雙酚A對合果芋葉片氣體交換參數、葉綠素熒光參數和氧化損傷的影響

劉夢，董欣越，楊愛珍，黃艷虹，高凡，郭家選

農業農村部華北都市農業重點實驗室/北京農學院資源與環境系，北京 102206

雙酚A(2,2-二(4-羥基苯基)丙烷，bisphenol A，BPA)，通常用于合成環氧樹脂、酚類樹脂和聚碳酸酯等工業產品[1]，同時BPA具有內分泌干擾特性，可能會威脅胎兒和兒童的健康[2]。近年來，隨著BPA生產以及使用量的增加，其在環境中的直接或間接排放也隨之增加。BPA已成為一種全球性的環境污染物，在環境、食品、人體血液和尿液等不同基質中被廣泛檢出[3-6]，歐洲和韓國土壤中BPA濃度分別高達140 μg·kg-1和48.68 μg·kg-1[7]；日本垃圾填埋場滲濾液中的BPA濃度高達17.2 mg·L-1[8]。環境中BPA的污染修復方法主要有物理法、化學法和生物法等，其中物理、化學法運轉費用高昂[9]，并可能產生二次污染，對生態系統健康產生進一步的破壞，而植物修復技術屬于原位修復技術，其維護成本低、操作簡單、二次污染易于控制，具有良好的生態環境效益[10-11]。隋春曉和王琳[12]在人工濕地實際應用中發現，香蒲床濕地對BPA的去除率在74%～96%之間，蘆葦床濕地對BPA的去除率基本維持在70%～83%。植物修復技術主要是利用自然生長植物根系(或莖葉)吸收、富集、降解或者固定污染土壤、水體和大氣中的污染物，達到凈化環境污染物的目的。然而，植物在吸收、富集污染物的生物過程中，污染物的毒性可能會影響到植物的生長發育。已有研究表明光合作用的改變是環境污染物影響植物生長發育的關鍵性因素[13]，而植物葉片氧化損傷與其解毒能力密切相關[14-15]。因此，研究BPA對植物葉片氣體交換參數、葉綠素熒光參數和氧化損傷的影響對于科學評價BPA脅迫下植物耐受和富集能力非常重要。

目前關于BPA對植物光合生理影響的研究主要集中在水稻、玉米和大豆等糧食作物[13, 16-17]，而對污染修復植物鮮見報道[18]。合果芋(SyngoniumpodophyllumSchott)，是天南星科代表性景觀葉植物，環境適應能力強[19]，具有較強的耐污和去污能力，對甲醛、苯的吸收效果十分顯著，是一種理想的富集植物[20-21]。王艷英等[22]發現合果芋等植物對城市河道的化學需氧量(COD)、氨氮和磷都有較好的降解效果。檀笑等[23]發現合果芋是一種具備去碳、脫氧、除磷和積累重金屬的高效修復植物，在有機物和重金屬復合污染水體的修復中應用潛力較大。因此，合果芋也可能是一種對BPA污染具有較強耐受和富集能力的植物。然而，目前關于合果芋對BPA的耐受和富集能力，以及BPA對其葉片光合生理和氧化損傷的影響研究還非常缺乏[24]?；诖?，本文以合果芋為研究對象，研究BPA對合果芋葉片氣體交換參數、葉綠素熒光參數和氧化損傷的影響，以期為BPA污染的植物修復提供基礎實驗數據與參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗材料

試驗于2021年3—4月在北京農學院科技園區進行。試驗所用BPA購自北京酷來搏科技有限公司，BPA試劑配制以甲醇(色譜純，北京邁瑞達科技有限公司)為助溶劑。供試材料白蝶合果芋幼苗購自廣西欽州合果芋生產基地，隨后在人工氣候室中蒸餾水培養1個月，控制生長環境晝夜溫度為25 ℃/15 ℃，光暗時間為12 h/12 h，空氣相對濕度為60%。采用水培試驗，塑料水培箱體積為10 L，尺寸為380 mm×280 mm×140 mm。

1.2 試驗設計

為了分析BPA對合果芋葉片氣體交換參數、葉綠素熒光參數和氧化損傷的影響，選擇株高約為40 cm、具有5～6片功能葉、莖稈粗細和根系等長勢一致的合果芋144株，使用0.5% NaClO溶液消毒20 min，蒸餾水清洗3～5次后種植于水培箱中，內裝1/2強度Hoagland營養液，用穿孔塑料板固定，封蓋。營養液預培養7 d后，分別加入0.0、10.0、30.0和50.0 mg·L-1(濃度選擇基于世界各地環境中的BPA污染水平、其他植物的BPA毒性研究以及前期預試驗數據)的BPA進行脅迫處理，共計4個處理水平；每個處理3個平行水培箱，每個平行水培箱種植12株，種植行距為60～80 mm。在BPA添加后的第0、1、3、5、7、10天隨機選取每個平行水培箱中植株的完全舒展葉(從頂端起向下取其完全展開的葉子)數片混勻，用液氮速凍且儲藏于-80 ℃冰箱內。

1.3 測定方法

1.3.1 光合色素含量、氣體交換參數和葉綠素熒光參數的測定

隨機選取每個處理的合果芋若干，從頂端起向下取其完全展開的葉子混勻后，采用丙酮提取法[25-26]測定葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素含量，最終計算3次上述測定指標的平均值。

氣體交換參數采用便攜式光合儀(CIRAS-3，漢莎科技儀器有限公司)測定。在上午9:00—11:00，測定合果芋頂芽向下數第2片完全展開葉片的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導度(Gs)和胞間CO2濃度(Ci)，并設定數據采集時間為200 s，穩定后記錄，每個處理測定3株取平均值。

葉綠素熒光參數采用植物效率分析儀(Handy PEA，漢莎科技儀器有限公司)測定。暗適應30 min后，測定合果芋頂芽向下數第2片完全展開葉片的初始熒光(F0)、最大熒光產量(Fm)和PSⅡ最大光能轉化效率(Fv/Fm)值，每個處理測定3株取平均值。

1.3.2 過氧化氫、丙二醛和電解質滲透率的測定

隨機選取每個處理的合果芋若干，從頂端起向下取其完全展開的葉子混勻后，采用二甲酚橙法[27]測定過氧化氫(H2O2)含量；采用改進的硫代巴比妥酸法[28]測定丙二醛(MDA)含量；采用電導率儀(DDSJ-308F，上海儀電科學儀器股份有限公司)測定電解質滲透率(EC)，最終計算3次上述測定指標的平均值。

1.4 數據處理及分析

試驗數據采用Excel 2019統計，SPSS 23.0分析處理間的差異顯著性，所有數據均以平均數±標準差表示，采用雙因素方差方法分析顯著性(P<0.05)，使用Origin 2019b軟件繪圖。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 BPA脅迫下合果芋葉片光合色素含量

由圖1可知，在同一培養階段，不同BPA處理(10、30和50 mg·L-1)的合果芋葉片葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素含量均低于對照處理(CK, 0 mg·L-1)。在10 mg·L-1處理下，合果芋葉片光合色素含量在3 d內略有下降，但在3 d后變化相對穩定。在30 mg·L-1和50 mg·L-1處理下，合果芋葉片光合色素含量隨著脅迫時間的增加顯著降低，其降低趨勢在前5 d顯著，后5 d趨于平緩。在第10天，10、30和50 mg·L-1處理下的葉綠素a分別比CK降低了6.4%、21.5%和30.1%；葉綠素b分別降低了7.0%、19.5%和32.5%；總葉綠素分別降低了6.6%、21.0%和31.1%；類胡蘿卜素分別降低了10%、19%和30.2%。

圖1 雙酚A(BPA)處理對合果芋葉片葉綠素a (a)、葉綠素b (b)、總葉綠素(c)和類胡蘿卜素(d)含量的影響注：不同大寫字母表示同一濃度下不同時間水平下差異性顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示同一時間不同濃度水平下差異性顯著(P<0.05)；下同。Fig. 1 Effects of bisphenol (BPA) treatment on the content of chlorophyll a (a), chlorophyll b (b), total chlorophyll (c) and carotenoid (d) in leaves of Syngonium podophyllum SchottNote: Different capital letters indicate significant differences at the same concentration and different time levels (P<0.05); different lowercase letters indicate significant differences at the same time and different concentration levels (P<0.05); the same below.

2.2 BPA脅迫下合果芋葉片氣體交換參數

不同BPA處理下合果芋葉片Pn、Tr、Gs和Ci的變化情況如圖2所示。隨著BPA濃度的增加，合果芋葉片Pn逐漸下降，10 mg·L-1處理下變化相對穩定，處理10 d內略有下降但是變化不大，而30 mg·L-1、50 mg·L-1處理下前5 d內變化顯著，5 d后變化趨緩(圖2(a))；在10、30和50 mg·L-1處理下合果芋葉片Tr顯著低于對照處理(CK, 0 mg·L-1)，在第10天分別降低8%、14%和25%，其中50 mg·L-1處理變化最顯著(圖2(b))；10、30和50 mg·L-1脅迫10 d后，Gs分別比CK降低了21%、31%和48%(圖2(c))；當BPA濃度高于30 mg·L-1時，合果芋葉片Ci顯著增加，分別比CK增加了8%、27%和28%(圖2(d))。

圖2 BPA處理對合果芋葉片凈光合速率(Pn) (a)、蒸騰速率(Tr) (b)、氣孔導度(Gs) (c)和胞間二氧化碳濃度(Ci) (d)的影響Fig. 2 Effects of BPA treatment on net photosynthetic rate (Pn) (a), transpiration rate (Tr) (b), stomatal conductance (Gs) (c) and intercellular carbon dioxide concentration (Ci) (d) in leaves of Syngonium podophyllum Schott

2.3 BPA脅迫下合果芋葉片葉綠素熒光參數

不同BPA處理下合果芋葉片F0、Fm和Fv/Fm值的變化特征如圖3所示。10、30和50 mg·L-1處理下F0均高于對照處理(CK, 0 mg·L-1)，其中在第10天分別為696、730和746(圖3(a))；在同一培養階段，10、30和50 mg·L-1處理下Fm均低于CK，且在50 mg·L-1處理下達到最顯著水平(圖3(b))；10 mg·L-1處理下Fv/Fm值變化相對穩定，處理10 d內略有下降但是變化不大，而50 mg·L-1處理顯著下降，其中在第10天，10、30和50 mg·L-1處理下Fv/Fm值分別為0.763、0.745和0.737(圖3(c))。

圖3 BPA處理對合果芋葉片初始熒光(F0) (a)、最大熒光產量(Fm) (b)和PSⅡ最大光能轉化效率(Fv/Fm) (c)的影響Fig. 3 Effects of BPA treatment on initial fluorescence (F0) (a), maximum fluorescence yield (Fm) (b) and maximum light energy conversion efficiency (Fv/Fm) (c) of PSⅡ in leaves of Syngonium podophyllum Schott

2.4 BPA脅迫下合果芋葉片氧化損傷

由圖4可知，不同BPA處理下合果芋葉片H2O2、MDA含量和EC值均高于CK(0 mg·L-1)。在30 mg·L-1、50 mg·L-1處理下，隨著脅迫時間的增加，H2O2和MDA含量和EC值呈現不同程度的遞增，在第10天，H2O2分別比CK增加了16%和27.8%(圖4(a))，MDA含量分別比CK增加了12.2%和17.1%(圖4(b))，EC值分別比CK增加了3.6%和5.3%(圖4(c))。在10 mg·L-1處理下，H2O2、MDA含量和EC值在3 d內略有上升，而在3 d后的變化趨于穩定。

圖4 BPA處理對合果芋葉片過氧化氫(H2O2) (a)、丙二醛(MDA)(b)和電解質滲透率(EC)(c)的影響Fig. 4 Effects of BPA treatment on hydrogen peroxide (H2O2) (a), malondialdehyde (MDA) (b) and electrolyte permeability EC (c) in leaves of Syngonium podophyllum Schott

3 討論(Discussion)

3.1 BPA脅迫對合果芋葉片光合作用的影響

植物生長發育依賴有機物的合成與積累，而有機物合成與累積依賴于植物的光合作用，因此光合作用的改變是環境污染物影響植物生長發育的關鍵性因素。其中葉綠素和類胡蘿卜素是植物光合作用的主要色素，其含量高低直接反映植物光合作用能力的強弱，當植物受到逆境脅迫后可導致光合色素含量下降[18, 29-30]。有研究表明，高濃度的BPA能降低葉綠素的含量，干擾植物的正常生理活動，對有機物積累過程產生影響[24]。Zhang等[31]研究指出，高劑量BPA暴露會損害PSⅡ反應中心，抑制光化學反應，并導致多余的能量以熱量的形式釋放。本研究結果顯示，隨著BPA濃度的增加，合果芋葉片的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素含量均呈下降的趨勢，當BPA濃度達到50 mg·L-1時，合果芋葉片葉綠素的合成能力影響最嚴重，其中葉綠素a對脅迫處理更為敏感。推測其原因，可能是因為BPA脅迫抑制了合果芋光合作用中的電子傳遞，葉綠體結構遭到破壞，葉綠素合成酶的活性受到較大程度的影響。

植物的光合作用主要受氣孔因素和非氣孔因素的限制，在葉片氣體交換動態變化過程中，當Ci與Gs同時下降時，Pn下降主要是由氣孔限制引起的，如果Pn的降低伴隨著Ci升高，光合作用的主要限制因素則是光合機構活性降低的非氣孔因素引起的[32]。在逆境脅迫下，植物通常表現出氣孔導度降低，蒸騰減弱，CO2吸收和同化阻力增加，導致光合速率降低，同化產物供應較少。趙繼武等[33]發現鈾脅迫會使黑麥草的Pn和Gs顯著降低，但未對Ci產生顯著影響，表明黑麥草的光合參數對鈾具有較好的耐受性，而Pn的降低可能是光抑制引起的。本研究中，Pn、Tr、Gs與葉綠素的變化趨勢基本一致，BPA濃度>30 mg·L-1時，合果芋葉片Gs顯著減小，Tr和Pn顯著降低，Ci逐漸增加，表明BPA導致光合作用降低應是屬于非氣孔限制因子造成的，即葉肉消耗CO2的能力降低，光合作用過程受到BPA的抑制和損傷，進而使光合代謝受到嚴重影響。這與李澤等[34]在重度干旱脅迫下2種油桐的Pn、Gs和Tr等顯著下降、Ci顯著升高的結果相似。

葉綠素熒光是探測和分析植物光合功能的重要手段之一，為研究光系統及其電子傳遞過程提供了豐富信息，常被用于評價環境脅迫對植物生長的影響[16, 35]。其中F0是PSⅡ反應中心全部開放時的熒光，它可以表示逆境對作物葉片PSⅡ永久性傷害；Fm是PSⅡ反應中心處于完全關閉時的熒光產量，可反映通過PSⅡ的電子傳遞情況；Fv/Fm為PSⅡ最大光化學量子產量，常用于度量植物葉片PSⅡ原初光能轉換效率和PSⅡ潛在活性[33, 36-37]。徐小遜等[30]發現豨薟葉片Fv/Fm、電子傳遞的量子產率(ΦPSⅡ)、表觀光合電子傳遞速率(ETR)隨Cd濃度的升高而逐漸降低，而非光化學淬滅系數(NPQ)則呈現先升高后降低的趨勢，表明豨薟光合機構對Cd脅迫有一定的耐受能力。在本研究中，合果芋葉片F0隨BPA濃度和脅迫時間的增加呈上升趨勢，Fm、Fv/Fm值呈下降趨勢，表明BPA處理組合果芋葉片捕獲光能中用于光化學反應的光能減少，降低了PSⅡ反應中心開放程度和光化學活性，影響了合果芋內部生理功能的正常代謝。Jiao等[38]研究在大豆不同生長階段BPA脅迫對光合作用的影響發現，隨著BPA脅迫濃度的增大，大豆的Fv/Fm值呈不斷降低趨勢，對其光合作用的抑制作用也更明顯。

3.2 BPA脅迫對合果芋葉片氧化損傷的影響

在正常生長環境下，植物體內活性氧(ROS)產生和清除保持動態平衡，但不同的環境脅迫會導致ROS代謝紊亂。當ROS過量積累，直到超過植物抗氧化清除能力的程度時，會在葉綠體、質膜、線粒體和過氧化物酶體中產生氧化應激，從而引起植物細胞膜脂質過氧化損傷。其中，H2O2是ROS的重要代表物質，MDA是膜脂過氧化作用的主要產物之一，是反映細胞膜脂過氧化作用強弱和質膜破壞程度的重要指標[39-40]。此外，EC反映細胞外滲物質的多少，可作為膜受損程度的辨別指標，其生物膜結構和功能的穩定性與植物的抗逆性密切相關，在逆境脅迫下細胞膜受到了損傷，會導致滲透物質大量外流，從而會引起EC升高[41]。郭暉等[41]發現隨著鹽濃度的增大，合果芋、綠蘿、蔓綠絨和龜背竹的MDA、EC整體上均不同程度增加。Ali等[42]發現，高劑量的BPA增加了細胞的膜通透性，并導致ROS濃度增加和脂質過氧化作用加強。本研究發現，除10 mg·L-1處理外，30 mg·L-1和50 mg·L-1的BPA處理下H2O2、MDA含量均隨BPA濃度和脅迫時間的增加呈穩定上升的趨勢，這與本試驗中EC的變化趨勢一致，表明低劑量BPA誘導產生的ROS具有降解少量BPA的能力，高劑量BPA會使合果芋葉片膜脂過氧化程度加劇，膜的透性增大，穩定性降低，細胞內含物外滲，影響植物的正常代謝，從而加大植物的毒害作用，這與Wang等[43]的試驗結果相似。

綜上所述，所有BPA脅迫處理中，30 mg·L-1和50 mg·L-1處理的合果芋葉片的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素量都顯著低于對照組(6.4%～32.5%)，且葉綠素a的破壞作用高于葉綠素b；同時，BPA脅迫還抑制了合果芋葉片對光能的吸收、轉化和利用，明顯降低了Pn、Tr、Gs、Fm和Fv/Fm值，且下降幅度隨著BPA處理濃度和時間的增加而增大。相對來說，10 mg·L-1的BPA脅迫處理對合果芋葉片氣體交換參數、葉綠素熒光參數的影響較小。此外，30 mg·L-1和50 mg·L-1處理的合果芋葉片H2O2和MDA含量、EC值均有不同程度的增加，且葉片膜脂過氧化嚴重，明顯受到損傷；而10 mg·L-1處理的合果芋葉片氧化損傷沒有顯著影響。