老年性白內障患者circKMT2E表達變化及其對晶狀體上皮細胞凋亡的影響△

齊向前 徐志忠 王湘怡 周綺云 馬衛國 虎學君

白內障是世界范圍內非外傷性視力損害和失明的主要原因[1-2]。老年性白內障(ARC)是白內障的主要類型[3]，ARC的發病機制目前尚不清楚。隨著分子生物學與基因測序技術的飛速發展，非編碼RNA在疾病發生與發展過程中的作用引起了人們的普遍關注。環狀RNA(circRNA)是真核生物中一種不同于傳統線性RNA的新型分子，它能穩定保守的閉環結構，是多種疾病的潛在靶點。circRNA在不同物種中起著微小RNA(miRNA)海綿吸附的作用，通過與miRNA競爭性結合，以減輕其對靶mRNA的抑制作用。針對circRNA/miRNA/mRNA基因調控網絡的研究，有助于我們加深對ARC發展機制的了解[4]。本研究基于生物信息學分析與細胞實驗篩選得到與ARC相關的circKMT2E，探討circKMT2E在ARC患者中的表達變化及其對晶狀體上皮細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本收集取10例在我院接受白內障手術的ARC患者(男女各5例)晶狀體前囊膜，患者年齡 58～82 歲(中位年齡 69 歲)。另選取4例健康捐獻者透明晶狀體前囊膜(男女各2例)作為對照，捐獻者年齡55～79 歲(中位年齡67歲)。所有患者和健康捐獻者均無糖尿病和高血壓等全身性疾病或其他眼部疾病。

1.1.2 主要試劑及儀器人晶狀體上皮細胞系SRA01-04(BNCC340494)購于北京北納創聯生物技術研究院。高糖DMEM培養基和胎牛血清(美國Gibco公司)，引物序列(中國上海生工科技有限公司)，qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒(美國Applied Biosystems公司)，雙熒光素酶報告載體、miR-34a-5p、miR-34a-5p mimics、miRNA無序序列、pcDNA3.1-control空載體、pcDNA3.1-HMGB1質粒(中國上海吉瑪制藥技術有限公司)，LipofectamineTM2000脂質體轉染試劑(美國Invitrogen公司)，兔多抗細胞色素C(Cyt-C)、兔多抗B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)蛋白、兔多抗Bcl-2相關X蛋白(Bax蛋白)、兔單抗β-actin羊抗兔HRP二抗(美國Abcam公司)，Trizol試劑(美國Life Technologies公司)，實時熒光定量PCR系統(美國TaKaRa公司)。

1.2 circRNA芯片分析

1.2.1 RNA提取、文庫制備及測序使用Trizol試劑從人晶狀體前囊膜組織中提取總RNA。通過NanoDrop超微量分光光度計測定總RNA濃度，以D260/D280比率(1.8～2.1)作為RNA 純度的指標。然后去除總RNA中的rRNA，并將純化后的RNA逆轉錄為cDNA，并進行 PCR 擴增。最后使用Illumina HiSeq4000平臺進行測序。

1.2.2 circRNA芯片數據采集及差異性表達分析依次使用cutadapt軟件、DCC軟件(v0.4.4)、STAR軟件(v2.51 b)、CircBase數據庫和circ2Trait數據庫對所測得的circRNA進行注釋。隨后使用edgeR軟件(v3.16.5)對數據進行歸一化，篩選circRNA差異表達。使用F檢驗比較ARC患者與健康捐獻者circRNA的豐度差異。在變化倍數≥2.0且P<0.05的條件下篩選出顯著差異表達的circRNA。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞轉染及分組取SRA01-04細胞進行培養，當SRA01-04細胞生長至細胞融合度達80%時，用LipofectamineTM2000脂質體轉染試劑將miR-control無序序列、miR-34a-5p mimics轉染至SRA01-04細胞中，轉染48 h后，收集所有細胞進行后續檢測。后期實驗為了進一步探討HMGB1的作用，通過轉染HMGB1過表達質粒pcDNA3.1-HMGB1構建 HMGB1過表達細胞株，并將轉染相應陰性空載體 pcDNA3．1-control的細胞作為陰性對照。將體外培養的SRA01-04細胞隨機分組，其中，空白對照組：用正常培養液培養，不作特殊處理；miR-control組：轉染miR-control無序序列；miR-34a組：轉染miR-34a-5p mimics序列；miR-34a+control組：共轉染miR-34a-5p mimics序列和pcDNA3.1-control空載體；miR-34a+HMGB1組：共轉染miR-34a-5p mimics序列和pcDNA3.1-HMGB1質粒。

1.3.2 實時熒光定量PCR檢測使用Trizol法提取總RNA，并用SuperScriptII試劑盒合成cDNA。使用 qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒進行實時熒光定量PCR檢測，并以U6或GAPDH作為內參，使用2-ΔΔCt法計算circRNA和miRNA的相對表達量。miR-34a上游引物序列為5’-GCCCTGGCAGTGTCTTAG-3’，下游引物序列為5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；circKMT2E上游引物序列為5’-TCAGAGGAGCAGATTGCAGA-3’，下游引物序列為5’-CGCATAGGGCAAACCAAT-3’；GAPDH上游引物序列為5’-GGCCTCCAAGGAGTAAGACC-3’，下游引物序列為5’-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3’。

1.3.3 雙熒光素酶報告基因檢測circKMT2E與miR-34a-5p相互作用當SRA01-04細胞在24孔板中生長至細胞融合度達80%時，使用miR-34a-5p mimic、miR空白對照(100 nmol·L-1)與報告(circKMT2E野生型序列或突變型序列)質粒(100 ng)與LipofectamineTM2000脂質體轉染試劑共轉染。轉染48 h后，使用雙熒光素酶試劑盒測量熒光素酶活性。

1.3.4 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況將SRA01-04細胞用胰蛋白酶消化、洗滌并用100 mL結合緩沖液重懸，使細胞最終密度為1×109個·L-1。然后將細胞用5 μL的Annexin V/FITC染色，上機檢測前15 min加入1 μL PI染液。通過FACSCalibur流式細胞儀檢測出細胞凋亡率。

1.3.5 Western blot檢測各組細胞中Cyt-C、Bcl-2、Bax蛋白表達使用RIPA裂解緩沖液從SRA01-04細胞提取總蛋白。通過BCA蛋白質測定試劑盒檢測樣本蛋白濃度。將總蛋白樣本進行SDS-PAGE電泳，轉至PVDF膜。用牛奶封閉4 h后，將PVDF膜與一抗(11000稀釋)4 ℃過夜孵育。次日更換為二抗常溫孵育2 h。使用ECL發光液進行顯影，并定量蛋白條帶。

1.4 統計學分析本研究采用SPSS 21.0軟件包進行數據分析。數據以均數±標準差表示，采用方差分析和兩獨立樣本t檢驗進行組間比較。檢驗水準：α=0.05。

2 結果

2.1 circRNA芯片分析結果基于Illumina HiSeq4000平臺的RNA-Seq共產生大約1億個reads，隨后將這些讀數利用STAR軟件依據人類參考基因組(UCSC hg19)進行注釋。在所有樣本中共識別到21 684個候選circRNA(reads≥1)，包括ARC患者中的17 241個和健康捐獻者中的15 483個。高通量測序結果顯示，ARC患者晶狀體前囊膜組織中與健康捐獻者相比，有397個顯著差異表達的circRNA，其中249個表達下調，148個表達上調。經生物信息學分析顯示，circKMT2E在ARC患者晶狀體前囊膜組織中表達上調最為顯著。

2.2 circKMT2E和miR-34a-5p表達的關系ARC患者晶狀體前囊膜組織中circKMT2E與miR-34a-5p相對表達量呈負相關關系(r=-0.897，P=0.032)。

2.3 circKMT2E與miR-34a-5p的靶向結合關系經雙熒光素酶報告基因實驗證實，miR-34a-5p可與circKMT2E相互結合(圖1)。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，轉染miR-34a-5p后circKMT2E-WT報告基因的熒光素酶活性由1.000±0.023降低至0.502±0.057，差異有統計學意義(t=22.921，P<0.05)；而circKMT2E-MUT報告基因的熒光素酶活性由1.005±0.018降低至0.989±0.053，差異則無統計學意義(t=0.809，P>0.05)。

圖1 circKMT2E和miR-34a-5p靶向結合序列

2.4 各組SRA01-04細胞凋亡情況miR-control組SRA01-04細胞凋亡率為3.82%±0.41%，空白對照組為3.56%±0.54%，兩組相比差異無統計學意義(t=1.085，P>0.05)；但是miR-34a組SRA01-04細胞凋亡率(23.59%±3.47%)較miR-control組增高(t=16.001，P<0.05)。此外，miR-34a組和miR-34a-control組(24.59%±4.33%)SRA01-04細胞凋亡率比較，差異無統計學意義(t=0.510，P>0.05)；而miR-34a-HMGB1組SRA01-04細胞凋亡率(8.97%±1.20%)較miR-34a-control組降低(t=10.319，P<0.05)(圖2)。

2.5 各組SRA01-04細胞凋亡相關蛋白表達miR-control組與空白對照組相比，SRA01-04細胞Cyt-C蛋白(0.95±0.11、1.00±0.09)、Bax蛋白(1.05±0.04、1.00±0.06)和Bcl-2蛋白(0.98±0.03、1.00±0.05)相對表達量差異均無統計學意義(均為P>0.05)。但是，miR-34a組SRA01-04細胞Cyt-C蛋白、Bax蛋白相對表達量較miR-control組分別增加至1.78±0.15和2.33±0.17(均為P<0.05)，同時Bcl-2蛋白相對表達量則降低至0.43±0.02(P<0.05)。miR-34a組和miR-34a-control組SRA01-04細胞Cyt-C蛋白(1.78±0.15、1.83±0.23)、Bax蛋白(2.33±0.17、2.31±0.23)和Bcl-2蛋白(0.43±0.02、0.47±0.03)相對表達量差異均無統計學意義(均為P>0.05)；而與miR-34a-control組相比，miR-34a-HMGB1組SRA01-04細胞Cyt-C蛋白和Bax蛋白相對表達量分別降低至0.80±0.03和0.93±0.05，同時Bcl-2蛋白相對表達量增加至1.56±0.11(均為P<0.05)(圖3)。

A：空白對照組；B：miR-control組；C：miR-34a組；D：miR-34a+control組；E：miR-34a+HMGB1組。圖2 流式細胞儀檢測各組SAR01-04細胞凋亡情況

A：空白對照組；B：miR-control組；C：miR-34a組；D：miR-34a+control組；E：miR-34a+HMGB1組。圖3 各組SRA01-04細胞凋亡相關蛋白表達情況

3 討論

近年來，circRNA、miRNA和mRNA在疾病發生發展過程中的作用逐漸被人們所關注。與線性RNA不同，circRNA可以形成共價閉環結構，具有更高的穩定性和遺傳保守性。隨著高通量測序技術和生物信息學的發展，circRNA在白內障發病機制中的作用逐漸被人們認識[5-6]。本研究通過高通量篩選發現，circKMT2E在ARC患者晶狀體前囊膜中的表達上調，約為正常組織的2倍。因此，我們從circKMT2E出發，通過結合位點預測、雙熒光素酶報告基因檢測與實時熒光定量PCR驗證，證實了circKMT2E對miR-34a-5p的海綿吸附作用。

ARC是目前最常見的眼部疾病之一，在ARC的發病機制中，晶狀體上皮細胞對于維持整個晶狀體的代謝穩定性和透明度至關重要，而其凋亡是白內障形成的主要細胞學基礎。既往研究發現，miR-34a可通過多種途徑促進晶狀體上皮細胞凋亡，這可能與其靶向調控E2F轉錄因子3[7]、Sirtuin1[8]等下游蛋白表達有關。此外，Li等[9]研究發現，miR-34a通過下調Bcl-2表達促進晶狀體上皮細胞凋亡；Fan等[10]研究也證實，miR-34a可靶向促進由晶狀體上皮細胞線粒體功能障礙誘導的凋亡。這些研究結果均說明miR-34a-5p在晶狀體和視網膜相關疾病中具有凋亡啟動因子的作用。本研究中，我們通過檢測各組細胞凋亡率和凋亡相關蛋白的表達情況證實，上調miR-34a-5p表達確實可促進SRA01-04細胞凋亡。除此以外，我們還發現，miR-34a-5p可與HMGB1的3’-UTR直接結合并調控HMGB1的表達。

HMGB1最初被描述為核DNA結合蛋白，其在進化上具有高度保守性，在轉錄調控中起到核輔助因子的作用。和許多其他核輔助因子一樣，HMGB1還可作為細胞間信使分子，從各種細胞釋放到細胞外環境中，作用于特定的細胞表面受體，從而發揮促炎或促趨化和免疫調節作用[11]。但目前尚缺乏有關miR-34a與HMGB1在白內障的發病機制中的研究。我們猜測,circKMT2E可通過對miR-34a-5p的海綿吸附作用借助HMGB1抑制晶狀體上皮細胞凋亡。本研究結果顯示，在晶狀體上皮細胞中過表達miR-34a-5p可顯著增加晶狀體上皮細胞凋亡率以及增高凋亡相關蛋白的表達水平，且降低凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達。而上調HMGB1表達后，上述miR-34a-5p的調控作用則被逆轉。本研究結果與Li等[9]的研究結果相一致，同時對miR-34a-5p的上游作用機制進行了補充，豐富了人們對miR-34a促晶狀體上皮細胞凋亡調控網絡的認識。

綜上所述，本研究證實了circKMT2E可通過海綿吸附miR-34a-5p減弱其對下游靶點HMGB1的抑制作用，進而有效地阻止SRA01-04細胞凋亡，在一定程度上起到延緩ARC發展的作用。因此，circKMT2E/miR-34a-5p/HMGB1通路有望成為ARC預防和治療的潛在靶點。