炮制對硫熏白芍飲片檢控指標的影響

丁 妍，孔 銘，徐亞運，李松林

0 引 言

硫磺熏蒸是中藥材常用加工方法，然而，過度硫熏會導致藥材SO2等有害殘留物增加[1-2]，主要活性成分轉化，生成含硫衍生物[3-5]，藥效降低，存在安全隱患[6-7]。因此國內外以SO2殘留量為檢控指標用于控制硫熏藥材質量，其中現版《中國藥典》規定白芍等10味中藥材及其飲片SO2殘留量不得超過400 mg/kg[8]。白芍為毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPal1.)的干燥根，臨床常用大宗藥材，也是傳統采用硫熏加工的藥材。白芍的有效成分主要為芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥內酯苷等，統稱為白芍總苷(TGP)，其作為聯合用藥和輔助用藥，可增強其他藥物的療效[9]。中藥飲片是臨床方劑和中成藥的重要原料，其質量直接影響中醫臨床療效。飲片經過不同炮制加工過程，不論外觀性狀還是內在品質、藥性與藥材相比均發生了明顯變化。前期研究發現《中國藥典》SO2殘留測定方法在測定硫熏白芍藥材時存在假陰性和限量不客觀的不足[10]，而白芍硫熏特征衍生物的限量檢查可作為硫熏白芍藥材檢控的有效補充[11-13]，但硫熏特征衍生物結合SO2殘留能否作為硫熏白芍飲片的檢控指標有待深入研究加以科學評估。本研究選擇《中國藥典》收載的白芍飲片法定品種炒白芍、酒白芍為研究對象，考察不同炮制方法對硫熏飲片SO2殘留量、硫熏特征標志物及主要活性成分含量的影響，為硫熏白芍飲片檢控指標的選擇提供科學數據。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料Waters 2695高效液相色譜儀(美國Waters)；Waters 2996紫外檢測器(美國Waters)；METTLER 萬分之一及百萬分之一電子天平(瑞士梅特勒公司)；KQ-250E型醫用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Millipore Milli-Q 超純水制備儀(美國Millipore公司)。

對照品沒食子酸(購自中國食品藥品檢定研究院，批號110831-201605，純度>98%)；磺酸化芍藥苷自制，純度>98 %；芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酸(成都普菲德生物科技股份有限公司，批號分別為140518、PS000826、140807，純度均>98%)；五沒食子酰葡萄糖(四川省維克奇生物科技有限公司，批號為140611，純度>98%)；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

生白芍飲片(批號150921)購自亳州市萬珍中藥飲片公司，經李松林研究員鑒定為毛莨科植物芍藥PaeoniaLactifloraPall.干燥根的切制干燥飲片。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備①硫熏白芍飲片制備：取未硫熏白芍飲片400 g，加水40 mL，放置在自制硫熏裝置中，硫磺用量10 g/h，熏制2 h，取出，于50 ℃鼓風干燥后，室外晾曬15 d，即為硫熏白芍飲片[12]。②炒白芍和炒硫熏白芍飲片制備：取未硫熏白芍飲片和自制硫熏白芍飲片200 g，置炒制容器內，文火炒制18 min，至斷面呈微黃色，偶有焦斑為止[14]，各平行制備2份。③酒白芍和酒硫熏白芍飲片制備：取未硫熏白芍飲片和自制硫熏白芍飲片200 g，置于托盤容器內，加入黃酒20 g，然后平鋪開來，密閉2 h。取出，放于炒至容器內，用文火炒制23 min，斷面呈黃色，偶有焦斑，有酒香氣[14]，即得酒炙硫熏白芍飲片樣品，平行制備2份。

1.2.2 硫熏特征衍生物和活性成分的含量測定采用HPLC法測定硫熏特征衍生物及芍藥苷、芍藥內酯苷、沒食子酸、五沒食子酰葡萄糖、苯甲酸5種活性成分含量。

色譜條件：根據文獻報道確定色譜條件[11]，Altima C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動相A為乙腈，流動相B為0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫(0～20 min，5%→10%A；20～40 min，10%→20%A；40～90 min，20%→30% A)；流速1.0 mL/min；檢測波長230 nm；柱溫35 ℃；進樣體積20 μL。

混合對照品溶液的制備：精密稱取沒食子酸、磺酸化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酸、五沒食子酰葡萄糖對照品適量，加甲醇制備成0.061、0.176、0.152、1.133、0.012、0.099 mg/mL的混合對照品溶液。

供試品溶液的制備：取白芍飲片粉末0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇溶液50 mL，超聲提取(250 W，50 kHz)30 min，用50%乙醇補足溶液，靜置，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾上清液[11]，即得炒白芍、炒硫熏白芍、酒白芍和酒硫熏白芍供試品溶液。

1.2.3 SO2殘留量測定采用《中國藥典》2015年版(四部)“二氧化硫殘留量測定法(酸堿滴定法)”測定硫熏白芍飲片[14]，炒硫熏白芍飲片及酒硫熏白芍飲片的SO2殘留量。

2 結 果

2.1 HPLC法測定硫熏特征衍生物和活性成分的含量HPLC色譜圖見圖1。硫熏特征衍生物及芍藥苷、芍藥內酯苷、沒食子酸、五沒食子酰葡萄糖、苯甲酸5種活性成分測定結果顯示，炒硫熏白芍中芍藥苷含量略低于炒白芍，分別為28.00 mg/g和30.18 mg/g。白芍飲片硫熏后活性成分轉化，產生磺酸化芍藥苷，含量為3.93 mg/g，而經炒制和酒炙后，磺酸化芍藥苷含量分別為3.99 mg/g、3.92 mg/g，含量未見明顯變化。見圖2。

1:沒食子酸; 2:磺酸化芍藥苷; 3:芍藥內酯苷; 4:芍藥苷; 5:苯甲酸; 6:五沒食子酰葡萄糖

圖2 不同白芍飲片中硫熏特征衍生物和活性成分的含量

2.2 SO2殘留量測定法測定白芍不同炮制品中SO2含量結果硫熏白芍飲片、炒硫熏白芍飲片及酒硫熏白芍飲片的SO2殘留量測定結果顯示，白芍飲片經硫熏后SO2殘留顯著增加，本實驗中白芍飲片熏蒸2 h后，SO2殘留量達861.08 mg/kg，遠遠超過了《中國藥典》規定的400 mg/kg的限量標準，應判為不合格白芍飲片。然而經炒制后，SO2殘留量明顯降低，測得量為323.59 mg/kg，降低了62.42%，按《中國藥典》炒白芍的SO2殘留量限量要求，則屬于合格飲片。同樣，硫熏白芍酒炙后，SO2殘留殘留量為364.46 mg/kg，降低了57.67%，也可判斷為合格飲片。見圖3。

圖3 硫熏白芍飲片SO2殘留量

3 討 論

3.1 炮制對硫熏白芍飲片SO2殘留量的影響本研究表明，炮制可降低硫熏白芍SO2殘留量，但不能完全去除SO2殘留，不合格的硫熏飲片經炮制后可使SO2殘留達到飲片標準。因此，SO2殘留無法體現飲片實際的硫熏程度，單一的SO2檢控指標對硫熏飲片的檢控可能存在不足。

3.2 炮制對硫熏白芍飲片含硫衍生物的影響白芍飲片硫熏后活性成分轉化，產生磺酸化芍藥苷，而經炒制和酒炙后，含量未見明顯變化，表明炮制過程對硫熏白芍特征衍生物影響較小。研究顯示白芍藥材中磺酸化芍藥苷的含量與硫熏程度呈正相關[13]，是白芍藥材硫熏程度的真實反映。因此，我們認為磺酸化芍藥苷同樣真實反映了白芍飲片的硫熏程度，可作為白芍飲片的硫熏檢控指標。

3.3 炮制對硫熏白芍飲片整體質量的影響未硫熏白芍飲片炒制后，芍藥苷和五沒食子酰葡萄糖含量稍有下降，苯甲酸含量升高，化合物總量降低；而酒炙后，沒食子酸、氧化芍藥苷，芍藥苷和五沒食子酰葡萄糖含量則均有所增加，化合物總量增加。炒硫熏白芍相比于炒白芍，化合物總量增加，化學成分組成及比例明顯改變；酒硫熏白芍相比于酒白芍，與炒硫熏白芍相比于炒白芍含量變化趨勢相同。硫熏白芍飲片炮制前后與未硫熏白芍飲片炮制前后含量變化趨勢相同，炒制后化合物總量略有下降，而酒炙后化合物總量略有升高，但差異無統計學意義?？傊?，白芍炮制前后化合物整體質量變化較小，硫熏導致的化學成分轉化是導致飲片質量改變的主要因素。

3.4 硫熏白芍飲片安全性檢控指標評估研究發現白芍硫熏后化學成分改變，且已在硫熏白芍中發現6個含硫衍生物[15]，同時硫熏導致白芍活性和體內吸收代謝改變，存在腎毒性的隱患[16]，需加強對硫熏白芍的質量控制。當前單一的SO2殘留指標在檢控硫熏白芍藥材存在不足。綜合本研究結果發現，炮制可降低飲片SO2殘留量，但磺酸化芍藥苷受炮制影響較小。單一SO2殘留指標不能客觀體現硫熏白芍飲片內在質量變化，磺酸化芍藥苷可直接反映硫熏白芍飲片內在質量，因此，SO2殘留量結合磺酸化芍藥苷可以作為硫熏白芍飲片的安全性檢控指標。