介質阻擋等離子體降解阿月渾子堅果仁中AFB1的效果研究

蘇迎利, 馬挺軍

(北京農學院食品科學與工程學院，北京 102206)

阿月渾子(PistaciaveraL.)為漆樹科黃連木屬的落葉小喬木，是我國珍貴的木本油料植物，其堅果商品名為開心果，為世界五大堅果之一[1]。阿月渾子堅果仁營養豐富，尤其富含油脂，每100 g阿月渾子堅果仁脂肪可達到53 g，占到阿月渾子堅果仁質量的一半以上，故其易感染黃曲霉產生AFB1[2]，國標規定堅果及籽類中除花生之外其他的熟制堅果及籽類的限量標準為5.0 μg/kg[3]，并有即將實施的國標規定阿月渾子中黃曲霉毒素污染控制規范[4]，使阿月渾子被AFB1感染的幾率降低。

黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)是由黃曲霉和寄生曲霉所產生的一種次生代謝物，具有急慢性毒性、致畸、致癌和致突變性[5]。黃曲霉毒素可存在于各種富含油脂的食品中，如堅果、谷物和香料中[6]。目前降解AFB1的方法主要分為化學法[7]、生物法[8，9]和物理法[10]。物理法有吸附脫毒[11]、高溫降解[12]、輻射降解[13]、超聲降解[14]等方法，是目前應用較多降解AFB1的一類方法，但大多存在著處理時間長，對產品風味、營養成分造成不良影響，穩定性差、產物不定向、成本高、安全隱患等問題。其中等離子體法因為降解時間短、無殘留在降解AFB1的研究中受到廣泛關注[15]。

等離子體(Plasma)是一種正離子和電子密度大致相等的電離氣體，由離子、電子以及未電離的中性粒子集合組成，整體呈現中性的物質狀態，被稱為是除固態、液態、氣態之外的第四狀態[16]。介質阻擋(Dielectric barrier discharge，DBD)等離子體是低溫等離子體的種類之一，也稱無聲放電，是一種有絕緣介質(例如石英)插入放電空間的一種氣體放電[17]，具有操作溫度低、無需外源化學試劑、節約成本等優勢，選擇的原因是適用范圍廣、可選擇多種載氣、氣體消耗量小、有效面積大且均勻[18]。具有影響酶的活性[19]、修飾食品基質功能特性[20]、降解毒素[21]和農藥[22]、對農產品原材料[23]進行滅菌等作用?，F有研究報道等離子體可降解金黃色葡萄球菌腸毒素B(Staphylococcal Enterotoxin B，SEB)[24]、AFB1[24，30]、赭曲霉毒素[31]、玉米赤霉烯酮[32]、嘔吐毒素(脫氧雪腐鐮刀菌烯醇)[33]、T-2毒素[34]等真菌毒素，降解效果顯著。

目前使用DBD等離子體法降解AFB1的研究較少，利用DBD等離子體法降解阿月渾子堅果仁中的AFB1更是少見。本研究通過DBD等離子體法對阿月渾子堅果仁中的AFB1進行降解，采用響應面法優化降解工藝條件，為AFB1的降解和等離子體法的開發應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿月渾子堅果粉原料、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、正己烷、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、Tween-20、三氟乙酸、AFB1總量免疫親和柱、0.22 μm濾膜、1.5 mL eppendorf(EP)管、50 mL玻璃注射器。

1.2 儀器與設備

DBD等離子體(配有TDGC-0.5kVA接觸調壓器)，BF2000-30A氮吹儀，一次性無菌注射器(2 mL)，DGU-20A型高效液相色譜儀(配有RF-10A型熒光檢測器)，Model 3000型均質器，KW-1000DC型恒溫箱，XW-80A型渦旋儀，VP-15L真空泵。

1.3 實驗裝置

實驗裝置圖如圖1所示。

圖1 DBD等離子體裝置圖

1.4 實驗方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：40 ℃；流動相：V(甲醇)：V(水)=50∶50，流速:0.8 mL/min，進樣量：50 μL，熒光檢測器：激發波長：360 nm，發射波長：440 nm。

1.4.2 標準曲線的繪制

準確配制濃度為1、5、20、50、100、200 ng/mL的AFB1標準溶液各8 mL于10 mL離心管后在50 ℃下用氮氣緩緩吹至近干，分別加入200 μL正己烷和100 μL三氟乙酸，渦旋30 s，在(40±1)℃的恒溫箱中衍生15 min，衍生結束后，在50 ℃下用氮氣緩緩地將衍生液吹至近干，用初始流動相定容至1 mL，渦旋30 s溶解殘留物，過0.22 μm濾膜，收集濾液于進樣瓶中以備進樣。實驗重復3次，計算平均值，以色譜圖中峰面積為縱坐標y，以待測樣品質量濃度為橫坐標x繪制標準曲線?；貧w方程y=57 773.964x+166 368.663(R2=0.999 5)，數據顯示曲線擬合性良好。

1.4.3 單因素實驗

1.4.3.1 DBD等離子體放電時間的實驗

準確稱取5.0 g阿月渾子堅果粉，置于等離子體介質之間的蓋玻片上壓平至均勻分布。設定放電功率為160 W，放電間距為0.3 cm，放電時間設定為20、30、40、50、60 s。處理后加入20.0 mL乙腈水[v(乙腈):v(去離子水)=84∶16]，以均質器高速攪拌提取3 min。經槽紋濾紙過濾，準確移取4.0 mL濾液并加入46.0 mL 1%Tween-20 PBS溶液稀釋。

1.4.3.2 DBD等離子體放電功率的實驗

準確稱取5.0 g阿月渾子堅果粉，置于等離子體介質之間的蓋玻片上壓平至均勻分布。設定放電功率為120、140、160、180、200 W，放電間距為0.3 cm，放電時間40 s。處理后加入20.0 mL乙腈水[v(乙腈)∶v(去離子水)=84∶16]，以均質器高速攪拌提取3 min。經槽紋濾紙過濾，準確移取4.0 mL濾液并加入46.0 mL 1%Tween-20 PBS溶液稀釋。

1.4.3.3 DBD等離子體放電間距的實驗

準確稱取5.0 g阿月渾子堅果粉，置于等離子體介質之間的蓋玻片上壓平至均勻分布。設定放電功率為160 W，放電間距為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 cm，放電時間40 s。處理后加入20.0 mL乙腈水[V(乙腈)∶V(去離子水)= 84∶16]，以均質器高速攪拌提取3 min。經槽紋濾紙過濾，準確移取4.0 mL濾液并加入46.0 mL 1%Tween-20 PBS溶液稀釋。

1.4.4 樣品的凈化

將免疫親和柱連接于50.0 mL玻璃注射器下。準確將處理好的樣品濾液注入玻璃注射器中，調節下滴速度，控制樣液以1～3 mL/min的速度穩定下滴。待樣液滴完后，往注射器筒內加入2×10 mL水，以2～4 mL/min穩定流速淋洗免疫親和柱。待水滴完后，用真空泵抽干親和柱。準確加入1.0 mL色譜級甲醇洗脫，流速為1～2 mL/min(1滴/s)，收集全部洗脫液于1.5 mL EP管中。將1.0 mL洗脫液在50 ℃氮氣下吹干，用1 mL流動相定容后，混勻，注入HPLC檢測。

1.5 AFB1降解率的計算

1.5.1 AFB1降解后殘留量的計算

式中：X為阿月渾子中AFB1的含量/μg/kg；ρ為進樣溶液中AFB1按照外標法在標準曲線中對應的濃度/ng/mL；V1為試樣提取液體積/mL；V3為凈化液的最終定容體積/mL；1 000為換算系數；V2為凈化柱凈化后的取樣液體積/mL；m為試樣的稱樣量/g。

1.5.2 AFB1降解率的計算

式中：A0為等離子體處理前阿月渾子堅果仁中AFB1初始濃度/μg/kg；A1為等離子體處理后阿月渾子堅果仁中AFB1的濃度/μg/kg。

1.6 Box-Behnken實驗設計

選取放電時間、放電功率和放電間距為主要因子，以AFB1的降解率為響應值，采用3因素3水平的響應面分析法進行實驗設計，以獲得最優實驗參數。實驗設計的因素和水平見表1。

表1 響應面實驗設計因子和水平

2 結果與分析

2.1 單因素實驗對AFB1降解率的影響

2.1.1 DBD等離子體放電時間對AFB1降解率的影響

由圖2可知，AFB1在功率160 W，間距0.4 cm，放電時間60 s的等離子體條件下，AFB1的降解率達到93.10%。在放電時間20～60 s范圍內，隨著時間的增加，AFB1的降解率不斷增大，但增大幅度有所下降。對固體表面反應有直接作用的是自由基和振動激發態物質，離子和電子等激發態物質在到達表面前就已經失活。原因可能是時間越長，DBD等離子體產生自由基和激發態物質的速度減慢[16]。綜合考慮，選取放電時間20、30、40 s作為響應面實驗設計的因素。

注：a-c表示差異顯著(P<0.05)。余同。

2.1.2 DBD等離子體放電功率對AFB1降解率的影響

由圖3可知，在等離子體放電功率為120～200 W范圍內，隨著功率升高，AFB1的降解率呈不斷增大的趨勢。原因是DBD等離子體放電功率增大，產生較大的折合場強，從而導致微放電中的平均電子能量升高，活性粒子運動速度會加快，所以電子積累的速度更快，能量密度越強，使得AFB1降解率增加[17]。綜合考慮，選取160、180、200 W作為響應面實驗設計的因素水平。

圖3 DBD等離子體放電功率對AFB1降解率的影響

2.1.3 DBD等離子體放電間距對AFB1降解率的影響

由圖4可知，在放電間距0.3～0.7 cm時，AFB1降解率不斷降低。AFB1的降解率隨著放電間距的增大而減少。原因可能是間隙活性粒子的濃度降低導致降解效果減弱，同樣的能量在越來越大的間距之間傳遞導致能量密度變小，產生的活性氣體較少，故使降解率降低[17]。綜合考慮，選取放電間距0.4、0.5、0.6 cm作為響應面實驗設計的因素水平。

圖4 DBD等離子體放電間距對AFB1降解率的影響

2.2 響應面實驗

以DBD等離子體放電功率、放電時間、放電間距為自變量，根據Box-Behnken模型所設計的試驗方案進行響應面分析實驗，實驗設計與結果如表2所示。

應用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數據進行響應面回歸分析，建立AFB1降解率(Y)的回歸模型，擬合二次多項式方程如下：

表2 響應面實驗設計及結果

Y=80.36-1.10A+6.81B+2.16C-0.15AB+0.87AC-2.46BC+0.45A2-3.77B2+12.25C2。

各個因素的F值反映了此因素對試驗指標的重要程度，通過表3能夠得出，AFB1降解率受3個因素的影響依次為B>C>A，即放電功率>放電間距>放電時間。模擬一次項B、二次項B2、C2均對響應值AFB1降解率影響極顯著(P<0.01)；一次項C、二次項BC交互作用顯著(P<0.05)；其余項對AFB1降解率不顯著。

表3 響應面方差分析結果

在放電間距為0.4 cm時，放電時間和放電功率對AFB1降解率的交互作用。放電功率一定時，隨著放電間距的增大，AFB1的降解率減少。當放電間距一定時，隨著放電功率增大，AFB1的降解率不斷增大。因此，在放電功率和放電間距兩個因素相互影響下，放電功率對響應值得影響更大。

在處理電壓為160 W時，放電時間和放電間距對AFB1降解率的交互作用?？芍?，放電時間一定時，隨著放電間距的增大，AFB1的降解率呈先減小后增加的趨勢。當放電間距一定，放電時間增大，AFB1的降解率增大，但是變化幅度不大。因此，在放電時間和放電間距兩個因素相互影響下，放電間距對響應值的影響大。

在放電時間40 s時，放電間距和放電功率對AFB1降解率的交互作用。放電間距一定時，隨著放電時間的增加，AFB1的降解率增大，但變化幅度不大；放電功率一定時，隨著放電間距增大，AFB1的降解率先降低后增加，總體趨勢降低。因此，在放電時間和放電間距兩個因素相互影響下，放電功率對響應值的影響更大。

2.3 最佳實驗條件的預測和驗證

通過回歸模型的預測，得到DBD等離子體降解阿月渾子堅果仁中AFB1的最佳實驗條件：放電時間20 s，放電功率200 W，放電間距0.4 cm，此時AFB1的理論降解率的最大值為98.516 2%。在此最佳實驗條件下進行實驗操作，阿月渾子堅果仁中AFB1含量從656.29 μg/kg降解至7.49 μg/kg，降解率為93.428 7%。

3 結論

DBD等離子體對阿月渾子堅果仁中的AFB1具有很好的降解作用。AFB1的降解率與放電時間和放電功率呈正相關，與放電間距呈負相關關系。

DBD等離子體降解阿月渾子堅果仁中AFB1的最佳工藝條件為放電時間20 s，放電功率200 W，放電間距0.4 cm。AFB1降解率與預測的值基本一致，說明該模型可用于DBD等離子體對阿月渾子堅果仁中AFB1降解效果的預測。