋅指蛋白即ZEB蛋白，包括ZEB1和ZEB2，是EMT過程中的關鍵轉錄因子，參與EMT的調節過程，可以抑制E-cadherin的轉錄，從而促使EMT發生，最終使細胞獲得侵襲轉移能力[10-11]。ZEB1和ZEB2的結構相近，但是分子功能卻不同，ZEB蛋白的表達在不同腫瘤中是不一樣的。ZEB蛋白在多種腫瘤中表達，俞楊[12]等研究發現表明ZEB1和ZEB2在乳腺癌中均高表達；Do?anlar[13]研究發現，ZEB1在膠質母細胞瘤中過度表達；Huo X[14]研究發現，ZEB2在食管癌中高表達；Moussa[15]等在膀胱癌中ZEB1和ZEB2均有表達。此外，張春云[16]等有研究表明，ZEB1和ZEB2在子宮內膜異位癥患者中高表達。在本研究中，我們通過免疫組化方法檢測ZEB1、ZEB2在子宮腺肌癥子宮內膜及正常子宮內膜中的表達，結果顯示ZEB1在子宮腺肌癥子宮內膜中陽性表達高于正常子宮內膜，差異有統計學意義；而ZEB2在子宮腺肌癥子宮內膜中的陽性表達高于正常子宮內膜，但差異無統計學意義。多種信號通路調節EMT的生物學過程，主要有Wnt信號通路、Notch信號通路、TGF-β信號通路、ILK信號通路等眾多信號通路。Oh[17]等報道β-catenin在子宮腺肌癥中表達水平升高，激活Wnt/β-Catenin信號通路，誘導ZEB1、Snail表達增加，抑制E-cadherin的表達，促進子宮腺肌癥的進展。這提示我們，ZEB1在子宮腺肌癥中高表達可能與EMT在子宮腺肌癥中的發生有關。子宮腺肌癥的發病率約為5%~70%，發病年齡呈年輕化趨勢[18]，目前臨床上診斷子宮腺肌癥的的方法很多，但并沒有良好的術前診斷方法，子宮腺肌癥的金標準為病理學檢查，為有創性檢查；核磁共振(MRI)術前診斷準確率高，但價格昂貴，早期缺乏無創靈敏、準確度高、特異性強的診斷方法。CA125是一種腫瘤標志物，常用于篩查卵巢癌，有研究表明CA125的水平與子宮內膜的發育密切相關，血清CA125水平在子宮腺肌癥患者中顯著增高，是診斷子宮腺肌癥最常見的血清標志物[19-20]。血清CA125在子宮腺肌癥中陽性表達率高，對子宮腺肌癥診斷具有重要的價值，本研究納入的患者中CA125升高的患者占77.14%(27/35)，ZEB1在子宮腺肌癥中陽性表達率為74.29%（26/35），由于血清CA125在多種婦科疾病中均有表達，特異性較差。在臨床上聯合檢測CA125和ZEB1水平，以兩者均陽性為標準，是否可以提高子宮腺肌癥的準確性，需后續的進一步研究。本研究還分析了ZEB1、ZEB2在子宮腺肌癥患者中的表達水平與血清CA125水平的相關性，結果顯示ZEB1、ZEB2在子宮腺肌病患者中的表達水平與血清CA125水平無關。子宮腺肌癥最常見的癥狀是進行性痛經、異常子宮出血、月經過多和慢性盆腔疼痛[1]，其中，痛經是子宮腺肌癥患者主要的特征性癥狀，有文獻報道子宮腺肌癥痛經發生率達64.8%~77.8%[21]，本研究中子宮腺肌癥患者痛經的比率為57.14%（20/35），這可能與本研究樣本量少有關。此外我們還分析了ZEB1、ZEB2在子宮腺肌病患者中的表達水平與其臨床特征的相關性，結果顯示ZEB1、ZEB2在子宮腺肌病患者中的表達水平與患者的年齡、痛經、月經周期、孕次、產次和絕經狀態無顯著相關性，這與王慧芳[22]等人的研究是一致的。

綜上所述，在本研究中，ZEB1在子宮腺肌癥子宮內膜中陽性表達顯著高于正常子宮內膜，可能與EMT在子宮腺肌癥中的發生有關，為研究子宮腺肌癥的分子機制提供參考。