一株重金屬鎘耐受小球藻的分離鑒定及其生長條件優化

李啟虔, 盧福芝, 覃勇榮

一株重金屬鎘耐受小球藻的分離鑒定及其生長條件優化

李啟虔1,2,3, 盧福芝1,2, 覃勇榮1,*

1. 河池學院化學院生物工程學院, 河池 546300 2. 廣西高校微生物與植物資源開發利用重點實驗室, 河池 546300 3. 河池學院農業生物技術應用研究中心, 河池 546300

以龍江河鎘污染水體預留樣本為實驗材料, 從中篩選得到一株重金屬鎘耐受藻株, 經形態和分子生物學鑒定為小球藻屬, 命名為sp. LQQ-1。實驗從溫度、pH、Cd2+、有機碳源及有機氮源等方面對該藻株生長條件進行優化, 并考察其在最佳生長條件下對水體中Cd2+的去除效果。結果表明: 該小球藻最適宜生長溫度為30℃, 最適宜pH為7.0左右。Cd2+在低濃度下能促進小球藻的生長, 當Cd2+濃度超過30 μmol·L-1時, 小球藻的生長受到抑制。適宜該小球藻生長的最佳葡萄糖添加濃度為10g·L-1, 最佳尿素添加濃度為1g·L-1。在最佳生長條件下, 該小球藻對水體中Cd2+的去除率達89.7 %。

小球藻; 重金屬耐受藻株; 鎘; 分離鑒定

0 前言

水體重金屬污染是一類在全球范圍內普遍存在的環境問題, 工業活動釋放到環境中的重金屬離子經過各種途徑遷移到水體后, 在威脅人類健康的同時也給水體生態系統的安全帶來嚴重風險[1]。鎘作為一種典型的水體重金屬污染物, 曾先后于廣東北江、湖南湘江及廣西龍江河等多處爆發水體污染事件[2], 并普遍存在于長江水系、珠江下游和北江中上游河段的表層沉積物中, 引發學者們的廣泛重視[3-4]。利用微生物修復重金屬污染作為一種高效、安全、低耗的手段, 在水體重金屬污染修復中發揮著重要作用[5]。目前報道的重金屬污染微生物修復技術, 大多集中在使用細菌、真菌作為生物吸附材料對環境中的重金屬進行富集。然而對于微藻, 特別是淡水水體中的微藻, 去除重金屬離子的研究非常有限[6]。由纖維狀結構和各種多糖形成的無定形膠質組成的藻類細胞壁, 表面富含如氨基、硫酸鹽和羧基之類的能吸引并結合重金屬離子的功能基團, 是吸附重金屬的天然優良載體[7]。同時, 微藻具有生長速度快、生長代謝活躍、吸附作用強等特點, 在水體重金屬離子的吸附和富集方面具有天然優勢,是一類極具潛力的生物修復材料[8]。

在利用微藻生物修復重金屬水體的應用過程中, 選育重金屬耐受能力優良的藻種是我們面臨的首要問題。本研究從曾遭受鎘污染侵害的龍江河預留水體樣本中篩選分離得到一株鎘耐受藻株, 對其進行分子生物學鑒定并優化生長條件, 研究最佳生長條件下該藻株對水體中鎘離子的去除效果, 以期為鎘污染水體的生物修復應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 培養基[9]

采用BG-11液體培養基進行培養, 調節pH至7.0, 121 ℃滅菌20 min后使用。藻株篩選采用BG-11固體培養基, 即在BG-11液體培養基的基礎上, 每1000 mL加入20g瓊脂, 高壓滅菌后于超凈工作臺中冷卻至60 ℃左右加入氨芐西林至0.05 g·L-1, 用以殺滅細菌, 純化藻株。

1.2 藻類的富集、分離和純化

水體樣品為2012年龍江河鎘污染時期收集的河水預留樣本(Cd2+濃度1.7 μmol·L-1, 50 L), 于同年進行分離純化實驗。具體純化方法如下所述, 用絹篩去大型浮游生物和雜質后, 轉移10 mL水樣至Cd2+濃度為20 μmol·L-1的BG-11液體培養基中。放入30 °C、6000 lx、光暗周期為14 h亮/10 h暗的光照培養箱中富集培養一周, 每天搖動兩次, 并進行觀察。待培養液變綠, 于超凈工作臺中將培養液逐級稀釋后, 移取100 μL均勻涂布至滅菌后的BG-11固體培養基, 放回光照培養箱中繼續培養。待平板上長出單個藻落, 挑取單個的綠色斑點接種到100 mL已滅菌的BG-11液體培養液中進行擴大培養。顯微鏡鏡檢確認無其它藻株即得到單種藻。

1.3 藻種的鑒定

1.3.1 形態學觀察

采用的奧林巴斯BX-51顯微鏡, 放大倍數為400倍, 對分離得到的藻株進行形態觀察, 通過《中國淡水藻志》進行比對, 初步判斷其種屬。

1.3.2 分子生物學鑒定

將分離得到的藻株擴大培養7天后, 將培養液于4 ℃, 10000 r·min-1, 冷凍離心5 min, 棄上清液, 收集藻體。采用植物基因組DNA快速抽提試劑盒(上海生工)提取所得藻體總DNA。利用18S rDNA 序列分析鑒定經分離純化所得藻株的種屬。PCR 擴增引物為18S-F: 5′-ACCTGGTTGATCCTG CCAGT-3′, 18S-R: 5′-TCACCTACGGAAACCTT GT-3′[10]。以藻株基因組DNA為模板進行PCR擴增。 PCR體系(25 μL)為: 上下游引物各1 μL、DNA模板0.5 μL、ddH2O 10 μL、Taq DNA聚合酶12.5 μL。PCR反應條件為: 95 ℃預變性5 min; 95 ℃變性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸40 s, 30個循環, 最后72 ℃延伸10 min?；驍U增的產物經純化后由上海美吉生物公司測序, 所得序列通過GenBank中其它藻種的18S rDNA序列數據進行比對分析, 采用MEGA7. 1軟件的NJ (Neighbor-Jointin) 法構建系統發育樹。

1.4 小球藻生長條件優化

1.4.1 生長曲線的測定

將小球藻接種于100 mL 的BG-11液體培養基中, 在15 d周期里, 間隔24 h取樣1 mL, 細胞計數觀測藻細胞的生長情況, 繪制生長曲線。后續實驗均采用對數生長期藻種進行接種, 初始接種濃度為 2.0×105個·mL-1。

1.4.2 pH對小球藻生長的影響

將小球藻接種于50 mL的pH為: 4、5、6、7、8、9的BG-11液體培養基內, 每個處理設置三個平行, 培養7 d后, 細胞計數觀測藻細胞密度變化情況, 考察pH對小球藻生長情況的影響。

1.4.3 溫度對小球藻生長的影響

將小球藻接種至50 mL pH為6的BG-11液體培養基內, 分別放置于溫度為20 ℃, 25 ℃, 30 ℃和35 ℃的光照培養箱內, 每個處理設置三個平行, 培養7 d后, 細胞計數觀測藻細胞密度變化情況, 考察培養溫度對小球藻生長情況的影響。

1.4.4 有機碳源對小球藻生長的影響

將小球藻接種至50 mL含葡萄糖濃度梯度為0 g·L-1、10 g·L-1、20 g·L-1、30 g·L-1的BG-11培養基內, 每個處理設置三個平行, 培養7 d后, 細胞計數觀測藻細胞密度變化情況, 考察有機碳源對小球藻生長情況的影響。

總之，在高中語文教學過程中關注生命體驗，不僅體現了語文學科的人文性特點，而且有助于學生形成正確的生命價值觀。語文教師應將生命體驗不斷地滲透教學過程中，培養學生的生命情懷，這樣既可以讓他們學到知識，實現既定的教學目標，也能讓他們學會認識生命的價值，獲得生命的成長，不斷向著理想的人生進發。

1.4.5 有機氮源對小球藻生長的影響

將小球藻接種至50 mL含尿素濃度梯度為0 g·L-1、0.5 g·L-1、1.0 g·L-1、1.5 g·L-1的BG-11培養基內, 每個處理設置三個平行, 培養7d后, 細胞計數觀測藻細胞密度變化情況, 考察有機氮源對小球藻生長情況的影響。

1.4.6 鎘濃度對小球藻生長情況的影響

將小球藻接種至50 mL含Cd2+濃度梯度為: 10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、30 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、250 μmol·L-1的BG-11培養基內, 每個處理設置三個平行, 在7 d周期里, 間隔每24 h取樣1 mL, 通過血球計數板進行細胞計數, 觀測藻細胞的生長情況, 繪制生長曲線并根據下面公式計算比生長速率(μ)[11-12]。

=(lnNt–lnN0)/(t–t0)

式中μ為sp. LQQ-1比生長速率, d-1; N0與Nt分別為初始時刻t0和t時刻藻細胞濃度, 個細胞·mL-1。

1.5 小球藻對重金屬鎘的富集能力測定

2 結果與分析

2.1 藻種的鑒定

分離出的單株藻在光學顯微鏡下觀察細胞形態為圓球形綠色單細胞, 細胞壁平滑, 直徑3—5 μm, 胞內存在色素體(圖1), 初步鑒定為小球藻。經18S rDNA擴增, PCR產物大小為1619 bp, 測序并與NCBI數據庫中已有的微藻18S rDNA序列比對構建系統進化樹(圖2)。結果顯示, 該藻種與浮水小球藻(, FR865661.1)的距離最近, 其序列相似度為99.8%。顯微觀察和分子鑒定的結果均表明該藻株為小球藻屬, 命名為sp. LQQ-1。測序數據已提交至Genbank, 并獲得登記號為MN688878。

圖1 分離純化的小球藻(A:小球藻的液體培養; B: 小球藻在光學顯微鏡下的形態特征)

Figure 1 Purified(A: Liquid culture of purified; B: Morphological characteristic of thewas observed by microscope)

圖2 基于18S rDNA基因序列構建的Chlorella sp. LQQ-1的進化樹

Figure 2 Phylogenetic tree ofsp. LQQ-1 based on 18S rDNA

2.2 小球藻生長特性研究

2.2.1 小球藻生長曲線

由圖3可見, 該小球藻在接種前兩天內處于延遲期, 在2—6天處于對數生長期, 7—12天處于穩定期, 12天之后, 小球藻進入衰亡期。

2.2.2 小球藻生長條件優化

本研究通過單因素實驗, 從pH、生長溫度、有機碳源和有機氮源四方面對小球藻的生長進行了優化。由圖4A可知, 小球藻的生長, 在強酸性環境下受到明顯的抑制。隨著pH值的增大, 小球藻的細胞濃度也相應增加。該藻株較適宜在pH 6—7范圍內生長。由圖4B可知, 當溫度低于30 ℃時, 溫度和小球藻細胞密度存在顯著性差異 (< 0.05) , 溫度與小球藻生長呈正相關性。繼續提高培養溫度, 小球藻細胞密度隨著溫度的增加開始下降。說明小球藻的最適生長溫度在30 ℃附近。小球藻既可以利用光能自養又可以利用有機碳源進行生長繁殖[13]。采用異養和兼養培養模式能有效提高小球藻的藻細胞密度并縮短培養時間[14]。本實驗通過添加有機碳源葡萄糖對小球藻的生長條件進行優化。由圖4C可見, 葡萄糖的添加, 在一定程度上可以促進小球藻的生長。實驗結果表明, 以添加質量濃度為10 g·L-1葡萄糖促進生長的效果最佳, 高于此濃度, 其促生效果不再提高。由圖4D可知, 尿素對小球藻的生長起到積極作用, 以添加質量濃度為1 g·L-1尿素的促生效果最佳。繼續增大尿素濃度, 反而會抑制小球藻的生長。這可能與小球藻對尿素的利用方式有關, 浮游生物通過脲酶將尿素經分解成NH4+和H2CO3[15], 而過高的銨鹽可能會起解偶聯作用, 降低小球藻類囊體薄膜兩側的pH差, 影響ATP的合成, 從而抑制小球藻的生長[16]。

圖3 小球藻生長曲線

Figure 3 The growth curve ofsp. LQQ-1

2.2.6 Cd2+濃度對小球藻生長的影響

由圖5可見, 在低濃度范圍內, Cd2+濃度的增加一定程度上促進了小球藻的生長, 在Cd2+濃度為30 μmol·L-1的處理組中培養7d后, 小球藻細胞密度最高, 達5.9×106個·mL-1。隨著Cd2+濃度的進一步增大, 小球藻的細胞密度顯著下降。在Cd2+濃度為250 μmol·L-1的處理組中培養7 d后, 小球藻細胞密度僅有9.8×105個·mL-1。小球藻比生長速率的變化也呈現出相同趨勢(圖6)。在低濃度Cd2+脅迫下, 小球藻比生長速率隨著濃度的增大而增加, 當Cd2+濃度為30 μmol·L-1時, 小球藻的繁殖速度最快, 第二天達到最大值0.96 d-1。繼續增大Cd2+濃度, 小球藻的比生長速率開始降低, 且達到最大值的時間也逐漸增長。在Cd2+濃度為250 μmol·L-1的處理組中, 小球藻比生長速率在第三天達到最高值0.39 d-1。說明在高濃度Cd2+脅迫下, 小球藻雖然能存活, 但其生長繁殖受到一定的抑制。維持小球藻sp. LQQ-1生長的最佳Cd2+濃度為30 μmol·L-1。

圖4 小球藻生長條件優化 (A: pH; B: 溫度; C: 葡萄糖濃度; D: 尿素濃度)

Figure 4 Optimization of the growth conditions ofsp. LQQ-1 (A: pH; B: temperature; C: glucose concentration; D: urea concentration)

圖5 不同濃度重金屬Cd2 +處理下小球藻的細胞密度變化

Figure 5 Change of cell density ofsp. LQQ-1 grown in different concentration of Cd2+

2.3 小球藻對重金屬的富集作用

由圖7可見, 小球藻對溶液中Cd2+的去除效果, 與培養時間呈正相關性, 主要集中在前三天, 且明顯受到初始Cd2+濃度的影響。在低鎘濃度處理組(Cd2+初始濃度為30 μmol·L-1)中, 3天后水體中鎘離子的殘留率為20.4 %, 隨著水體中的金屬鎘濃度轉移到小球藻細胞壁上, 小球藻的吸附速率也開始減慢, 7天后水體中鎘離子的殘留率為10.3 %。但在高鎘濃度處理組(Cd2+初始濃度為100 μmol·L-1)中, 重金屬的去除效果顯著降低, 3天后水體中仍然有71.5 %鎘離子殘留, 至7天趨于飽和時, 水體中鎘離子的殘留率為60.7 %。

圖6 不同濃度對小球藻的比生長速率的影響

Figure 6 Change of relative growth rate ofsp. LQQ-1 grown in different concentration of Cd2+

圖7 小球藻對Cd2+的去除效果

Figure 7 Removal efficiency of Cd2+bysp. LQQ-1

3 討論

藻類廣泛分布于海水和淡水環境, 是地球上最大的初級生產者群體。其纖維網狀結構的細胞壁表面存在大量合理排列的陰離子基團能有效的富集重金屬[17]。此外, 活體微藻還可以通過生物代謝的方式將重金屬離子吸收富集至細胞內部[18]。因此, 微藻是一種極具潛力的重金屬生物修復材料, 發掘對重金屬生物吸附能力強的優質藻種資源, 開發相應的生物修復技術, 具有廣闊的應用前景。

小球藻作為淡水水體中微藻群落的常見優勢種, 在水產養殖、維持水體微藻群落結構穩定和水體去營養化方面發揮著重要作用[19]。然而, 對于小球藻吸附處理水體重金屬的研究還鮮有報道。葸玉琴[20]等在研究普通小球藻對不同濃度鎘脅迫的生長生理響應時發現小球藻在40 μmol·L-1Cd2+濃度下, 會出現大量死亡現象。本研究涉及到的小球藻sp. LQQ-1于250 μmol·L-1Cd2+濃度下, 仍能維持一定的生長, 且低濃度的Cd2+對該藻株生長起到促進作用, 說明該小球藻對重金屬鎘耐受能力出色, 存在良好的重金屬污染水體修復潛力。本研究中小球藻的比生長速率隨著Cd2+濃度的增加呈先增后降的趨勢, Hormesis效應[21]較好的解釋了這一現象, 小球藻在低濃度的Cd2+刺激下, 產生了毒性興奮效應, 提高了繁殖能力, 而高濃度的Cd2+抑制了小球藻的正常生理代謝活動使得生長變得遲緩[22]。

微藻對重金屬的去除動力學分為被動吸附和主動運輸兩個階段[23]。被動吸附發生在細胞表面, 重金屬通過靜電相互作用力被小球藻細胞表面官能團快速吸附或絡合, 在此階段Cd2+的去除率與小球藻的生物量有直接的關系, 當小球藻的生物量相對于溶液中Cd2+達到平衡, 水體中鎘的去除效果亦不再增加。在主動運輸階段, 重金屬離子穿過細胞膜屏障, 被胞內金屬螯合蛋白捕捉固定, 于細胞體內富集, 過程要緩慢得多?；铙w水藻去除水體重金屬離子的過程中, 被動擴散與主動運輸同時存在。實驗結果表明, Cd2+的去除率和小球藻的生長存在正相關性(< 0.05)。前三天小球藻對重金屬的去除率增加顯著, 說明在初始階段小球藻對水體中鎘的去除過程中被動擴散起到主要貢獻; 三天后重金屬的去除率增長明顯放緩, 表明細胞壁表面的金屬離子趨于飽和, 此時主動運輸成為水體中鎘去除的主要因素, 吸附在細胞表面的Cd2+以主動運輸的方式進入胞內, 與胞內的金屬螯合肽結合, 送至液泡儲存, 進一步提高水體重金屬去除能力。本研究表明, 小球藻對水體中重金屬的去除效果受到初始Cd2+濃度的顯著影響。這是由于小球藻對重金屬的吸附與其生物量呈正相關關系, 高濃度Cd2+使小球藻的生長受到抑制, 所以影響到水體中Cd2+的去除率。在最適宜小球藻生長的Cd2+濃度下(30 μmol·L-1), 接種一周后, Cd2+去除率達到89.7 %, 此結果接近已報道的高效重金屬吸附微藻[18,22]。表明在優化條件下, 該藻株對水體中的Cd2+具有良好的去除能力, 在重金屬污染水體的修復中存在一定的應用潛力。

4 結論與展望

本研究篩選得到的小球藻sp. LQQ-1能在Cd2+污染水體中正常生長。通過培養條件優化后, 該藻株對水體中的Cd2+表現出良好的去除能力。后續工作應以此抗性藻株作為研究材料, 一方面對其去除和吸附重金屬的機理以及相關動力學吸附解吸模型進行研究; 另一方面還需繼續探索開發與水藻生物修復相適應的聯合修復手段, 如固定化包埋、菌藻共生等技術, 進一步增強水藻在重金屬修復方面的應用潛力。

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Isolation and identification of a cadmium-resistantstrain and optimization of its growth conditions

LI Qiqian1,2,3, LU Fuzhi1,2, QIN Yongrong1,*

1.College of Chemical and Biological Engineering, Hechi University, Hechi 546300, China 2.Guangxi Colleges Universities Key Laboratary of Exploitation and Utilization of Microbial and Botanical Resources, Hechi 546300, China 3. Application and Research Center of Agricultural Biotechnology of Hechi University, Hechi 546300, China

A cadmium-resistant algal strain was isolated and purified from the reserved samples of Longjiang River polluted by cadmium. The alga was identified as aspecies by morphological and molecular biological methods, and namedsp. LQQ-1. The growth conditions (temperature, pH, Cd2+, organic carbon source and organic nitrogen source) ofsp. LQQ-1 were optimized, and the removal effect of Cd2+under optimal growth conditions was also investigated. The results showed that the most suitable growth temperature of this alga was 30 ℃, and the optimum pH was 7.0. Although the growth ofsp. LQQ-1was promoted by low concentrations of Cd2+, it was inhibited while the concentration of Cd2+was exceeded 30 μmol·L-1. Additionally, the optimum concentration of glucose and urea for thegrowth were 10 g·L-1and 1 g·L-1, respectively. Under the optimal growing conditions, the removal rate of Cd2+bysp. LQQ-1 was almost 89.7 %.

; heavy metal tolerant algae; cadmium; isolation and identification

10.14108/j.cnki.1008-8873.2022.01.007

李啟虔, 盧福芝, 覃勇榮. 一株重金屬鎘耐受小球藻的分離鑒定及其生長條件優化[J]. 生態科學, 2022, 41(1): 59–65.

LI Qiqian, LU Fuzhi, QIN Yongrong. Isolation and identification of a cadmium-resistantstrainand optimization of its growth conditions[J]. Ecological Science, 2022, 41(1): 59–65.

X171

A

1008-8873(2022)01-059-07

2020-05-19;

2020-08-16

國家自然科學基金項目(31660017); 廣西高校微生物及植物資源開發利用重點實驗室開放課題(2015HL001); 河池學院青年基金科研項目(2013A-N005)

李啟虔(1986—), 男, 博士, 副教授, 主要從事重金屬污染修復研究, E-mail: qiqianli@hcnu.edu.cn

覃勇榮(1963—),男, 碩士, 教授, 主要從事石漠化生態恢復研究, E-mail: hcxyqyr@126.com