高效液相色譜法檢測乙酰半胱氨酸原料藥中有關物質*

張承志，謝育媛，郭江紅

（湖北省藥品監督檢驗研究院·國家藥品監督管理局血液制品重點實驗室·湖北省藥品質量檢測與控制工程技術研究中心，湖北 武漢 430064）

乙酰半胱氨酸又稱N?乙?；?L?半胱氨酸，作為一種經典化痰藥物，常用于治療呼吸道感染性疾病。研究發現，乙酰半胱氨酸有較強的抗氧化應激和促肺表面活性物質生成等作用，目前廣泛用于呼吸系統、消化系統、心血管系統、泌尿系統疾病的防治［1?5］。藥物中的雜質除了影響其純度外，還可能影響藥理活性或穩定性，造成藥效偏差，甚至導致嚴重不良反應［6?7］。乙酰半胱氨酸是由鹽酸半胱氨酸與醋酐的乙?；磻傻漠a物，原料藥和生產工藝均可能產生L?胱氨酸、L?半胱氨酸、N，N′?二乙酰?L?胱氨酸、N，S?二乙酰?L?胱氨酸4種已知雜質。2020年版《中國藥典（二部）》［8］收載的乙酰半胱氨酸中，尚未要求有關物質的檢查；收載的乙酰半胱氨酸顆粒的有關物質采用高效液相色譜（HPLC）法控制單個未知雜質和總雜質的含量，未涵蓋上述4種已知雜質?！队幍?020版》（BP2020）［9］、《歐洲藥典9.0版》（EP9.0）［10］、《日本藥局方17版》（JP 17）［11］均收載了乙酰半胱氨酸原料藥及其有關物質的檢查項，《美國藥典42版》（USP42）［12］僅收載了乙酰半胱氨酸原料藥。本研究中參考EP9.0，建立了測定乙酰半胱氨酸原料藥中4種已知雜質及其他未知雜質的HPLC法，并開展相關方法學驗證，以提高乙酰半胱氨酸原料藥的質量標準?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695/2489型高效液相色譜儀?紫外檢測器（美國Waters公司）；XP205型精密分析天平（瑞士梅特勒?托利多有限公司，精度0.01 mg）；Milli?Q IQ7000型超純水機（美國Millpore公司）；LC?250型超聲儀（濟寧市中區魯超儀器廠，功率250 W，頻率33 kHz）。

1.2 試藥

L?胱氨酸（雜質A）對照品（批號為LRAC3784，含量為99.9%），L?半胱氨酸（雜質B）對照品（批號為BCBZ1870，含量為99.1%），均購自德國Sigma?Aldrich公司；N，N′?二乙酰?L?胱氨酸（雜質C）對照品（批號為11.0，含量為100%），N，S?二乙酰?L?胱氨酸（雜質D）對照品（批號為7.0，含量為100%），均購自European Pharmacopoeia Reference Standard；乙酰半胱氨酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為140671?201903，含量為99.8%）；乙酰半胱氨酸原料藥（湖北新生源生物工程有限公司，批號分別為180701，180702，180703；武漢遠大弘元股份有限公司，批號分別為202003003，202003004，202003005；浙江誠意藥業股份有限公司，批號分別為0902?2020?03004，0902?2020?03005，0902?2020?03006）；乙腈（色譜純，德國默克公司）；鹽酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：ThermoODSHypersilC18柱（250mm×4.0mm，5μm）；流動相：水（用磷酸調pH至3.0）?乙腈（97∶3，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：220 nm；柱溫：35℃；進樣量：20 μL?；旌蠈φ掌啡芤涸诖松V條件下的色譜圖見圖1。結果表明，4種已知雜質和乙酰半胱氨酸均能良好分離，各溶劑峰均無干擾。

2.2 溶液制備

取雜質A對照品21.09 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液10 mL超聲使溶解，加水稀釋并定容，搖勻，作為對照品溶液①；取雜質B對照品15.47 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液10 mL超聲使溶解，加水稀釋并定容，搖勻，作為對照品溶液②；取雜質C對照品10.51 mg，精密稱定，置5 mL容量瓶中，加1 mol/L鹽酸溶液0.5 mL超聲使溶解，加水稀釋并定容，搖勻，作為對照品溶液③；取雜質D對照品10.64 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液5 mL超聲使溶解，加水稀釋并定容，搖勻，作為對照品溶液④；分別精密量取對照品溶液①②③④各2，1，1，1 mL，置同一50 mL容量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，即得對照品貯備液。取雜質A對照品、雜質B對照品、雜質C對照品、雜質D對照品、乙酰半胱氨酸對照品各10 mg，精密稱定，置250 mL容量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液25 mL超聲使溶解，加水稀釋并定容，搖勻，即得混合對照品溶液。取乙酰半胱氨酸原料藥0.8 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液10 mL超聲使溶解，加水稀釋并定容，搖勻，臨用現配，即得供試品溶液①。將供試品溶液①于室溫放置至少1 h，即得供試品溶液②。

2.3 方法學考察

線性關系考察：取2.2項下混合對照品溶液適量，作為對照品溶液①，取適量，加0.01 mol/L鹽酸溶液準確稀釋10倍，作為對照品溶液②。分別精密量取對照品溶液②20 μL，對照品溶液①10，20，40，60 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以進樣量（X，ng）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得雜質A，B，C，D的回歸方程分別為YA=143.22XA+733.97（RA2=0.999 9），YB=76.09XB?2 991.43（RB2=0.999 4），YC=333.50XC?2 535.59（RC2=1.000 0），YD=764.74XD?26 888（RD2=0.999 7）。結果表明，雜質A，B，C，D的進樣量分別在80.32～2 409.59 ng、81.58～2 447.38 ng、83.84～2 515.20 ng、80.64～2 419.20 ng

范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限與定量限確定：取2.2項下混合對照品溶液適量，用0.01 mol/L鹽酸溶液逐步稀釋，按2.1項下色譜條件進樣測定。雜質A，B，C，D及乙酰半胱氨酸的檢測限分別為5.04，8.64，3.70，5.69，8.34 ng，定量限分別為60.48，28.80，12.32，18.96，19.17 ng。

精密度試驗：精密吸取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果雜質A，B，C，D峰面積的RSD分別為0.15%，0.33%，0.15%，0.33%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為202003003）樣品0.8 g，精密稱定，共6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按外標法計算各雜質的含量。結果雜質A，B，C，D含量的平均值分別為0.010%，0.004%，0.040%，0.004%，由于雜質含量較低，測得6份結果幾乎無差異，表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一批（批號為202003003）樣品，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液10 mL使溶解，加水稀釋并定容，搖勻，作為穩定性試驗溶液，分別于0，1，3，5，7，9，11，13，15 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果在15 h內，乙酰半胱氨酸和雜質A的峰面積均下降，雜質B，C，D的峰面積均增加，并出現1個保留時間約在3.6 min的降解雜質，表明供試品溶液極不穩定，需臨用現配。

加樣回收試驗：取同一批（批號為202003003）樣品0.4 g，精密稱定，共6份，分別置100 mL容量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液10 mL使溶解，精密加入對照品貯備液5 mL，加水稀釋并定容，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果雜質A，B，C，D的平均加樣回收率分別為101.03%，93.90%，98.23%，97.96%，RSD分 別 為5.21%，3.34%，4.91%，5.65%（n=6）。

破壞性試驗：1）酸破壞。取同一批（批號為202003003）樣品0.8 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加2 mol/L鹽酸溶液5 mL，室溫放置90 min，加2 mol/L氫氧化鈉溶液調pH至中性，加0.01 mol/L鹽酸溶液稀釋并定容，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。詳見圖2 A。2）堿破壞。取同一批（批號為202003003）樣品0.8 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加2 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL，室溫放置90 min，加2 mol/L鹽酸溶液調pH至中性，加0.01 mol/L鹽酸溶液稀釋并定容，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。詳見圖2 B。3）氧化破壞。取同一批（批號為202003003）樣品0.8 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加5%過氧化氫溶液5 mL，室溫放置90 min，加0.01 mol/L鹽酸溶液稀釋并定容，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。詳見圖2 C。4）高溫破壞。取同一批（批號為202003003）樣品0.8 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，沸水浴1 h，放冷，加0.01 mol/L鹽酸溶液稀釋并定容，搖勻，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。詳見圖2 D。5）強光破壞。取同一批（批號為202003003）樣品0.8 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，2 600 lx照度下放置10 d，加0.1 mol/L鹽酸溶液10 mL使溶解，加水稀釋并定容，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。詳見圖2 E。正常條件下，供試品溶液及空白溶劑色譜圖見圖2 F至圖2 G。結果乙酰半胱氨酸在氧化破壞條件下極不穩定，在酸、堿破壞試驗條件下，主峰峰面積下降明顯，在高溫、強光破壞試驗條件下，主峰峰面積略有下降，表明該色譜條件能有效分離已知雜質峰及各相鄰雜質峰，專屬性良好。

2.4 樣品含量測定

取9批樣品各適量，分別按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按外標法分別計算雜質A，B，C，D的含量。結果見表1。

表1 乙酰半胱氨酸原料藥中4種雜質含量測定結果（%）Tab.1 Results of content determination of four impurities in acetylcysteine APIs（%）

3 討論

3.1 質量標準

EP10.3［13］與EP9.0收錄色譜條件相同，在EP9.0的基礎上嚴控了雜質限度，由各單個雜質不得過0.50%、總雜質不得過0.50%，改為不控制雜質A，雜質B，C，D依次不得過0.30%，0.20%，0.15%，單個未知雜質不得過0.10%，總雜質不得過0.50%。BP2020的標準同EP9.0。JP17采用HPLC法控制未知雜質和總雜質，依次不得過0.30%和0.60%。本研究中參考EP9.0，要求各單個雜質不得過0.50%，總雜質不得過0.50%，溶劑峰和靈敏度小于溶液主峰面積的單個雜質忽略不計。按擬訂方法檢測9批原料藥，4種已知雜質含量均不超過0.10%，表明現行生產工藝較好。

1.雜質A 2.雜質B 3.乙酰半胱氨酸4.雜質C 5.雜質DA?F.供試品溶液（條件分別為酸破壞、堿破壞、氧化破壞、高溫破壞、強光破壞、正常條件）G.空白溶劑圖2破壞性試驗高效液相色譜圖1.Impurity A 2.Impurity B 3.Acetylcysteine 4.Impurity C 5.Impurity DA?F.Test solution（conditions are acid destruction，alkali destruction，oxidation destruction，high?temperature destruction，strong?light destruction and normal conditions respectively）G.Blank solventFig.2 HPLC chromatograms of the destructive test

3.2 色譜條件優化

流動相pH選擇：調節流動相A（水相）的pH分別為2.5，2.8，3.0，3.2，3.5，流動相水?乙腈（97∶3，V/V），其余色譜條件不變。結果顯示：1）溶劑峰、雜質A峰與雜質B峰三者較難分離，隨著pH的升高，溶劑峰與雜質A峰的分離度逐漸增加，當pH為3.0時，溶劑峰與雜質A峰才可分離；但隨著pH的升高，雜質A峰與雜質B峰的分離度逐漸降低。2）主峰及4個雜質峰的對稱性隨pH的增加逐漸下降，主峰的理論板數從17 829（pH 3.0）降至3 308（pH 3.5）。綜合考慮，最終選擇流動相A為水（用磷酸調pH至3.0）。

流動相比例確定：設置流動相水（用磷酸調pH至3.0）?乙腈的比例分別為96∶4，97∶3，98∶2（V/V），結果表明，當有機相比例減少時，有利于雜質A與雜質B的分離［比例為98∶2（V/V）時，分離度為1.66］，由于Hypersil ODS柱填料無法耐受高水相，故選擇流動相比例為97∶3（V/V）。

色譜柱選擇：由于雜質A極性較大，出峰較早，易包裹溶劑峰，故色譜柱需滿足溶劑不干擾雜質A的測定，才能很好分離已知雜質峰和主峰?？疾炝薟aters，Shiseido，GL，Thermo等品牌共10款C18柱［14］，發現同時能滿足以上要求的有Thermo ODS Hypersil C18柱和ODS?2 Hypersil C18柱，且前者分離效果更好，故被選用。

3.3 高效液相色譜儀選擇

系統適用性試驗中發現，同一系統適用性溶液在相同色譜條件下，雜質A與雜質B用戴安品牌高效液相色譜儀比Waters品牌的分離度更好，這可能與2種品牌儀器的管路體積、長度及色譜峰積分方式等因素有關。但考慮到雜質的檢查方法應符合普遍適用性原則，較多企業使用Waters液相色譜儀，故選擇Waters品牌。

3.4 溶液制備的優化

專屬性試驗考察中發現，強酸（2 mol/L鹽酸溶液）會引起乙酰半胱氨酸主峰峰面積下降，故將EP9.0中供試品溶液配制“加1 mol/L鹽酸溶液1 mL”改為“加0.1 mol/L鹽酸溶液10 mL超聲使溶解”。

3.5 待解決的問題

破壞性試驗中發現，供試品溶液隨放置時間的延長會產生相對保留時間（保留時間約3.6 min）約0.7的雜質，該雜質的峰面積隨放置時間的延長而增大。EP9.0要求供試品溶液①臨用現配，供試品溶液①至少放置1 h后產生的保留時間約為3.3 min的雜質峰（2?甲基?2?噻唑啉?4?羧酸峰）可忽略不計。JP17也要求供試品溶液臨用現配?？紤]是樣品溶于鹽酸溶液后不穩定導致降解雜質產生，并非樣品本身的降解雜質，故未將降解雜質納入限度考慮，并忽略不計。由于時間倉促，本研究中未進一步研究相對保留時間約0.7的降解雜質。

3.6 方法評價

本方法靈敏度高，準確度和重復性均較好，可用于檢測乙酰半胱氨酸原料藥中有關物質。