酸奶弱后酸化菌株搖瓶增菌工藝及發酵罐擴培試驗

趙麗娜，鞏俊明，張 娜，李 晨，5，田洪濤，2，5*，王妙姝，康紅艷，羅云波

（1 河北農業大學食品科技學院 河北保定 071001 2 國家北方山區農業工程技術研究中心 河北保定 071001 3 保定學院生物化工與環境工程學院 河北保定 071001 4 河北新希望天香乳業有限公司 河北保定 071001 5 河北省益生功能性乳制品技術創新中心 河北保定 071001 6 中國農業大學食品科技與營養工程學院 北京 100083）

近年來，隨著乳酸菌與健康關系研究的深入，發酵食品越來越多的健康功能被揭示，發酵乳制品行業快速崛起，成為全球發展最快的高附加值行業之一[1-3]。隨之，發酵乳制品的生產技術受到極大關注，而發酵劑制備是其核心技術之一。傳統人工型液態發酵劑存在弊端，20世紀初，國外開始研究高效直投式發酵劑，至20世紀60年代后逐漸商品化。而我國在高效直投式發酵劑方面研究起步較晚，長期被國外企業壟斷，主要依賴進口，價格異常昂貴[4-5]。高效直投式發酵劑在酸奶中應用時普遍存在后酸化的問題，原因是保加利亞乳桿菌是主要的產酸菌株，在長期高溫發酵、低溫貯存的過程中，菌株繼續發酵產酸，進而導致發酵乳制品貯藏期質量不穩定，保質期縮短[6]。目前，國外研究出一些弱后酸化效果顯著的菌株，然而均受專利保護。目前，我國主要在工藝水平上控制酸奶后酸化，不能從根本上解決問題。研制開發具有自主知識產權的弱后酸化高效直投式發酵劑，是解決酸奶后酸化問題的關鍵。

制備弱后酸化高效直投式發酵劑的關鍵技術主要包括：弱后酸化乳酸菌株的選育、廉價增菌培養基的篩選、細胞增菌培養；菌體細胞濃縮分離；高效保護劑篩選與干燥工藝；高效直投式發酵劑的貯藏穩定性等。本實驗室研究人員前期對弱后酸化乳酸菌株進行選育，并對選育的菌株進行廉價增菌培養基的篩選。關于乳酸菌細胞增菌培養技術，考慮到乳酸菌生長繁殖速度較快，采用分批式培養，對培養設備要求簡單，易于控制。為獲得高濃度細胞培養物，采用分批補料式培養，主要有化學中和法、緩沖鹽法、膜滲析法?；瘜W中和法可獲得高密度菌體，簡便易行，是目前應用最廣泛的一種方法，然而，當乳酸與堿液反應產生乳酸氨或乳酸鈉等鹽類物質達到一定濃度時，也會抑制菌體生長繁殖[7-8]。緩沖鹽的緩沖作用有一定范圍，發酵菌液不能達到很高的菌體濃度，高鹽濃度會對乳酸菌菌體生長產生抑制作用[7]。膜滲析法是目前最先進的方法，培養效果最好，然而設備投資大，多次過濾耗能大，對超濾膜材料和操作要求較嚴格，同時在培養過程中易感染噬菌體，工業上應用并不廣泛[4，7-9]。本實驗室新選育的弱后酸化菌株生長特性是否發生改變？ 該菌株究竟適宜采用何種培養方法？需要用產率和轉化率指標來衡量，并通過試驗探明。

針對以上問題，選用選育并優化組合的優良弱后酸化乳酸菌菌株及廉價胡蘿卜汁復合增菌培養基，通過300 mL 三角瓶水平的搖瓶分批式培養，采用單因素和正交優化試驗研究培養溫度、培養方式、培養基起始pH 值、接種量對弱后酸化菌株生長的影響。通過50 L 發酵罐分批補料式擴大培養試驗研究調節pH 值、流加葡萄糖補料以及既調節pH 值又流加葡萄糖補料對弱后酸化菌株生長的影響。通過優化后酸化乳酸菌的增殖培養條件，為高效直投式發酵劑產業化提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌種 弱后酸化保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）Lb-s1 rp-1：本試驗室（河北農業大學食品科技學院發酵工程試驗室）前期自行選育。

1.1.2 原料 胡蘿卜，購自本市大型超市，用于制作胡蘿卜汁復合增菌培養基。

1.1.3 培養基

1） MRS 培養基[10]液體用于菌種的活化，固體用于活菌計數；

2） 胡蘿卜汁復合增菌培養基 挑選新鮮、完好、大小適中的胡蘿卜→洗凈→切片（厚度2 mm）→煮沸 （料∶水＝1∶1，100 ℃，10 min）→打漿（10 min）→過慮（100 目濾布，2 遍）→磨漿（膠體磨，10 min）→添加促生長物質（0.3%大豆蛋白胨、1.0%蛋白胨、0.5%酵母膏、0.5%碳酸鈣）→調糖度 （2～3 Bix°）→調pH 值→滅菌（115 ℃，20 min）→冷卻至37 ℃備用，用于搖瓶分批式培養試驗和發酵罐分批補料式擴大培養試驗。

1.1.4 主要儀器設備 YXQ-LS-18SI/22L 手提式濕熱滅菌鍋，上海東亞壓力容器公司；SHP-250 型生化培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；JM-80F 型膠體磨，江蘇丹徒縣紀中電器五金廠；FOM-Z150-2 打漿機，鎮江市丹徒區紀中電器廠；STARTER 2100 實驗室pH 計，奧豪斯（OHAUS）儀器（上海）有限公司；50 L 全自動發酵罐，上海迪比爾生物工程有限公司；阿貝折光儀，上海歡奧科技有限公司；78-1 磁力加熱攪拌器，金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 實驗室搖瓶分批式培養試驗 首先通過單因素實驗研究培養溫度、培養方式、培養基起始pH 值、接種量對實驗室搖瓶分批式培養菌種增菌的影響，然后對有交互作用的因素條件進行正交優化，最后在正交優化試驗得到的最佳工藝條件下培養菌種進行驗證試驗。

1） 培養溫度對菌種增菌的影響 弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 經MRS 液體培養基活化后，以體積分數0.6%（約3×106CFU/mL）接入滅菌的300 mL 三角瓶（裝液量200 mL）、pH 值為6.5～7.0 的胡蘿卜汁復合增菌培養基中，分別置于32，37，42 ℃恒溫、靜置培養12 h，定時取樣檢測活菌數，繪制生長曲線。

2） 培養方式對菌種增菌的影響 菌株活化后，以體積分數0.6%（約3×106CFU/mL）接種量分別接入滅菌的300 mL 三角瓶（裝液量200 mL）和滅菌的250 mL 厭氧瓶 （即輸液瓶，裝液量200 mL，裝液過程中通過Hungate 厭氧系統充氮除氧）、pH 值為6.5～7.0 的胡蘿卜汁復合增菌培養基中，于37 ℃分別進行轉速80 r/min 搖床培養（三角瓶）、靜置培養（三角瓶）、厭氧培養（厭氧瓶）8 h，檢測活菌數。

3） 培養基起始pH 值對菌種增菌的影響 用2 mol/L Na2CO3溶液經磁力攪拌器將胡蘿卜汁復合增菌培養基pH 值分別調至5.5，6.0，6.5，7.0，7.5 梯度系列，分裝300 mL 三角瓶（裝液量均為200 mL），115 ℃滅菌20 min 冷卻備用。菌株活化后，每株菌以體積分數0.6%（約3×106CFU/mL）接種量分別接入不同pH 值的三角瓶胡蘿卜汁復合增菌培養基中，37 ℃靜置培養8 h，檢測活菌數。

4） 接種量對菌種增菌的影響 菌株活化后，分別以體積分數0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%接入滅菌的300 mL 三角瓶（裝液量200 mL）、pH 值為6.5 的胡蘿卜汁復合增菌培養基中，37 ℃靜置培養12 h，定時取樣檢測活菌數，繪制生長曲線。

5） 菌株搖瓶增菌工藝正交優化試驗 考慮增菌因素之間存在交互協同作用，在單因素實驗中選擇培養溫度、培養基起始pH 值、接種量為主要因素，利用L9（33）正交試驗優化弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 菌株的搖瓶增菌工藝條件，因素水平見表1。

表1 Lb-s1 rp-1 搖瓶增菌工藝正交優化試驗中各因素水平表Table 1 Factor level table of Lb-s1 rp-1 in orthogonal optimization experiment of shake flask enrichment process

6） 驗證試驗 根據菌株搖瓶增菌工藝正交優化試驗得到的最佳增菌工藝條件培養弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1，對正交試驗結果進行驗證。

1.2.2 50 L 發酵罐分批補料式擴大培養試驗 根據實驗室搖瓶分批式培養試驗得到的最佳增菌工藝，利用胡蘿卜汁復合增菌培養基對弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 進行50 L （30 L 培養基）全自動發酵罐擴大培養試驗，以分批式擴大培養為對照，設置3 種補料方式：①用2 mol/L 的Na2CO3溶液調節培養基恒定pH 值為5.5；②在對數生長末期6 h 時補加1.5 mol/L 葡萄糖溶液使發酵罐中葡糖糖質量濃度保持20 g/L；③既用2 mol/L 的Na2CO3溶液調節培養基恒定pH 值為5.5，又在對數生長末期6 h 時補加1.5 mol/L 葡萄糖溶液。定時取樣檢測活菌數，繪制生長曲線。

1.3 檢測方法

1.3.1 乳酸菌活菌計數 參照GB 4789.35-2016平板計數法[11]，每個試驗均重復3 次。

1.3.2 pH 值的測定 采用OHAUS Starter 2100 pH 計直接測定，每個試驗均重復3 次。

1.4 試驗數據統計分析方法

試驗數據采用SPSS Statistics 17.0 進行方差分析及多重比較。

2 結果與分析

2.1 試驗室搖瓶分批式培養試驗

2.1.1 培養溫度對菌種增菌的影響 溫度是影響微生物生長繁殖的重要因素之一，通過影響蛋白質、核酸等生物大分子的結構和功能以及細胞結構來影響微生物的生長、繁殖和新陳代謝，不同微生物最適生長溫度隨著培養基成分、培養條件和菌體生長階段變化而改變[9，12]。根據1.2.1（1）節的試驗方法，探究不同培養溫度對弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 生長的影響，結果見圖1。

圖1 Lb-s1 rp-1 在胡蘿卜汁復合增菌培養基中不同溫度培養生長曲線Fig.1 Growth curve of Lb-s1 rp-1 in carrot juice complex enrichment medium at different temperatures

圖1可知，菌株在胡蘿卜汁復合增菌培養基中，分別于32，37，42 ℃恒溫靜置培養，到達對數生長末期或穩定初期的培養時間分別為9，7，5 h，穩定期活菌數分別為1.33×109，9.98×109，4.89×109CFU/mL，37 ℃培養的活菌數顯著高于32 ℃和42 ℃培養（P<0.05）。原因是在一定范圍內，當溫度升高時，細胞內的酶催化和化學反應速率都會加快，菌體生長也會加快，同時營養物和代謝物的溶解度提高，細胞膜流動性增大，有利于營養物質的吸收和代謝產物的排除。然而，當超過一定溫度后繼續升溫，會使蛋白質和核酸等受到不可逆的損害，從而抑制菌體生長代謝，甚至導致死亡[13]。確定培養溫度37 ℃作為下一步正交優化試驗的主要因素與基準水平。

2.1.2 培養方式對菌種增菌的影響 供氧情況影響培養基的氧化還原電位值，可使乳酸菌的代謝途徑發生改變，這對菌種的生長尤為重要[12]。因此，根據1.2.1（2）節的試驗方法，采用不同的培養方式研究對弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1生長的影響，結果見圖2。

圖2可知，菌株在胡蘿卜汁復合增菌培養基中，37 ℃分別進行搖床培養（轉速為80 r/min）、靜置培養、厭氧培養8 h 后，活菌數分別為2.02×1010，1.93×1010，3.23×107CFU/mL，靜置培養和厭氧培養的活菌數極顯著高于搖床培養 （P＜0.01），而且靜置培養和厭氧培養的活菌數差異不顯著（P＞0.05）。結果表明，培養方式對弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 的生長影響很大，靜置培養和厭氧培養優于搖床好氧培養。

圖2 Lb-s1 rp-1 在不同培養方式下穩定期的活菌數Fig.2 Number of Lb-s1 rp-1 viable bacteria in the stationary phase of different culture methods

本研究結果與古元懿[8]、蔡毅等[14]研究結果相符，這主要是由于保加利亞乳桿菌基因組中缺少超氧化物歧化酶，導致其在有氧條件下的生長較差，只有在發酵培養基中的氧含量較低的情況下，才能快速生長[15]。根據本試驗結果，為簡化工藝操作，節省能源，降低生產成本，減少設備投資，確定弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 采用靜置培養方式。

2.1.3 培養基起始pH 值對菌種增菌的影響 培養基起始pH 值也是影響菌株活菌數量的關鍵因素之一，合適的起始pH 值能縮短菌株生長的延滯期，較快的進入對數生長期，不同菌株的最適生長pH 值范圍也不同[16]。因此，根據1.2.1（3）節的試驗方法，研究培養基不同起始pH 值對弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 生長的影響，結果見圖3。

圖3 Lb-s1 rp-1 在不同起始pH 值培養基中穩定期的活菌數Fig.3 Number of Lb-s1 rp-1 viable bacteria in stationary phase at different initial pH media

圖3可知，菌株在起始pH 值為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5 的胡蘿卜汁復合增菌培養基中，37 ℃搖床培養8 h 后，活菌數分別為9.17×109，1.18×1010，2.12×1010，1.86×1010，1.14×1010CFU/mL，在起始pH值為5.5～7.5 的范圍內，活菌數隨著pH 值的增大先升高后降低，pH 值為6.5 時，活菌數最高，顯著高于其它起始pH 值（P＜0.05）?？赡苡捎趐H 值從多方面影響著微生物的生命活動，不僅影響胞內、外酶的生物活性，還影響微生物對營養物質的吸收，以及改變培養基中化合物離子化程度，從而促進或抑制菌株的生長繁殖。因此，確定培養基起始pH 值為6.5 作為下一步正交優化試驗的主要因素與基準水平。

2.1.4 接種量對菌種增菌的影響 不同的接種量對菌體活性影響不同，從而影響菌體適應能力和生長速率[13]。因此，根據1.2.1（4）節的試驗方法，研究不同接種量對弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 生長的影響，結果見圖4。

由圖4可知，菌株分別以0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%的接種量在胡蘿卜汁復合增菌培養基中37 ℃靜置培養，通過檢測活菌數，到達對數生長末期的培養時間分別為10，9，7，6，5 h；穩定期活菌數分別達到2.09×1010，2.13×1010，2.18×1010，2.28×1010，2.20×1010CFU/mL。結果表明，接種量對菌種到達對數生長末期的時間有顯著影響（P＜0.05），對穩定期的活菌數無顯著影響（P＞0.05）。接種量較低會延長菌體的延滯期，接種量較高菌體會較快進入對數生長期，進而較快進入菌體穩定期，在穩定期菌體容易發生自溶現象[16]。因此，選擇1.0%的接種量作為下一步正交優化試驗的主要因素與基準水平。

圖4 Lb-s1 rp-1 在胡蘿卜汁復合增菌培養基中不同接菌量培養生長曲線Fig.4 Growth curve of Lb-s1 rp-1 in carrot juice complex enriched medium with different inoculation amount

2.1.5 菌株搖瓶增菌工藝正交優化試驗 根據1.2.1（5）節的試驗方法進行弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 搖瓶增菌工藝正交優化試驗，結果見表2。

表2 Lb-s1 rp-1 搖瓶增菌工藝正交優化試驗結果Table 2 Orthogonal optimization test results of Lb-s1 rp-1 in shake flask enrichment process

表2表明，三因素對菌株的影響順序為：培養溫度（A）＞接菌量（C）＞起始pH 值（B），通過對活菌數極差分析得到菌株的最佳增菌培養條件為：A2B2C3，即培養溫度37 ℃、起始pH 值6.5、接菌量1.0%。

2.1.6 驗證試驗 根據1.2.1（6）節的試驗方法對弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 搖瓶增菌工藝條件正交優化試驗結果進行驗證試驗，結果見圖5。

本實驗室前期研究結果[17]：未經過弱后酸化選育的保加利亞乳桿菌Lb-s1 在番茄復合汁增菌培養基中，37 ℃恒溫培養18 h，活菌數達到2.25×1010CFU/mL。與本研究結果圖5所示：保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 在最佳增菌培養條件下，6 h 到達對數生長末期，穩定期活菌數為2.28×1010CFU/mL。對比表明：經過弱后酸化選育后，穩定期活菌數無顯著性差異（P＞0.05），到達對數末期的時間極顯著縮短（P＜0.01）。

圖5 Lb-s1 rp-1 在最佳增菌培養條件下生長曲線Fig.5 Growth curve of Lb-s1 rp-1 under optimal culture conditions

進一步證明保加利亞乳桿菌Lb-s1 經過弱后酸化選育之后，其細胞生長特性大大提高，細胞生長量未發生顯著改變。因此，優化的搖瓶分批式培養工藝是可行的，可為下一步研究50 L 全自動發酵罐分批補料式擴大培養工藝奠定基礎。

綜上所述，弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 實驗室搖瓶分批式培養最佳增菌工藝條件為：培養溫度37 ℃、培養基起始pH 值6.5、接菌量1.0%、靜置培養，在此工藝條件下培養該菌株，6 h到達對數生長末期，穩定期活菌數為2.28×1010CFU/mL。

2.2 50 L 發酵罐分批補料式擴大培養試驗

根據1.2.2 節的試驗方法對弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 進行50 L 發酵罐分批補料式擴大培養優選試驗，結果如圖6所示。

圖6可知，按照搖瓶分批式培養試驗得到的最佳增菌工藝將弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 在50 L 發酵罐中分批式擴大培養，6 h 到達對數生長末期，活菌數為2.35×1010CFU/mL。通過3 種補料方式，即調節pH 值、補料、調節pH 值與補料，到達對數生長末期的時間分別是8，6，8 h，穩定期活菌數分別是2.29×1010，2.39×1010，2.48×1010CFU/mL。表明：調節pH 值可以顯著延長該菌株對數生長期（P＜0.05），補料對該菌略有增菌作用，然而，經過生物統計分析，3 種補料方式對菌株穩定期活菌數均無顯著影響（P＞0.05）。原因可能是該菌株6 h 即可到達對數生長末期，屬于生長較快的微生物，培養基的營養物質也快速被消耗掉，單純補充葡萄糖單一碳源，無法滿足菌株繼續快速生長的營養需求。因此，綜合考慮菌株培養成本、設備要求、操作簡便程度以及產率，采用50 L 發酵罐分批式擴大培養弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 的工藝是可行的，同時也為下一步產業化菌體培養工藝提供了依據。

圖6 Lb-s1 rp-1 在50 L 發酵罐中不同方式下生長曲線Fig.6 Growth curve of Lb-s1 rp-1 under different methods in 50 L fermenter

3 討論與結論

目前國內外弱后酸化保加利亞乳桿菌的選育技術主要有誘變育種、原生質體融合、基因工程技術。傳統的誘變育種雖然存在工作量大、耗時長等問題，然而選育的弱后酸化菌株安全性有保證，而且沒有原生質體融合技術的弊端[18]。本實驗室前期通過硫酸新霉素誘變育種法篩選得到弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1，該菌株傳至第8 代仍具有弱后酸化性能，具有遺傳穩定性。培養基為乳酸菌提供菌體生長、繁殖、代謝所需要的碳源、氮源、無機鹽和生長因子，試驗室所用的MRS 培養基成本較高，成分較多，配制繁瑣，并不適用于工業生產，篩選廉價增殖培養基是降低成本的關鍵環節。本實驗室從2000年初就開始了對乳酸菌廉價增殖培養基的研究，已經針對不同菌株研制出菊芋汁[19]、番茄汁[17]、麥芽汁[20]、冬瓜汁[21]等復合增菌培養基，目前，本實驗室的這項技術已非常成熟。然而，國內還沒有關于弱后酸化保加利亞乳桿菌廉價增殖培養基的研究報道，本實驗室對弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 進行了的廉價增菌培養基的篩選工作，得出胡蘿卜汁復合增菌培養基為最佳增殖培養基。

龐啟亮等[22]研究的可以延緩后酸化的保加利亞乳桿菌H+-ATPase 缺陷型菌株在篩選的最適宜增殖培養基上，活菌數為1.44×109CFU/mL；姜慶玲等[23]對德氏乳桿菌保加利亞亞種的培養基及培養條件進行了優化，經優化后活菌數達6.07×109CFU/mL；程艷宇等[24]研究得出保加利亞乳桿菌LB在增殖培養基中，活菌數可達1.09×109CFU/mL。本研究得出弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1實驗室搖瓶分批式培養，最高活菌數達2.28×1010CFU/mL，遠高于現有報道結果。與弱后酸化選育前相比，菌株穩定期活菌數無顯著差異（P＞0.05），說明保加利亞乳桿菌Lb-s1 經過弱后酸化選育之后，細胞生長量未發生顯著改變，因此，本文優化的搖瓶分批式培養工藝是可行的，可為下一步研究50 L 全自動發酵罐分批補料式擴大培養工藝奠定基礎。

由于搖瓶培養與發酵罐培養的環境條件有很大不同，因此不能直接使用搖瓶培養工藝進行發酵罐培養，需要在搖瓶培養工藝的基礎上進一步考察適宜發酵罐培養的條件?？垫嫉萚25]研究得出保加利亞乳桿菌在5 L 發酵罐中擴大培養的活菌數最大達到5.5×108CFU/mL；劉洋[26]對保加利亞乳桿菌進行1 L 的放大培養試驗，結果顯示，活菌數最高可達1.8×109CFU/mL；李佳[27]在5 L 全自動發酵罐中對保加利亞乳桿菌LB5 的高密度培養條件進行了優化，優化后活菌數達到2.7×109CFU/mL；本研究對弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1在50 L 發酵罐分批補料式擴大培養試驗中，得到的活菌數達1010CFU/mL，遠高于已報道的研究結果。綜合考慮菌株培養成本、設備要求、操作簡便程度以及產率，采用50 L 發酵罐分批式擴大培養弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 的工藝是可行的，可為弱后酸化保加利亞乳桿菌高效直投式發酵劑產業化提供菌體增殖培養技術。

綜上所述，本文對自行選育的弱后酸化保加利亞乳桿菌Lb-s1 rp-1 在優化的胡蘿卜汁復合增菌培養基上，進行實驗室搖瓶分批式培養優選試驗、50 L 發酵罐分批補料式擴大培養優選試驗，在最佳的培養方式下得到較高的活菌數，為工業化生產弱后酸化保加利亞乳桿菌高效直投式酸奶發酵劑中提供細胞廉價增殖培養技術，也為研究其它弱后酸化益生乳酸菌的細胞培養技術提供參考借鑒。