基于斑馬魚模型評價發酵對麥麩多糖抗氧化活性的影響

陳秋燕，王瑞芳，王 園，安曉萍，楊艷平，宋 敏，齊景偉

(內蒙古農業大學動物科學學院；內蒙古自治區草食家畜飼料工程技術研究中心2,呼和浩特 010018)

小麥是我國重要的糧食作物之一，麥麩是小麥加工的副產物，資源十分豐富。研究發現麥麩富含豐富的多糖、礦物質、膳食纖維、酚類物質和維生素等營養成分[1，2]。多糖是麥麩中最典型的功能性物質。麥麩多糖主要由非淀粉多糖組成，其含量高達46%左右，是小麥細胞壁的主要成分。研究發現，麥麩多糖具有抗氧化、降低膽固醇、提高機體免疫力、抗癌、降血脂、降血壓等多種功效[3-7]，而我國目前大部分麩皮僅被用于傳統釀酒、飼料等領域，仍缺乏對小麥麩皮資源的深度開發利用，對其功能性食品的開發仍處于較低水平，因此，如何更高效地利用麥麩資源，對提高其附加值具有重要的意義。對于麥麩中活性多糖的提取目前常采用熱水浸提法、超聲波輔助提取法和酶解法等[8-10]。近年來的研究發現，通過益生菌發酵麥麩可提高其多糖、酚酸和糖醛酸等生物活性物質的含量[11]，發酵可以使微生物產酶過程與酶作用過程合二為一，是一種控制營養物質釋放的可行方法，比物理或者化學法具有高特異性、高效率、副作用少等特點，因此，已得到廣泛應用[12-14]。

利用體外實驗(包括細胞、生化、微生物等)評價天然產物的抗氧化活性，雖具有高效、快速的優點，但其結果難與人體實驗結果相比[15]。利用小鼠等哺乳動物模型研究天然物質的抗氧化活性已較為普遍，但這一方法存在成本高、周期長、操作復雜等問題，不便于進行在體內的功能研究。斑馬魚(Daniorerio)是國際認可的新型模式生物，具有體積小、繁殖周期短、產卵量大、胚胎透明、生理結構和功能與哺乳動物高度相似等特點，已被美國國家衛生研究所列為繼人類和小鼠后的第三大模式生物。另外，利用斑馬魚模型開展相關研究具有材料易獲得、易操作、周期短、高效、費用低等優勢，且具有對哺乳類動物實驗預測性強、可比度高等優點，因此，可以有效彌補體外實驗和哺乳動物實驗之間的巨大生物學斷層，已被廣泛用于天然產物生物活性評價[16,17]，特別是其體內抗氧化活性的評價[18,19]。

利用枯草芽孢桿菌與釀酒酵母發酵麥麩后其粗多糖具有較強的自由基清除能力[20]；發酵麥麩阿魏酰低聚糖可通過提高大鼠血漿和組織中抗氧酶活性降低 DNA氧化應激代謝產物8-OHdG的含量，從而有效緩解由敵草快誘導產生的氧化應激[21]；證明了發酵麥麩多糖在體外及體內鼠模型中均具有較強的抗氧化活性。然而，關于未發酵麥麩多糖與發酵麥麩多糖抗氧化活性的對比研究鮮有報道。因此，本研究擬以分離純化后的未發酵與發酵麥麩多糖作為原料，以斑馬魚作為實驗動物，對比研究發酵對 麥麩多糖抗氧化活性的影響，研究結果將為麥麩資源的深度開發利用和抗氧化劑的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥麩：市售；斑馬魚成魚來源國家斑馬魚資源中心(中國，武漢)；2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCF-DA)、1,3-雙(二苯膦)丙烷(DPPP)、吖啶橙(AO)、二甲基亞砜(DMSO)、間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫水浴鍋，LRH-250F生化培養箱，IX51奧林巴斯倒置顯微鏡，微孔板分光光度計，倒置熒光顯微鏡TS2R。

1.3 實驗方法

1.3.1 麥麩多糖的制備

麥麩的發酵參照史俊祥[20]的方法，以B.subtilis(CGMCC 1.892)和S.cerevisiae(CGMCC 2.119)為菌種，含量為1×108CFU/mL，接種比例為3.3∶6.7，將菌種按照體積分數10.4% 接種量與麥麩混合，料水比為1∶1.16，于36 ℃條件下發酵47 h得到發酵麥麩；將同樣的菌比、接種量、料水比添加到麥麩中得到未發酵麥麩。將未發酵與發酵后的麥麩濕樣分別置于45 ℃烘箱中烘干48 h，粉碎過篩，準確稱取未發酵與發酵麥麩粉各100 g置于1 000 mL蒸餾水中，80 ℃熱水浸提30 min，3 500 r/min離心15 min，取上清液進行濃縮，采用sevage法對濃縮液進行去蛋白，用80%乙醇進行沉淀，4 ℃條件下沉淀12 h，離心，取沉淀進行減壓濃縮，再進行冷凍干燥獲得未發酵與發酵麥麩粗多糖。進一步利用DEAE-52纖維素陰離子交換柱對麥麩粗多糖進行分離純化，以蒸餾水為洗脫劑，流速為0.5 mL/min進行洗脫，收集組分旋轉蒸發，冷凍干燥，最終獲得未發酵麥麩多糖(WBP)與發酵麥麩多糖(FWBP)。

1.3.2 斑馬魚的飼養及胚胎收集

野生型斑馬魚親魚購于國家斑馬魚資源中心，飼養于內蒙古農業大學動物科學學院，在(28.5±1)℃、14/10 h光/暗周期條件下飼養，每日交替飼喂人工配合飼料和初孵豐年蟲4次，飼喂1 h后清除殘餌和糞便，每天換水1/3，養殖期間持續充氧，定期監測水質參數。

胚胎收集方法：實驗前一天晚上按照雌∶雄為1∶2的比例挑選健康斑馬魚親魚15尾置于孵化箱中，并用隔板將雌、雄魚分開，保持魚房黑暗環境，于第2天早上將隔板移除，利用自然光照刺激親魚產卵，30 min后將胚胎收集于培養皿中，用胚胎培養液清洗數次，放置于干凈的燒杯中培養備用。

1.3.3 WBP和FWBP暴露對斑馬魚胚胎發育的影響

在體視顯微鏡下挑選受精后7～9 hpf且發育正常的斑馬魚胚胎放置于含有2 mL不同質量濃度(0、25、50、100、200、300 μg/mL)WBP和FWBP培養液的24孔板中，每個質量濃度設置4重復(孔)，每個重復10枚胚胎。將24孔板放在控溫水浴鍋(28.5 ℃)中孵化，每隔12 h更換1次培養液，受精后24、48、72、96 h分別在體視顯微鏡下觀察胚胎發育狀況，統計胚胎死亡率，在96 hpf統計胚胎孵化率。從48 hpf開始在顯微鏡下記錄仔魚心率，并采集其側面照測量不同處理組初孵仔魚體長、計算卵黃囊體積。每個重復組隨機挑選4尾仔魚，計數其在60 s內的心跳次數。體長為從仔魚吻短到尾柄基部的距離，卵黃囊體積大小計算依據公式：

V=a×b2/6

式中：a和b分別為卵黃囊主軸和副軸的長度。

胚胎死亡率為96 h內死亡胚胎總數占放入胚胎總數的百分比；96 hpf胚胎的孵化率為該時間點孵化出膜仔魚數占總胚胎數的百分比。

1.3.4 WBP和FWBP暴露對斑馬魚胚胎抗氧化能力的影響

1.3.4.1 WBP和FWBP對斑馬魚胚胎ROS產生率、細胞死亡率和脂質過氧化率的影響

根據WBP和FWBP暴露對斑馬魚胚胎發育影響的結果，選擇50、100、200 μg/mL的WBP和FWBP進行該實驗。挑選7～9 hpf的胚胎轉移至含有2 mL不同質量濃度(0、50、100、200 μg/mL)WBP和FWBP胚胎培養液的24孔板中，每個質量濃度4個重復，每個重復10枚胚胎，置于28.5 ℃控溫水族缸中繼續孵育，在胚胎發育至24 hpf更換為正常胚胎培養液。待胚胎發育至72 hpf時從每個重復組中隨機挑選5尾仔魚進行熒光染色，其中ROS產生率、細胞死亡率和脂質過氧化率分別使用DCF-DA(20 μg/mL)、吖啶橙(7 μg/mL)和DPPP(25 μg/mL)染色。將斑馬魚仔魚分別避光染色處理1 h、30 min、1 h后，用正常胚胎培養液清洗數次，用MS-222麻醉，置于熒光顯微鏡下捕獲熒光照片，利用image J軟件測量其熒光強度，以對照組為標準計算各處理組的相對熒光強度[22]。ROS相對產生量/細胞相對死亡率/脂質過氧化率=處理組熒光強度/對照組熒光強度×100%。

1.3.4.2 麥麩多糖對斑馬魚胚胎抗氧化酶活性的影響

挑選7～9 hpf的胚胎轉移至含有2 mL不同質量濃度(0、50、100、200 μg/mL)WBP和FWBP胚胎培養液的24孔板中，每個質量濃度7個重復，每個重復40枚胚胎，置于(28.5±1)℃的水族缸中繼續孵育，在胚胎發育至24 hpf時取樣，用胚胎培養液清洗胚胎，置于2 mL離心管中，加入0.01 mol/L PBS(pH 7.4)制成10%組織勻漿液，4 ℃，3 500 r/min離心，取上清液用于抗氧化相關指標測定。CAT、SOD、GSH-PX活性和MDA含量測試盒均為南京建成生物工程研究所產品，所有操作均嚴格按說明書進行。

1.4 數據分析

實驗所有數據均采用“平均值±標準差”來表示，利用SAS 9.2統計軟件中的ANOVA模型進行單因素方差分析，用Duncan’s檢驗進行多重比較，所有實驗至少重復3次，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 WBP和FWBP的毒性評價

2.1.1 WBP和FWBP暴露對斑馬魚胚胎死亡率的影響

由圖1可知，當WBP和FWBP暴露96 hpf，WBP和FWBP質量濃度達到或高于50 μg/mL時，斑馬魚胚胎死亡率隨暴露質量濃度的升高逐漸增加，表明WBP和FWBP對斑馬魚胚胎的毒性具有明顯的質量濃度依賴性，且WBP組斑馬魚胚胎死亡率顯著高于FWBP組(P<0.05)。在質量濃度為200 μg/mL時WBP組胚胎死亡率接近30%，而FWBP組胚胎死亡率低于20%，當質量濃度達到300 μg/mL時，2組斑馬魚胚胎死亡率均超過50%。

注：不同小寫字母表示不同質量濃度WBP與對照組之間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示不同質量濃度FWBP與對照組之間差異顯著(P<0.05)，含有相同標簽表示差異不顯著(P>0.05)，*表示WBP與FWBP差異顯著(P<0.05)，下同。

2.1.2 WBP和FWBP暴露對斑馬魚胚胎孵化率的影響

由圖2可知，與對照組相比，25～100 μg/mL的WBP和FWBP暴露對斑馬魚胚胎孵化率無顯著影響，而當WBP和FWBP質量濃度達到及高于200 μg/mL時顯著降低斑馬魚胚胎的孵化率，且WBP組孵化率顯著低于FWBP組(P<0.05)。

圖2 不同質量濃度WBP和FWBP暴露對斑馬魚胚胎孵化率的影響

2.1.3 WBP和FWBP暴露對斑馬魚胚胎心率的影響

由圖3可知，與對照組相比，實驗質量濃度范圍的FWBP和25～200 μg/mL WBP暴露對斑馬魚胚胎心率無顯著影響。而與對照組跟100 μg/mL WBP相比，當WBP暴露質量濃度達到300 μg/mL時可引起斑馬魚心率顯著降低(P<0.05)。

圖3 不同質量濃度WBP和FWBP暴露對斑馬魚胚胎心率的影響

2.1.4 WBP和FWBP暴露對斑馬魚初孵仔魚體長和卵黃囊體積的影響

由圖4可知，與對照組相比，當WBP和FWBP質量濃度達到300 μg/mL時，斑馬魚初孵仔魚的體長顯著減小(P<0.05)，而50 μg/mL的FWBP組斑馬魚初孵仔魚的體長顯著增加(P<0.05)，其他質量濃度組斑馬魚初孵仔魚體長無顯著變化。

圖4 不同質量濃度WBP和FWBP暴露對斑馬魚胚胎體長的影響

由圖5可知，WBP和FWBP暴露對斑馬魚卵黃囊體積無顯著影響(P>0.05)。

圖5 不同質量濃度WBP和FWBP暴露對斑馬魚卵黃囊體積的影響

當WBP和FWBP暴露質量濃度達到300 μg/mL導致胚胎死亡率增加、孵化率降低、體長變短，心跳減慢，顯著影響斑馬魚胚胎的發育，對斑馬魚胚胎的發育表現出明顯的毒性作用，綜合考慮，選擇50、100、200 μg/mL的WBP和FWBP進行抗氧化能力比較研究。

2.2 WBP和FWBP暴露對斑馬魚胚胎抗氧化能力的影響

2.1.1 WBP和FWBP暴露對斑馬魚體內ROS產生量的影響

由圖6可知，與對照組相比，不同質量濃度的WBP和FWBP暴露顯著降低了斑馬魚體內的ROS產生量(P<0.05)，且在質量濃度為200 μg/mL時FWBP組的ROS產生量顯著低于WBP組(P<0.05)。表明WBP和FWBP暴露可減少斑馬魚ROS產生量，且FWBP的作用強于WBP。

圖6 不同質量濃度WBP和FWBP暴露對斑馬魚體內ROS產生的影響

2.1.2 WBP和FWBP暴露對斑馬魚體內脂質過氧化的影響

由圖7中可知，質量濃度為50～200 μg/mL 的WBP和FWBP暴露均顯著降低斑馬魚體內的脂質過氧化率(P<0.05)，且質量濃度達到200 μg/mL 時FWBP對斑馬魚的脂質過氧化率的降低作用顯著強于WBP組(P<0.05)。表明WBP和FWBP均能通過抑制斑馬魚仔魚脂質過氧化，且FWBP的作用優于WBP。

圖7 不同質量濃度WBP和FWBP暴露對斑馬魚體內脂質過氧化率的影響

2.1.3 WBP和FWBP暴露對斑馬魚體內細胞死亡的影響

由圖8可知，WBP和FWBP暴露均可顯著降低斑馬魚仔魚的細胞死亡率(P<0.05)，雖然WBP和FWBP之間無顯著差異(P>0.05)，但FWBP處理組斑馬魚的細胞死亡率略低于同質量濃度的WBP處理組。

圖8 不同質量濃度WBP和FWBP暴露對斑馬魚體內細胞死亡的影響

2.1.4 WBP和FWBP暴露對斑馬魚胚胎抗氧化酶活性的影響

由圖9～圖11可知，與對照組相比，100、200 μg/mL的WBP和FWBP暴露顯著提高了斑馬魚胚胎中總超氧化物歧化酶活性，且在200 μg/mL質量濃度下FWBP組總超氧化物歧化酶活性顯著高于WBP組(P<0.05)。與對照組相比，不同質量濃度的WBP和FWBP暴露均顯著提高了斑馬魚胚胎中過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性(P<0.05)，且到質量濃度達到200 μg/mL時FWBP組過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著高于WBP組(P<0.05)。

圖9 不同質量濃度WBP和FWBP暴露對斑馬魚胚胎總超氧化物歧化酶活性的影響

圖10 不同質量濃度WBP和FWBP暴露對斑馬魚胚胎過氧化氫酶活性的影響

圖11 不同質量濃度WBP和FWBP暴露對斑馬魚胚胎谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響

3 討論

3.1 WBP和FWBP安全性評價

Wang等[22]評估川芎多糖對斑馬魚胚胎發育的毒性時，發現質量濃度為300 mg/L時已經顯著抑制了胚胎的生長，主要表現為其體長降低了，在質量濃度為500、800 mg/L時，斑馬魚胚胎的致死率高達100%。本研究結果表明，當WBP和FWBP質量濃度達到300 μg/mL時均會導致斑馬魚胚胎心率顯著降低、死亡率提高、孵化率降低及初孵仔魚體長降低，表明高質量濃度的WBP和FWBP對斑馬魚胚胎的發育產生一定的毒性作用。而低于300 μg/mL質量濃度的WBP和FWBP對斑馬魚胚胎發育的影響相對較小。因此，本研究后續實驗中選擇50、100、200 μg/mL的WBP與FWBP進行抗氧化活性評價。

3.2 WBP和FWBP的抗氧化活性評價

氧化應激是體內活性氧產生與抗氧化防御系統作用失衡引起的結果，通常與不同的病理作用有著直接的相關性[24]?；钚匝?ROS)是包括超氧陰離子、羥基自由基和過氧化氫等的化學活性分子，是自然形成的代謝副產物。ROS誘導的氧化應激會損害生物分子功能，從而導致細胞死亡和組織損傷[25]。人體抗氧化系統可分為酶類抗氧化系統和非酶類抗氧化系統，酶類抗氧化系統主要由SOD、CAT、GSH-Px等體內自身的抗氧化酶系組成，其作為體內抗氧化的第一道防線夠阻斷自由基鏈式反應，從而減少自由基的生成[26]。

本實驗利用斑馬魚胚胎對比研究了WBP和FWBP的抗氧化活性，結果顯示，不同質量濃度的WBP和FWBP均顯著降低了斑馬魚體內ROS的產生，抑制了斑馬魚體內脂質過氧化產物的生成，降低了胚胎的細胞死亡率。且與對照組相比，100、200 μg/mL的WBP和FWBP均引起斑馬魚胚胎SOD活性顯著升高，50～200 μg/mL的WBP和FWBP均顯著提高斑馬魚胚胎CAT和GSH-Px活性。表明麥麩多糖具有較強的體內抗氧化作用，且當質量濃度達到200 μg/mL時FWBP的抗氧化作用顯著強于WBP。已有大量研究利用斑馬魚氧化應激模型證實多種植物多糖具有較強的體內抗氧化活性[17,19,22,24]。如鄒婭雪等[27]利用斑馬魚模型研究瓊膠寡糖的抗氧化機制，發現瓊膠寡糖可通過清除體內大量ROS生成和阻止細胞死亡以提高其體內抗氧化功能。先前研究顯示，天然活性多糖中的單糖類小分子可通過還原高度氧化性的自由基，使自由基鏈鎖反應終止，清除自由基，以達到抗氧化的效果[28]。麥麩多糖在體外具有羥基自由基和DPPH自由基清除能力已被證實[29]，這可能是WBP與FWBP具有較強的體內抗氧化能力的原因。

多糖的抗氧化作用機制具有多途徑、多靶點、多效應的特點。研究發現，多糖可通過提高體內主要抗氧化酶的活性，進而提高機體的抗氧化功能[31]。斑馬魚胚胎的氧化應激和抗氧化防御機制與哺乳動物高度相似[32]，本實驗中也發現WBP與FWBP暴露后斑馬魚胚胎抗氧化酶活性顯著升高，表明麥麩多糖也可通過提高斑馬魚胚胎中SOD、CAT、GSH-Px等主要抗氧化酶的活性，進而提高其抗氧化功能。Keap1-Nrf2-ARE信號通路是機體抵抗氧化應激關鍵的防御性轉導通路，研究發現，多糖可以通過Nrf2-ARE通路誘導抗氧化酶基因及蛋白表達增加，從而提高其抗氧化作用[31]。如Sun等[32]研究發現，黃芪多糖可通過調節Keap1/Nrf2-ARE信號通路的表達，提高心肌抗氧化能力，減少氧化應激。本實驗前期研究也發現發酵麥麩阿魏酰低聚糖可提高敵草快誘導的氧化應激大鼠肝臟和回腸Nrf2的 mRNA和蛋白表達水平以及GSH-Px、CAT和SOD mRNA 表達水平，從而提高大鼠的抗氧化功能[21]，但關于WBP與FWBP發揮抗氧化功能的具體機制還有待于進一步研究。

3.3 微生物發酵對麥麩多糖抗氧化活性的影響

微生物發酵法是生物改性法的一種，是指微生物在適宜條件下，將不能令人滿意的底物經過特定的代謝途徑分解或轉化為相容組分的過程，被認為可以修飾天然多糖的結構特征，提高其生物活性[12,33]。本實驗結果顯示，與未發酵麥麩多糖組相比，200 μg/mL的發酵麥麩多糖暴露可顯著降低斑馬魚胚胎ROS產生量、脂質過氧化率和細胞死亡率，提高仔魚的抗氧化能力，同時發酵麥麩多糖組胚胎抗氧化酶活性也顯著升高。表明經微生物發酵后的麥麩多糖其體內抗氧化活性顯著增強。已有研究顯示，多糖的抗氧化活性與其單糖組成、分子質量和鏈構象等結構特征密切相關[34]。Zhang等[35]利用植物乳桿菌NCU116發酵蘆筍的研究發現，蘆筍多糖是由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖和半乳糖醛酸組成，蘆筍經植物乳桿菌NCU116發酵后其單糖組成發生改變，其中鼠李糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸在的比例分別提高了46.70‰、114.09‰、12.75‰，發酵蘆筍多糖中檢測到葡萄糖醛酸，而未檢測到木糖，且發酵后蘆筍多糖分子質量從181.3 ku降低到152.8 ku；且通過DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基清除實驗，發現發酵蘆筍多糖比蘆筍多糖對自由基的清除能力更強。劉燕等[36]利用紅曲菌對燕麥進行固態發酵，發現發酵后燕麥多糖的單糖組成發生顯著變化，甘露糖和半乳糖比例明顯上升，葡萄糖略降低，鼠李糖未檢測到，且發酵后紅曲燕麥多糖清除羥基自由基和ABTS+自由基的能力及抑制淀粉酶活性的能力均高于未發酵燕麥多糖。本實驗前期研究也發現，WBP和FWBP主要由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖組成，與WBP相比，FWBP中葡萄糖的摩爾比降低了65.31%，木糖和阿拉伯糖的摩爾比分別提高了65.79%和78.18%，且檢測到巖藻糖，同時發酵后FWBP(21.19 ku)的分子質量較WBP(52.02 ku)顯著降低[31]。已有研究表明，葡萄糖與半乳糖比值較低的多糖具有較高的抗氧化活性[37]，本實驗前期研究也證明FWBP的葡萄糖/半乳糖比值低于WBP，這可能是發酵后麥麩多糖具有更強的體內抗氧化活性的原因之一。另外多糖的分子質量與其抗氧化活性密切相關，分子質量的降低使其抗氧化能力進一步增強。此外，有研究顯示，富含羥基和糖醛酸的多糖具有更高的抗氧化能力[37,38]，本實驗前期對麥麩多糖進行單糖組成分析也顯示FWBP中的羥基和糖醛酸含量比WBP中的含量高，這也可能是FWBP比WBP具有較高抗氧化功能的原因之一。

4 結論

高質量濃度的WBP和FWBP對斑馬魚胚胎的發育具有一定的毒性作用，主要表現為斑馬魚胚胎心率降低、死亡率提高、孵化率降低和初孵仔魚體長減小。50～200 μg/mL的WBP和FWBP對斑馬魚胚胎發育的影響較小，可顯著降低斑馬魚體內的ROS產生，細胞死亡率和脂質過氧化率，提高斑馬魚胚胎中抗氧化酶的活性，從而提高胚胎的抗氧化能力，且FWBP的體內抗氧化作用明顯優于WBP。本研究結果表明麥麩多糖具有較強的抗氧化功能，發酵處理可提高其抗氧化作用，可以開發作為抗氧化劑。