miR-30b-5p 抑制Notch信號通路活化對實驗性自身免疫性葡萄膜炎的治療作用△

殷學偉 郭勵劼 周夢賢 屈如意 畢宏生 郭大東

葡萄膜炎是眼科常見的一類可復發的嚴重危害視覺健康的自身免疫性疾病，多采用激素和免疫抑制劑治療，副作用較大。因此，深入探討葡萄膜炎的發病機制、發現新的治療靶點對臨床治療具有重要意義。MicroRNA(miRNA)是在基因轉錄后水平調控靶基因表達的一類功能性小分子RNA。Notch 信號通路是調節自身免疫性疾病和炎癥反應的重要通路[1]。miRNA的表達異常與葡萄膜炎的發病進程關系密切。研究發現，在急性前葡萄膜炎患者的外周血中，miR-146a、miR-143、miR-205和 miR-9-3表達水平均顯著降低，而miR-301a和miR-23a的表達水平明顯升高，這證實miRNA在葡萄膜炎發病過程中發揮重要的作用[2]；而miR-155可通過靶向作用于Ets-1基因調控Th17細胞的免疫應答，抑制miR-155可減少致病性Th17細胞的數量，從而減輕葡萄膜炎患者的發病程度[3]；我們的前期研究發現，miRNAs的差異表達可能與葡萄膜炎的發病機制密切相關[4-8]。本研究擬以實驗性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)大鼠為模型，探討miR-30b-5p調控Notch信號通路在葡萄膜炎發病中的作用機制，為建立以 miRNA 為作用靶點的新型治療方法提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器光感受器間維生素A結合蛋白(IRBP)(上海生工公司)；結核分枝桿菌(TB)(Difco公司，美國)；完全弗式佐劑(CFA)(Sigma公司，美國)；LV-rno-mir-30b(16507-1)病毒，陰性對照病毒CON238(上海吉凱基因)；RNA提取試劑盒(北京Aidlab公司)；逆轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒(QIAGEN 公司，德國)；兔抗DLL4多克隆抗體(北京博奧森公司)，兔抗Notch1多克隆抗體(北京博奧森公司)，免疫組化SP試劑盒(北京博奧森公司)；封閉用山羊血清(Solarbio，SL038)；蘇木素(Thermo公司，美國)；免疫組化筆(福州邁新公司)；LightCycler 480 qRT-PCR儀(Roche公司，美國)；全自動封片儀(Thermo公司，美國);Revolve正置/倒置熒光顯微鏡(Echo公司，美國)。

1.1.2 實驗動物及分組處理健康雌性Lewis大鼠32只(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)，6～8周齡，160～180 g，隨機分為對照組、EAU組、miR-30b-5p組及miR-30b-5p空載體(miR-30b-5p-N)組，每組各8只。對EAU組、miR-30b-5p組及miR-30b-5p-N組大鼠的腹壁兩側、后肢兩足墊以及軀干上皮下各點分別注射200 μL含IRBP、TB、CFA和無菌PBS的乳糜液以誘導EAU模型，對照組大鼠于相同位置注射等體積的TB和CFA的乳糜液。在免疫后立即將攜帶miR-30b-5p的慢病毒和攜帶miR-30b-5p空載體的慢病毒分別相應注射于miR-30b-5p組和miR-30b-5p-N組的EAU大鼠脾臟(每只注射病毒量均為5×107TU)，進行干預治療處理。動物的使用均符合《實驗動物管理條例》。

1.2 生物信息學預測分析通過Target Scan(http://www.targetscan.org/)對Notch1和Dll4基因與 miR-30b 的關系進行生物信息學預測，分析 miR-30b-5p 對 Notch 信號通路相關分子表達的調控作用。

1.3 qRT-PCR檢測各組大鼠脾臟、淋巴結及眼組織中Notch1和Dll4 mRNA的表達變化免疫后12 d，分別取4組大鼠的脾臟、淋巴結和眼組織，提取RNA后進行反轉錄，引物序列為：GAPDH上游引物為5’-CACGGCAAGTTCAACGGCACAGT-3’，下游引物為5’-AGCGGAAGGGGCGGAGATGAT-3’，分子長度為222 bp；Notch1上游引物為5’-ATGGCCCCACCTGCAGACAAGATG-3’,下游引物為5’-GGCACGGCAGGCACAGCGATAG-3’，分子長度為113 bp；DLL4上游引物為5’-CAAGAATAGCGGCAGTGGTCGTAA-3’,下游引物為5’-GTAGCGCAGTCTTGTGAGGGTGTT-3’，分子長度為229 bp。反應體系為每孔20 μL，反應條件為：95 ℃、5 min，反應循環1次；95 ℃、20 s，57 ℃、25 s，60 ℃、25 s，循環45次。qRT-PCR程序完成后，按 2-ΔΔCt計算Notch1和Dll4 mRNA的表達水平。

1.4 免疫組織化學檢測免疫后12 d，取各組大鼠相同部位的脾臟、淋巴結和眼組織進行切片，切片厚度約為10 μm。將切片置于室溫環境10～15 min后用冰乙酸固定10～20 min。每個切片經PBS沖洗后均滴1.67 mol·L-1H2O2，置于室溫環境10 min。各切片經PBS沖洗后一抗(Notch1 1400，Dll4 1500)4 ℃ 孵育過夜。將切片轉入室溫環境復溫30 min。各個切片經PBS沖洗后，采用HRP標記的二抗(1200)孵育于室溫中靜置20 min。顯微鏡下觀察DAB染色效果后用自來水沖洗以終止染色。蘇木素染色后用自來水沖洗1 min。每張切片均滴10 g·L-1鹽酸酒精，用清水沖洗1 min。碳酸鋰飽和溶液1 min，用清水沖洗1 min。用梯度酒精脫水2 min。 二甲苯透明5 min。采用中性樹膠封存，封存后于顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 生物信息學預測分析結果生物信息學預測分析結果表明，Notch 信號通路上 Notch1和Dll4基因均為 miR-30b 調控的靶基因，提示Notch1和Dll4在葡萄膜炎的發生發展過程中發揮了重要作用。因此，深入研究 miR-30b-5p 調控 Notch 信號通路相關分子表達的作用機制，對于闡釋葡萄膜炎發生發展的病理機制具有重要意義。

2.2 大鼠脾臟、淋巴結及眼組織中Notch1和Dll4 mRNA的表達變化qRT-PCR檢測顯示，免疫后12 d，相比于對照組，EAU組、miR-30b-5p組和miR-30b-5p-N組大鼠脾臟、淋巴結和眼組織中Notch1和Dll4 mRNA水平均明顯升高(均為P<0.05)；與EAU組大鼠相比，經miR-30b-5p干預后，miR-30b-5p組大鼠脾臟、淋巴結和眼組織中Notch1和Dll4 mRNA水平均顯著降低(均為P<0.05)。然而，miR-30b-5p-N組大鼠各組織中Notch1和Dll4 mRNA表達水平與EAU組相比差異均無統計學意義(均為P>0.05)(表1)。

表1 各組大鼠脾臟、淋巴結和眼組織中Notch1和Dll4 mRNA的相對表達水平

2.3 大鼠脾臟、淋巴結和眼組織中的Notch1和Dll4蛋白表達水平免疫組織化學檢測結果發現，免疫后12 d，miR-30b-5p組大鼠脾臟、淋巴結和眼組織中Notch1和Dll4蛋白的表達均弱于EAU組，差異均有統計學意義(均為P<0.05)，而miR-30b-5p-N組大鼠脾臟、淋巴結和眼組織中Notch1和Dll4蛋白的表達與EAU組相比差異均無統計學意義(均為P>0.05)(圖1，圖2)。

A：對照組、EAU組、miR-30b-5p組和miR-30b-5p-N組大鼠脾臟、淋巴結和眼組織中Notch1蛋白表達情況。B：平均光密度值分析的直方圖，與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與EAU組比較，#P<0.05， ##P<0.01。圖1 免疫組織化學檢測各組大鼠脾臟、淋巴結和眼組織中Notch1蛋白表達

A：對照組、EAU組、miR-30b-5p組和miR-30b-5p-N組大鼠脾臟、淋巴結和眼組織中Dll4蛋白表達情況。B：平均光密度值分析的直方圖，與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與EAU組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖2 免疫組織化學檢測各組大鼠脾臟、淋巴結和眼組織中Dll4蛋白表達

3 討論

葡萄膜炎是嚴重危害人類健康的一類自身免疫性眼病，多發于青壯年。Notch信號通路是維持機體免疫平衡的重要信號通路，可通過調節相關細胞因子的表達進而誘導細胞的分化[9]。研究顯示，Notch信號通路經Notch信號通路抑制劑DAPT阻斷后，通路中Jagged-1信號分子可顯著降低CD4+T細胞中ROR-γt的表達，并下調與Th17相關的炎性細胞因子IL-17A、IL-17F、IL-23a和IL-12rb1的表達水平[10]；Notch信號通路阻斷劑可明顯抑制葡萄膜炎小鼠的發病進程[11-12]。臨床研究結果顯示，在活動性白塞氏病患者中阻斷Notch信號通路可抑制Notch信號分子的激活[13]。我們前期的研究結果也顯示，EAU大鼠淋巴結、脾臟和眼組織中的T淋巴細胞經Notch信號抑制劑DAPT體外干預后，Notch1、DLL4、IL-17、ROR-γt的表達水平明顯下降，表明葡萄膜炎的發病機制伴隨著Notch1、DLL4、IL-10、IL-17、ROR-γt和Foxp3的表達升高，以及CD4+/CD8+和Th17/Treg比例失衡。DAPT抑制Notch信號可有效下調Notch1、DLL4、IL-17的表達和ROR-γt的轉錄，降低Th17水平，恢復CD4+/CD8+、Th17/Treg平衡[14]。在本研究中，免疫后12 d，相比于對照組，EAU組大鼠各組織中Notch1和Dll4 mRNA以及蛋白水平均升高(均為P<0.05)，在EAU中伴隨著Notch信號通路相關分子的高表達，提示Notch信號通路的活化在葡萄膜炎的發生發展中發揮作用。此外，有研究顯示，抗Dll4抗體治療可顯著降低EAU在誘導期和應答期癥狀的嚴重程度，提示Dll4介導的Notch信號通路在EAU中發揮重要作用[15]。這與本研究結果一致，提示Notch 信號通路相關分子在葡萄膜炎的發病過程中具有重要作用。 抑制Notch信號可改善EAU的炎癥反應，這可能為葡萄膜炎患者提供潛在的免疫治療策略。

miRNA是一類可調控靶基因表達的功能性小分子RNA，miRNA的表達異?？赡芘c葡萄膜炎的發病機制密切相關。Jadideslam等[16]發現，白塞氏病患者中miR-21、miR-146b的表達明顯降低，miR-326的表達升高。miR-223-3p可通過抑制轉錄因子FOXO3的表達促進EAU中Th17細胞的自身反應[17]。Meira-Strejevitch等[18]研究表明，眼弓形體病引起的后葡萄膜炎患者中miR-155-5p和miR-29c-3p的表達均升高，而miR-21-5p和miR-125b-5p均呈下調表達。我們的前期研究發現 ，EAU大鼠的外周血淋巴細胞中的miRNA中，36條呈上調表達，31條呈下調表達[19]；后續研究顯示，在EAU大鼠脾臟和淋巴結中，miR-30b-5p調控Atg5、Atg12和Becn1自噬基因的表達，miR-30b-5p可通過影響自噬通路進而影響葡萄膜炎的發生發展[5]，同時，我們前期研究也證明miR-30b-5p也可以通過調節IL-10和TLR4陽性細胞的水平來影響葡萄膜炎的發生，進而影響葡萄膜炎的發展[7]。

本研究成功建立了EAU大鼠模型，并且成功將攜帶miR-30b-5p慢病毒的EAU大鼠進行體內脾臟注射治療，干預治療后，各組大鼠脾臟、淋巴結和眼組織中的Notch1和Dll4的基因與蛋白水平變化結果基本一致。結果顯示，免疫后12 d，相比于對照組，EAU組、miR-30b-5p組和miR-30b-5p-N組大鼠脾臟、淋巴結和眼組織中Notch1和Dll4 mRNA水平均明顯升高，提示在葡萄膜炎的發病過程中存在著Notch信號通路的激活；經miR-30b-5p干預后，miR-30b-5p組大鼠脾臟、淋巴結和眼組織中Notch1和Dll4 mRNA水平均顯著降低。然而，miR-30b-5p-N組大鼠各組織中Notch1和Dll4基因水平與EAU組相比差異無統計學意義，提示miR-30b-5p可抑制葡萄膜炎發病過程中Notch信號通路的激活，進而發揮治療葡萄膜炎的作用。免疫組織化學檢測蛋白水平結果趨勢與qRT-PCR檢測基因水平結果基本一致，即免疫后第12 d，相比于EAU組，miR-30b-5p組大鼠脾臟、淋巴結和眼組織中的Notch1和Dll4蛋白表達水平明顯下調；而miR-30b-5p-N組大鼠脾臟、淋巴結和眼組織中的Notch1和Dll4蛋白表達水平與EAU組相比差異均無統計學意義，結果進一步表明，miR-30b-5p慢病毒可明顯降低Notch信號通路相關分子的表達。當然，本研究結果是建立在采用攜帶miR-30b-5p的慢病毒通過脾臟注射EAU大鼠進行治療的基礎上，還無法應用于臨床，下一步我們擬通過采用攜帶miR-30b-5p的慢病毒通過玻璃體內注射治療EAU大鼠，進一步客觀地評價miR-30b-5p對葡萄膜炎的治療作用，為臨床應用提供依據。

綜上所述，本研究初步揭示了EAU的發病機制與Notch信號通路的活化有關，Notch信號通路的激活伴隨著Notch1和Dll4水平的升高，miR-30b-5p 可有效降低Notch信號通路相關分子Notch1和Dll4的高表達，抑制Notch信號通路的激活，減輕EAU的免疫炎癥狀態。通過攜帶miR-30b-5p的慢病毒感染技術可顯著抑制Notch信號通路的活化，平衡葡萄膜炎的免疫狀態，減輕EAU的發病程度，為臨床應用miRNAs治療葡萄膜炎等免疫性疾病提供了一定的研究基礎和理論依據。