蒜氨酸微丸-蒜酶腸溶雙層片制備工藝優選及體外抗腫瘤作用評價*

方奕巍，朱文濤，陳金明△

（1.贛南醫學院第一附屬醫院，江西 贛州341000；2.江西青峰藥業有限公司，江西 贛州 341000）

大蒜的主要有效成分為大蒜辣素［1?2］，由蒜氨酸在蒜酶催化裂解作用下產生，具有抗腫瘤活性等多種物理學活性［3?5］，但性質不穩定，在空氣中易分解，故將蒜氨酸和蒜酶制備成新制劑［2］，使其進入人體后生成大蒜辣素，從而發揮治療作用。微丸表面圓整，粒徑均勻，流動性良好，有利于包衣工藝，并可將包衣微丸壓制成片，提高藥物與胃腸道的接觸面積，使藥物吸收完全，從而提高生物利用度，且使用方便［6］。本研究中制備了蒜氨酸微丸?蒜酶腸溶雙層片，并以人宮頸癌細胞株HeLa、人肝癌細胞株Bel?7402、人白血病細胞株HL?60、人正常肝細胞L02為研究對象，初步評價了蒜氨酸微丸?蒜酶腸溶雙層片的體外抗腫瘤作用?，F報道如下。

1 儀器、試藥與細胞

1.1 儀器

DP30A型單沖壓片機（北京新龍立科技有限公司）；AT?7型溶出儀（瑞士Sotax公司）；JBZ?200型擠出滾圓造粒機（遼寧醫聯新藥研究所）；小型流化床包衣機（沈陽藥科大學制藥廠）；Waters e2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；YD?20KZ型硬度儀、FT?2000AE型脆碎度檢查儀（天津市天大天發科技有限公司）；BGZ?140型電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業有限公司）；ME104E型電子天平（瑞士梅特勒?托利多公司，精度為萬分之一）；Varioskan Flash型連續光譜多功能酶標儀（美國Thermo Fisher公司）。

1.2 試藥

蒜氨酸（由本實驗室提取，純度大于95%）；蒜氨酸對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號為YY91278，含量為98%）；蒜酶（新疆埃樂欣藥業有限公司，批號為201902012）；微晶纖維素（MCC，Dupont Nutrition USA，批號為P119832791）；低取代羥丙基纖維素（L?HPC，Shin?Etsu Chemical Co.，Ltd.，批號為5091344）；交聯聚維酮（PVPP，德國BASF公司，批號為75892806170）；羧甲基淀粉鈉（CMS?Na，安徽山河藥用輔料有限公司，批號為181108）；丙烯酸樹脂（Eudragit?L30D?55，德國Degussa公司，批號為B150814348）；羥苯乙酯（中國食品藥品檢定研究院，批號為100847?201604，含量為99.9%）；甲醇（色譜純，天津市康科德科技有限公司）；甲酸（分析純，上海凌峰化學試劑有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.3 細胞

人宮頸癌細胞株HeLa、人肝癌細胞株Bel?7402、人白血病細胞株HL?60、人正常肝細胞L02均由江西中醫藥大學提供，均接種于15%滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的1640培養液中，置5%飽和相對濕度、37℃的CO2孵箱中貼壁生長。

2 方法與結果

2.1 蒜氨酸分析方法［7-8］

2.1.1 外標溶液制備

取蒜氨酸對照品4.8 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用純水溶解并定容，即得質量濃度為48 μg/mL的蒜氨酸對照品溶液。

2.1.2 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18反相柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：磷酸鹽緩沖液（pH=5）?甲醇（95∶5，V/V）；流速：0.5 mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：214 nm；進樣量：20μL。

2.1.3 方法學考察

線性關系考察：取蒜氨酸對照品30.6 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用流動相定容，即得質量濃度為612 μg/mL的對照品貯備液；依次量取對照品貯備液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 mL，并用流動相定容至50 mL容量瓶中，即得質量濃度分別為1.22，2.45，6.12，12.24，24.48，61.20，122.40，244.80 μg/mL的系列對照品溶液。按2.1.2項下色譜條件進樣測定，以蒜氨酸的色譜峰面積（A）為縱坐標、質量濃度（C，μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程A=1.112×104C+123.5（r=0.999 8，n=8）。結果表明，蒜氨酸的質量濃度在1.22～244.80 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取質量濃度為61.20 μg/mL的對照品溶液適量，按2.1.2項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果蒜氨酸峰面積的RSD為0.73%（n=6），表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗：取蒜氨酸10 mg，精密稱定，平行3份，置20 mL容量瓶中，用流動相定容；準確移取該溶液各1 mL，置10 mL容量瓶中，分別加入線性關系考察項下質量濃度為612 μg/mL的對照品貯備液各0.1，1.0，3.0 mL，用流動相稀釋并定容，按2.1.2項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按外標法計算加樣回收率。結果蒜氨酸的平均加樣回收率為98.60%，RSD為0.86%（n=9）。

2.1.4 蒜氨酸濃度計算

蒜氨酸濃度按公式CX=AX×CS/AS計算，其中，CX為供試品溶液濃度，AX為供試品溶液峰面積，CS為對照品溶液濃度，AS為對照品溶液峰面積。

2.2 大蒜辣素分析方法［9］

2.2.1 內標溶液制備

取羥苯乙酯15.1 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，用60%甲醇溶解并定容，即得質量濃度為302 μg/mL的內標貯備液；移取5 mL內標貯備液，置50 mL容量瓶中，定容，即得質量濃度為30.2 μg/mL的羥苯乙酯內標溶液。

2.2.2 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18反相柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇?1%甲酸（70∶30，V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：242 nm；進樣量：25μL。

2.2.3 大蒜辣素濃度計算

大蒜辣素濃度按公式CX=4.71×D×AX×CS/AS計算，其中，4.71為校正因子，CX為供試品溶液濃度，D為樣品稀釋倍數，AX為供試品溶液峰面積，CS為對照品溶液濃度，AS為內標峰面積。

2.3 蒜氨酸速釋微丸制備

2.3.1 制備工藝

以MCC為填充劑，以2%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液為潤濕劑，加入適量崩解劑，采用擠出滾圓法制備蒜氨酸速釋微丸，工藝參數設置為擠出頻率30 Hz，滾圓頻率40 Hz，滾圓時間30 s，60℃烘箱干燥12 h，以篩分法得到0.45～0.60 mm的丸芯，收集，稱定質量，計算收率。

2.3.2 溶出試驗

以蒜氨酸溶出度為考察指標，采用2020年版《中國藥典（四部）》0931溶出度與釋放度測定法，設置轉速為100 r/min，溫度為（37±0.5）℃。取適量微丸，置裝有溶出介質的溶出杯中，以人工腸液（pH 6.8磷酸鹽緩沖液）為釋放介質，分別測定溶出10，20，30，45，60，90 min時在人工腸液中的累積釋放率。

2.3.3 工藝優選

崩解劑選擇：以MCC為稀釋劑，與蒜氨酸質量比為1∶1（m/m），不加入崩解劑或加入5%CMS?Na，L?HPC，PVPP，混勻，按2.3.1項下方法制備蒜氨酸速釋微丸，按2.3.2項下方法測定其在人工腸液中的累積釋放率。結果以CMS?Na為崩解劑時，藥物釋放最快，故選擇CMS?Na為速釋微丸的崩解劑。詳見圖1 A。

崩解劑用量選擇：以MCC為稀釋劑，與蒜氨酸質量比為1∶1（m/m），以2%SDS溶液為潤濕劑，以CMS?Na為崩解劑，含量分別為3%，5%，7%，按2.3.1項下方法制備速釋微丸，按2.3.2項下方法測定其在人工腸液中的累積釋放率。結果崩解劑用量為3%時累積釋放率最小，用量為5%時的累積釋放率與用量為7%時的曲線類似，故崩解劑用量選擇5%。詳見圖1 B。

A.崩解劑B.崩解劑用量C.MCC與蒜氨酸質量比圖1蒜氨酸速釋微丸工藝優選（n=6）A.Disintegrating agents B.Disintegrating agent dosage C.Mass ratio of MCC to alliinFig.1 Process optimization of alliin rapid release pellets（n=6）

MCC與蒜氨酸質量比選擇：以MCC與蒜氨酸質量比為篩選對象，分別為0.5∶1（m/m）、1∶1（m/m）、2∶1（m/m），以5% CMS?Na為崩解劑，以2% SDS溶液為潤濕劑，混勻，按2.3.1項下方法制備速釋微丸，按2.3.2項下方法測定其在人工腸液中的累積釋放率。結果MCC與蒜氨酸質量比為1∶1（m/m）和2∶1（m/m）時的累積釋放率曲線類似，且均高于質量比為0.5∶1（m/m）時的累積釋放率，從增加微丸中主藥蒜氨酸的占比考慮，最終選擇MCC與蒜氨酸質量比為1∶1（m/m）。詳見圖1 C。

2.3.4 驗證試驗

按擬訂優化條件，以MCC與蒜氨酸質量比為1∶1（m/m），以5% CMS?Na為崩解劑，以2% SDS溶液為潤濕劑，采用擠出滾圓法連續制備3批蒜氨酸速釋微丸，篩分法得到0.45～0.60 mm的丸芯，收集，稱定質量，得其平均收率為（96.41±2.10）%（n=3），在人工腸液中1.5 h的累積釋放率為（93.72±4.14）%（n=3），制備的微丸表面光潔、圓整，呈淡黃色。

2.4 蒜氨酸速釋微丸腸溶包衣

以丙烯酸樹脂（型號為Eudragit?L30D?55）為腸溶衣膜材料，以檸檬酸三乙酯為增塑劑，以滑石粉為抗粘劑，選擇粒徑為0.45～0.60 mm的蒜氨酸速釋微丸，分3批分別配制包衣液，使包衣增重分別為5%，10%，15%（m/m），采用流化床包衣技術包制腸溶衣，制備蒜氨酸微丸，工藝參數設置為鼓風頻率30 Hz，熱風溫度30～35℃，包衣液流速1.2 mL/min，物化壓力1.0 MPa。按2020年版《中國藥典（四部）》0931溶出度與釋放度測定法，取適量蒜氨酸微丸，置轉籃中，設置轉速為100 r/min，介質溫度為（37.0±0.5）℃，以人工胃液（pH 2.0）為釋放介質，2 h后加入定量0.2 mol/L磷酸鈉溶液，模擬人工腸液（pH 6.8），測定蒜氨酸微丸在人工胃液中2 h和人工腸液中1 h內的累積釋放率。詳見圖2?？梢?，1）包衣增重10%和15%蒜氨酸微丸在人工胃液中2 h的累積釋放率均小于5%，二者累積釋放率曲線類似；包衣增重5%蒜氨酸微丸的累積釋放率為（11.32±2.44）%（n=6）。為減少主藥蒜氨酸在胃液中因釋放而造成的損失，包衣增重10%和15%的條件優于包衣增重5%。2）包衣增重5%和10%蒜氨酸微丸在人工腸溶液中1 h的累積釋放率曲線類似，累積釋放率分別為（92.31±4.85）%和（89.72±4.52）%（n=6），包衣增重15%的累積釋放率為（78.3±4.5）%（n=6）。為提高主藥蒜氨酸在人工腸液中的釋放率，包衣增重5%和10%的條件優于包衣增重15%，故包衣增重選擇10%。

圖2 包衣增重對蒜氨酸微丸中藥物累積釋放率的影響（n=6）Fig.2 Effect of coating weight gain on cumulative drug release rate in alliin pellets（n=6）

2.5 蒜氨酸微丸-蒜酶腸溶雙層片制備

2.5.1 制備工藝

本研究中以MCC為填充劑，以CMS?Na為崩解劑，取處方量蒜酶層粉末，填入沖模中，以8 mm平頭沖預壓；再填入處方量蒜氨酸微丸層，以8 mm平頭沖二次壓成雙層片，片面平整，無粘沖現象。當蒜氨酸?蒜酶的質量比（m/m）為1∶（0.5～1.5）時，大蒜辣素產率達到最高值［10］，故表1中蒜氨酸∶蒜酶的處方比例符合要求。

表1 蒜氨酸微丸-蒜酶雙層片處方（mg/片）Tab.1 Formulation of Enteric-Coated Alliin Pellets-Alliinse Bilayer Tablets（mg/tablet）

2.5.2 溶出試驗

以大蒜辣素產率為考察指標，按2020年版《中國藥典（四部）》0931溶出度與釋放度測定法，設置轉速為100 r/min，溫度為（37±0.5）℃，取蒜氨酸微丸?蒜酶雙層片，置裝有人工腸液（pH 6.8）的溶出杯中，分別吸取溶出5，10，15，30，45，60 min時的溶出液1 mL，加入1 mL質量濃度為30.20μg/mL的羥苯乙酯內標溶液，混勻，按2.2項下方法測定大蒜辣素的含量，得到人工腸液中1 h內的累積大蒜辣素產率。

2.5.3 工藝優選

蒜酶層中MCC用量選擇：蒜酶吸濕性較強，流動性較差，可通過加入一定量的MCC加以改善。根據前期預試驗結果，當MCC用量大于每片22 mg時蒜酶的流動性方可符合壓片要求，將MCC用量上限控制在每片172 mg，使片劑總質量控制在每片200～300 mg。按表1處方壓片，MCC用量分別為每片22，72，122，172 mg，使片劑總質量分別為每片150，200，250，300 mg。以大蒜辣素產率為評價指標，按2.5.2項下方法測定。詳見圖3?？梢?，溶出0～30 min內，隨著MCC用量的增加，大蒜辣素產率呈遞增趨勢；溶出超過30 min時，MCC用量為每片72，122，172 mg大蒜辣素產率的曲線幾乎重合；溶出60 min時，MCC用量為每片22 mg壓制的雙層片的大蒜辣素產率最低，為（79.60±4.51）%。為增加片劑中主藥蒜酶占比，減少輔料添加量，故選擇MCC的用量為每片72 mg。

圖3 蒜酶層中MCC用量對大蒜辣素產率的影響Fig.3 Effect of MCC dosage in alliinase layer on the yield of alliin

腸溶包衣溫度選擇：選用Eudragit?L30D?55為腸溶衣膜材料，以檸檬酸三乙酯為增塑劑，以滑石粉為抗粘劑，使包衣增重為10%（m/m），采用流化床包衣技術對蒜氨酸微丸?蒜酶雙層片進行包衣，參數設置為鼓風頻率30 Hz，包衣液流速0.6 mL/min，物化壓力1.0 MPa，分別在熱風溫度為25，30，35℃下包衣，按2.5.2項下方法測定蒜氨酸微丸?蒜酶腸溶雙層片中大蒜辣素在人工腸液1 h的產率。結果分別為（86.92±2.44）%、（78.34±3.73）%、（66.52±2.90）%（n=3）?？梢?，大蒜辣素的產率隨包衣溫度的升高而降低，這與蒜酶的活性隨溫度升高而降低，導致大蒜辣素生成減少有關。3種溫度下所得包衣片均為白色，且富有光澤，表面光滑，故選擇包衣溫度為25℃。

2.5.4 驗證試驗

按以上優選工藝，MCC與蒜氨酸質量比為1∶1（m/m），以5% CMS?Na為崩解劑，以2% SDS溶液為潤濕劑，采用擠出滾圓法連續制備3批蒜氨酸速釋微丸，篩分法得到0.45～0.60 mm的丸芯，收集；按2.4項下方法包衣增重10%，得3批蒜氨酸微丸；以上3批蒜氨酸微丸按2.5項下方法壓片、包衣制得3批蒜氨酸微丸?蒜酶雙層腸溶片，每批100片。所得片劑均為白色，且富有光澤，表面光滑；制得片劑的硬度為39.2～44.8 N，脆碎度不超過0.4%；片劑的含量均勻度分別為4.94，5.18，3.61，均小于15.0，符合2020年版《中國藥典（四部）》通則0941規定。

2.6 蒜氨酸微丸-蒜酶腸溶雙層片溶出試驗

按優選工藝，制備3批蒜氨酸微丸?蒜酶腸溶雙層片，以大蒜辣素產率為考察指標，同2.5.2項下方法測定，首先采用人工胃液（pH 2.0）為釋放介質，2 h后加入定量0.2 mol/L磷酸鈉溶液，模擬人工腸液（pH 6.8），測定大蒜辣素在人工胃液中2 h和人工腸液中1 h內的產率。詳見圖4?？梢?，制備的3批蒜氨酸微丸?蒜酶腸溶雙層片中大蒜辣素產率曲線幾乎重合，說明制備工藝的重復性較好；3批片劑在2 h內人工胃液中的大蒜辣素產率均低于5%，1 h內人工腸液中大蒜辣素產率分別 為（88.51±4.80）%、（85.20±4.53）%、（86.34±2.62）%（n=6），均高于85%，符合2020年版《中國藥典（四部）》規定。

圖4 蒜氨酸微丸-蒜酶腸溶雙層片在人工胃液和人工腸液中的大蒜辣素產率（n=6）Fig.4 The yield of alliin of Enteric-Coated Alliin Pellets-Alli?inse Bilayer Tablets in artificial gastric juice and artificial intesti?nal juice（n=6）

2.7 體外抗腫瘤作用

取蒜氨酸微丸?蒜酶腸溶雙層片6片，置100 mL人工腸液中，按2.5.2項下方法測定累積釋放率，30 min后開始取樣，測得藥液中大蒜辣素的質量濃度為1 318.91 μg/mL，此藥液經1640培養液稀釋，得質量濃度分別為131.89，109.91，87.93，65.95，43.96，21.98μg/mL的系列試驗藥液［10?11］，經0.22μm微孔濾膜濾過，除菌，測定所得藥液對腫瘤細胞的抑制作用。

取對數生長期Bel?7402，HL?60，HeLa，L02細胞，以1×105的細胞濃度在96孔培養板中培養，待細胞貼滿孔壁時加入系列試驗藥液，分別為Bel?7402組、HL?60組、HeLa組、L02組。采用噻唑藍（MTT）比色法測定腫瘤細胞的抑制率，經藥液作用后的細胞與0.5 mg/mL MTT于37℃共同孵育4 h，吸棄上清液，加入二甲基亞砜，完全溶解后使用酶標儀于492 nm波長處測定吸光度（A），細胞生長抑制率（%）=（1?A實驗組/A空白對照組）×100%。數據以±s表示，行t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。結果見表2?？梢?，蒜氨酸微丸?蒜酶腸溶雙層片在人工腸液中生成大蒜辣素溶液，該藥液對人正常肝細胞L02的影響很小，抑制率最高不超過10%；以L02組為對照，對HL?60，Hela，Bel?7402腫瘤細胞的抑制作用均顯著增強（P<0.01），且抑制強度由大到小排序為Bel?7402>Hela>HL?60（P<0.05）；對L02，HL?60，Hela，Bel?7402腫瘤細胞的抑制率隨著藥液濃度的增加而增大，且抑制效應呈濃度依賴性。

表2 不同質量濃度大蒜辣素蒜氨酸微丸-蒜酶腸溶雙層片對腫瘤細胞的生長抑制率比較（%，n=6）Tab.2 Comparison of growth-inhibitory rate of Enteric-Coated Alliin Pellets-Alliinse Bilayer Tablets on tumor cells（%，n=6）

3 討論

蒜氨酸儲存過程中與蒜酶相遇后不穩定，易發生催化反應，生成大蒜辣素［1?2］，而大蒜辣素極不穩定。通過制備成腸溶微丸，可避免蒜氨酸與蒜酶發生反應。蒜酶性質不穩定，易吸潮，遇酸及有機溶劑易變性失活［11?12］。蒜氨酸微丸?蒜酶雙層片壓制成功后，通過包腸溶衣隔絕胃液，防止蒜氨酸和蒜酶進入腸道前喪失活性，避免蒜酶被胃酸破壞，提高制劑的穩定性和活性成分大蒜辣素的產率。包衣過程中要注意保證較低的溫度，以最大限度地保留蒜酶的活性，故最終選擇雙層片的包腸溶衣溫度為25℃。

雙層片包衣后制備成腸溶雙層片，連續考察了大蒜辣素在人工胃液中2 h和人工腸液中1 h的產率，通過包腸溶衣的方式，使蒜氨酸進入腸道后可大量釋放，進而在蒜酶催化下生成大量大蒜辣素。在人工胃液中，主藥蒜氨酸損失較小，大蒜辣素產率不超過5%。

本研究中評價了制備的蒜氨酸微丸?蒜酶腸溶雙層片的體外抗腫瘤作用，模擬了腸溶片進入腸道后的崩解釋放情況。結果顯示，雙層片崩解釋放生成的溶出液（主要為大蒜辣素）對L02，HL?60，Hela，Bel?7402腫瘤細胞均有抑制作用，表明其被腸道所吸收而產生藥效。

綜上所述，優選的蒜氨酸微丸?蒜酶腸溶雙層片制備工藝穩定、合理，體外溶出曲線良好，體外抗腫瘤作用明顯，藥物的穩定性提高，為該藥物的中試研究和工業化生產奠定了基礎。