NLRP3炎癥小體在年齡相關性黃斑變性中的作用

陳露 綜述 謝平 胡仔仲 審校

南京醫科大學第一附屬醫院眼科 210029

陳露現在徐州醫科大學附屬徐州市第一人民醫院眼科 221002

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是一種視網膜退行性疾病，表現為進行性視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞功能失調，引起光感受器細胞死亡，最終導致視覺功能喪失[1]。早期AMD的病理特征為玻璃膜疣和RPE色素異常。晚期AMD有2種臨床表現形式，一種是非新生血管性AMD，也稱為萎縮性、非滲出性或干性AMD，其特征為延伸至黃斑中心凹的地圖樣萎縮(geographic atrophy，GA)；另一種為新生血管性AMD，也稱為滲出性或濕性AMD，其特征為脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)的形成。流行病學研究表明，45歲以上人群中AMD的全球患病率為8.7%，我國50歲以上人口AMD發病率高達10.5%[2-3]。隨著經濟的發展和人口老齡化，預計2040年AMD患者人數將增加至2.88億[2]。AMD嚴重影響患者的生活，并造成巨大的社會負擔。然而目前尚無有效治愈AMD，尤其是干性AMD的方法[4]，因此深入研究AMD的發病機制，探尋治療的新方法已迫在眉睫。目前，AMD的病因和發病機制尚不清楚，研究表明遺傳和環境等多種因素均可導致AMD的發生[5]。與AMD發展相關的炎癥通路已逐漸成為近年來的研究熱點[6-7]。本文就核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3(nucleotide-binding oligomerization domain like receptors 3，NLRP3)炎癥小體及其下游因子與AMD的發病和治療的關系進行綜述，以期為AMD的治療提供新的思路。

1 NLRP3炎癥小體

1.1 NLRP3炎癥小體的結構

核苷酸結合寡聚化結構域NOD樣受體(NOD-like receptors，NLRs)是一組具有共同結構的細胞模式識別受體家族(pattern recognition receptor，PRRs)，包括3個結構域，中央核苷酸結構域介導腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)依賴的自我寡聚化，其C-末端富含亮氨酸重復序列，用以識別配體，N-末端為可變的交互區域，負責與同型蛋白質的交互作用。PRRs可識別宿主來源的危險信號分子(damage-associated molecular patterns，DAMPs)和各種病原體編碼的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，并通過激活核轉錄因子(nuclear factor，NF)-κB、AP-1或IRF轉錄因子參與細胞內信號轉導。作為NLRs成員之一，NLRP3炎癥復合體包含NLRP3蛋白、caspase-1和含caspase募集結構域的凋亡相關顆粒樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC)3個部分。當細胞受到各種危險信號刺激時，NLRP3炎癥小體可通過ASC招募前體caspase-1并使其成熟，進而誘導白細胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-18的成熟和分泌[8]。

1.2 NLRP3炎癥小體的激活

研究表明所有PAMPs和DAMPs通過共同的途徑激活炎癥小體，但其機制尚未完全明確。NLRP3炎癥小體可由多種刺激激活，如細胞死亡引起的細胞外ATP或透明質酸濃度增加、阿爾茨海默病相關的β-淀粉樣蛋白表達增多、細胞外高糖、細胞外滲透壓或pH改變等[9-12]。炎癥小體激活過程的第一步為炎癥小體啟動，需要啟動信號的刺激，由Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)和NF-κB上調NLRP3、IL-1β和IL-18前體的RNA表達水平。而NLRP3寡聚化需要激活信號的刺激，胞外或胞內PAMPs和DAMPs刺激細胞裝配NLRP3炎癥復合體，最終使成熟的IL-1β和IL-18釋放到胞外，此過程包括K+外流增加、Ca2+信號增強、溶酶體失穩定和破裂、活性氧產生等多種途徑(圖1)[13]。除了一般的細胞凋亡，NLRP3炎癥小體同時引發細胞焦亡參與疾病的發生和發展[14-15]。

圖1 NLRP3炎癥小體在RPE細胞中的激活過程 啟動信號通過刺激TLR和NF-κB上調NLRP3、IL-1β和IL-18前體的RNA表達水平，激活信號引起NLRP3寡聚化，裝配NLRP3炎癥復合體，最終使成熟的細胞因子IL-1β和IL-18釋放

1.3 NLRP3炎癥小體在疾病中的作用

NLRP3炎癥小體及其下游信號分子已被證明參與多種疾病的病理過程。β-淀粉樣蛋白是阿爾茲海默病患者老年斑的主要成分，其被證明可以激活小膠質細胞中NLRP3炎癥小體，而NLRP3基因敲除小鼠較普通阿爾茲海默病模型小鼠運動、學習和記憶能力有所改善[16]。動脈粥樣硬化相關危險因素均可誘導巨噬細胞內NLRP3炎癥小體活化，促進IL-1β等炎性因子的釋放，加重炎癥反應[17]。此外，NLRP3炎癥小體也參與2型糖尿病、呼吸道變態反應性疾病、缺血-再灌注疾病、腫瘤等的發生過程[18-19]。青光眼、糖尿病視網膜病變等眼科疾病也被證明與NLRP3炎癥小體相關[20]。

2 NLRP3炎癥小體與AMD

2.1 NLRP3炎癥小體在眼底各細胞中的表達

NLRP3炎癥小體可在RPE細胞、小膠質細胞、Müller細胞、血管內皮細胞等中表達[21]。而在AMD長期的病理過程中，小膠質細胞的活化與視網膜損傷密切相關，提示NLRP3炎癥小體很有可能參與AMD的發生過程[22-24]。本研究團隊通過建立視網膜光損傷模型發現，NLRP3炎癥小體在視網膜小膠質細胞中被激活[25]。而活化的NLRP3炎癥小體誘導產生的IL-1β、IL-18等細胞因子可能主導視網膜結構和功能損傷[26]。此外，通過NLRP3炎癥小體抑制劑Mcc950抑制NLRP3炎癥小體的激活可以緩解RPE細胞死亡及IL-1β分泌[27]。

2.2 NLRP3炎癥小體參與AMD的發生

最初有研究者在GA患者的RPE細胞中發現大量NLRP3炎癥小體、IL-18以及活化的caspase-1和髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)，提出NLRP3炎癥小體可能參與AMD的發生[28]。自此，NLRP3炎癥小體逐漸成為AMD新的研究熱點。AMD玻璃膜疣及其補體蛋白組分可以激活外周骨髓和單核細胞中的NLRP3炎癥小體和caspase-1，進而誘導IL-1β和IL-18的分泌。Doyle等[29]通過羧乙基吡咯處理小鼠建立干性AMD病理學模型發現，視網膜巨噬細胞中存在活化的NLRP3炎癥小體和caspase-1。RPE細胞的氧化應激也可引起NLRP3炎癥小體及下游IL-18、IL-1β的mRNA表達升高[30-31]。此外，RPE細胞內溶酶體失穩定也會引發NLRP3炎癥小體的激活，進而誘導炎性因子IL-1β的釋放[32]。以上研究充分表明NLRP3炎癥小體及其下游的產物可誘導AMD的進展，尤其是干性AMD。

DICER1缺失是引發AMD的另一重要原因。DICER1是一種微小RNA(microRNA，miRNA)加工酶，DICER1缺失可導致Alu RNA序列在RPE細胞中累積，引起視網膜GA改變。細胞中過量的Alu RNA可以激活NLRP3炎癥小體，并通過非TLR途徑激活MyD88產生細胞毒性，引起干性AMD表現[28]。抑制NF-κB及P2X7嘌呤受體可阻斷此過程，P2X7嘌呤受體可以與高濃度ATP結合，打開離子通道，引起K+外流和細胞膜上半通道蛋白小孔形成，使胞外的配體進入細胞質，促進NLRP3炎癥小體的激活[33]。NLRP3炎癥小體的激活可以誘導IL-18釋放，進而激活下游IL-8，造成RPE細胞損傷，導致AMD的發生。另一方面，DICER1缺失可引起下游miRNA調控異常，最終導致RPE細胞損傷[34]。

NLRP3炎癥小體的激活受多種上游成分的調控，玻璃膜疣其他組分也可激活RPE細胞內的NLRP3炎癥小體。β-淀粉樣蛋白1-40可以上調RPE細胞中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-18、NLRP3炎癥小體和caspase-1等炎癥相關因子的mRNA表達。玻璃體內注射β-淀粉樣蛋白1-40可引起玻璃體中IL-1β和IL-18濃度升高，這一過程可能與NADPH氧化酶和線粒體活性氧產生有關[12]。脂褐素成分A2E可以激活NLRP3炎癥小體，誘導RPE細胞產生IL-1β等多種細胞因子和趨化因子，對小膠質細胞也具有激活作用。在ABCA4基因敲除小鼠RPE細胞中存在A2E累積，也可以觀察到IL-1β表達水平升高[35]。

NLRP3炎癥小體已被證明同時參與新生血管性和干性AMD的發生。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)-α的增加可以激活NLRP3炎癥小體，而NLRP3炎癥小體缺乏可以減輕VEGF-α引起的CNV損傷和RPE屏障破壞[36]。隨著研究的持續進展，線粒體DNA、7-酮基膽固醇、細胞外高濃度的氯化鈉、氧化低密度脂蛋白等多種因素均證明可升高NLRP3炎癥小體、caspase-1和下游IL-1β、IL-18蛋白的表達水平，參與AMD的發生[11,31,37-40]。線粒體DNA損傷-環化GMP-AMP合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)-caspase-4角度也同樣證實了NLRP3炎癥小體激活在干性AMD中的作用機制[41-42]。本研究團隊的研究表明，慢性藍光照射可以活化視網膜小膠質細胞，通過胞內NLRP3炎癥小體的組裝和IL-1β的分泌引起感光細胞死亡，導致光誘導的視網膜病變，引發AMD，而趨化因子CCR2基因敲除可使小膠質細胞胞質內活化的NLRP3炎癥小體及其下游因子表達減少，視網膜光損傷緩解[25]。

3 NLRP3炎癥小體下游因子IL-18和IL-1β與AMD

3.1 IL-18和IL-1β的生理作用

IL-1β和IL-18作為IL-1細胞因子家族成員，它們首先被合成為無活性前體，需要經過caspase-1裂解才可以產生成熟的、具有生物活性的細胞因子。IL-1β作為一種經典的炎癥激活劑和調節劑，其異常表達與一系列自身免疫性疾病有關，阻斷IL-1β信號可以起到一定的治療作用。IL-18的作用具有兩面性，在一定的微環境中，IL-18可以響應輔助性T細胞的刺激，被證明與多種炎癥狀態有關[28]。然而另有研究顯示，IL-18在AMD中發揮保護作用[29]。這表明在細胞不同的免疫狀態或炎癥的不同過程中IL-18既可以發揮保護作用，又可以發揮促炎作用。

3.2 IL-18和IL-1β在AMD中的作用

NF-κB和MAPK通路激活產生的IL-1β可以誘導RPE細胞中IL-8和單核細胞趨化蛋白1的表達和分泌[43]。IL-1β長期慢性干預可以增加RPE層的通透性，影響緊密連接蛋白的表達[44]。阻斷IL-1β信號轉導可以顯著減少VEGF-A誘導的AMD模型小鼠中CNV病變的數目[36]，給予IL-1受體拮抗劑anakinra同樣可以降低模型大鼠中激光誘導CNV的面積[45]。IL-1β作為NLRP3炎癥小體的下游信號分子，參與AMD的發生，其可能成為AMD未來的治療靶點。

IL-18在AMD發展過程中的作用較復雜，不同研究得出的結論并不相同。DICER1缺陷引起Alu RNA積累可激活NLRP3炎癥小體，導致人RPE細胞中IL-18分泌增加，中和IL-18可以逆轉RPE細胞變性，提示IL-18是Alu RNA介導RPE細胞毒性的效應分子[28]。然而，有研究顯示IL18-/-小鼠(類似于NLRP3-/-)在激光誘導條件下產生更嚴重的CNV，在小鼠玻璃體內或全身注射IL-18可以減輕激光誘導的CNV，同時對RPE細胞活性及其屏障完整性無明顯影響[46-47]。最近有研究發現，IL-18并不會影響CNV的發展，僅僅會引發干性AMD改變[48]。因此，在靶向炎癥小體進入臨床試驗之前，嚴格評估IL-18或NLRP3炎癥小體是否影響RPE細胞活性和CNV發展至關重要。

4 以NLRP3炎癥小體為靶向的潛在治療策略

4.1 抑制P2X7和NF-κB

研究表明P2X7或NF-κB低表達小鼠經Alu RNA誘導后RPE損傷較輕，提示NF-κB及P2X7嘌呤受體可能成為AMD的治療靶點[33]。核苷類逆轉錄酶抑制劑和丹參酚酸A被發現可以抑制P2X7介導的RPE損傷和GA[49-50]。Liu等[51]研究發現，長春西汀可以通過抑制NF-κB途徑來抑制TNF-α、IL-1β、IL-18等炎性因子的產生，可能作為AMD的潛在治療藥物。

4.2 抑制MyD88

在Alu RNA誘導的RPE損傷過程中，MyD88同時起到激活NLRP3炎癥小體和參與IL-18下游信號轉導的作用，通過IL-1受體相關激酶1/4介導RPE細胞損傷，抑制MyD88可以減輕Alu RNA誘導的視網膜損傷[28]。由此可見，MyD88靶向治療既可以抑制NLRP3炎癥小體生成，又可以影響IL-18的作用。

4.3 抑制IL-18

目前，IL-18對AMD的作用仍存在爭議。Tarallo等[28]認為IL-18的表達增加可能加重早期AMD的發展和GA，但Doyle等[46]研究發現，注射純化的IL-18與抗VEGF治療聯合使用時對新生血管性AMD治療作用更加明顯。雖然不同研究得出的結論不同，但IL-18仍有可能成為AMD的潛在治療靶點。未來需要更多的研究來進一步明確IL-18在AMD，尤其是CNV發展中的作用。

4.4 其他治療策略

有研究將NLRP3炎癥小體激活通路上其他組分作為AMD治療的靶點，包括用PTX3結合補體因子H、格爾德霉素和齊多夫定阻止NLRP3炎癥小體激活，花青素3-葡萄糖苷抑制4-羥基己烯醛對NLRP3炎癥小體的激活，人肝臟X受體抑制β-淀粉樣蛋白對NLRP3炎癥小體的激活等[52-56]。

5 小結與展望

NLRP3炎癥小體與AMD發生的相關性逐漸得到驗證，但其具體作用機制仍未十分明確。正是由于NLRP3炎癥小體及其下游因子作用機制復雜使得針對其的靶向治療及藥物研發趨于困難。目前臨床上濕性AMD的治療主要為抗VEGF藥物，但其價格昂貴，而對于干性AMD臨床上至今尚無有效的應對措施。因此，需要繼續致力于NLRP3炎癥小體的研究，未來需更深入探討NLRP3炎癥小體信號通路在AMD發生和發展中的主要作用靶點。隨著其作用機制的逐步揭開，針對NLRP3炎癥小體的治療將在未來發揮越來越重要的作用。NLRP3炎癥小體有望為AMD特別是干性AMD的防治提供新的關鍵作用靶點和治療措施。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突