亳菊加工過程中關鍵酶活性和黃酮類成分相關性研究

左亞鋒 王娜 王孟虎 湯建 吳德玲 張偉

摘 要：目的：研究亳菊模擬加工過程中關鍵酶活性變化對黃酮類成分的影響以及兩者之間的內在聯系。方法：采用pNPG法測定不同溫度溫度下不同時間點加工的亳菊樣品中酶活性;同時采用HPLC測定40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃ 6個溫度不同時間點加工的亳菊樣品中6種黃酮類成分的含量。通過酶活性大小測定和化學成分含量變化來研究兩者之間的相關性及加工溫度對亳菊質量的內在影響。結果：發現亳菊細胞內關鍵酶活性在低溫下（<80℃）保存時間較長，在高溫狀態下（≥80℃），酶活性下降較快，90℃下酶在15min內基本失活。同時我們發現亳菊中黃酮苷類成分在不同溫度下隨著加熱時間延長，黃酮苷類成分含量變化跟酶活性有密切的相關性。當新鮮亳菊在低溫下（<80℃）加熱時，關鍵酶酶活性在亳菊細胞內保存時間較長，酶活性越高，黃酮苷類成分降低越明顯，隨著時間增加，酶活性在細胞內穩定性降低但仍有酶活性，黃酮苷類成分逐漸降低;當新鮮亳菊在高溫下加熱時，由于溫度在新鮮亳菊內是漸進式增大的，細胞體內酶活性在15min內基本都有活性，所以在15min內黃酮苷類成分是逐漸降低，隨著加熱時間增加，細胞體內達到高溫狀態，酶逐漸失活，無法水解黃酮苷類成分，黃酮苷類成分保持穩定。在實驗過程中，黃酮苷元（金合歡素）含量升高，木犀草素含量升高不顯著，芹菜素含量降低。結論：亳菊中黃酮類化合物含量變化和亳菊細胞內關鍵酶活性變化有密切的相關性，通過調控亳菊加工過程中的溫度可以影響亳菊細胞內關鍵酶活性進而影響其黃酮類成分含量的變化。而黃酮苷元（金合歡素）含量升高，木犀草素含量升高不明顯，芹菜素含量降低，推測是因其結構性質易形成配合物及加熱激活褐變酶的酶活性使其氧化聚合而含量降低，其反應機理有待進一步驗證。通過實驗研究，我們確定了溫度對酶活性和黃酮類成分的影響及其相關性，這為我們規范亳菊加工，保障亳菊品質提供研究基礎。

關鍵詞：亳菊;酶活性;干燥;相關性;黃酮類成分

中圖分類號：O656.4? 文獻標識碼：A? 文章編號：1673-260X（2022）02-0068-04

菊花為菊科植物菊的干燥頭狀花序[1]，藥典收載的五種藥用菊花因產地和加工方法的不同分為“亳菊”“滁菊”“貢菊”“杭菊”“懷菊”。五種藥用菊花加工方式差異較大，其中亳菊的傳統加工方式為陰干[2]，但是隨著市場對亳菊需求量的增加，這種傳統方式已經無法適應產地大規模生產需求，市場調研發現亳菊目前產地加工主要方式為烘干。相關文獻報道發現，不同加工方式的亳菊中化學成分含量差異較大，這其內在品質會有一定影響[3-6]，課題組前期研究[7-9]表明亳菊在加工過程中黃酮類成分含量變化主要機理就是加熱激活亳菊細胞內關鍵酶酶活性，酶水解黃酮苷生成黃酮苷元從而對亳菊品質產生影響。但是溫度如何影響酶活性以及酶活性和黃酮類成分之間的相關性并沒有見報道，因此本文對亳菊模擬加工過程中溫度對酶活性和黃酮類成分的影響及其相關性進行研究，期待為新鮮亳菊產后規范加工提供研究基礎。

1 儀器和材料

Waters1525型高效液相色譜系統（廠家）;XS3DU分析天平（廠家梅特勒-托利多）;FA2104N電子天平（上海菁海儀器有限公司）;DGT-G70電熱鼓風恒溫干燥箱（合肥華德利科學器材有限公司）;JK-250DB型數控超聲清洗器（合肥金尼克機械制造有限公司）;Heraeus Multifuge X1R低溫離心機（美國賽默飛公司）;85-2控溫磁力攪拌器（江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）;UV-759CRT紫外可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）。

對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（合肥博美生物科技有限公司）;檸檬酸，檸檬酸銨，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，石英砂均購自天津永大化學試劑有限公司;木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷對照品（批號CFN98565，純度≥98%）;木犀草素對照品（批號CFN98784，純度≥98%）;芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷對照品（批號CFN98981，純度≥98%）均購自武漢天植生物有限公司;芹菜素對照品（111901-201603，純度99.2%）;綠原酸對照品（110753-201817，純度96.8%）;3，5-二咖啡?？鼘幩幔?11782-201807，純度94.3%）均購自中國食品藥品檢定研究院;金合歡素（自制，歸一化度≥98%）;金合歡素-7-O-β-D-葡萄糖苷（自制，歸一化度≥98%）。亳菊：采自亳州亳菊藥材基地，由閆攀鑒定為菊科植物亳菊Dendranthema morifolium（Ramat.） Tzvel.‘Boju’cv.nov.的頭狀花序。磷酸（南京化學試劑股份有限公司，分析純）;甲醇（天津市永大化學試劑有限公司，分析純）;乙腈（邁達科技股份有限公司，色譜純）;水為純凈水。

2 方法

2.1 亳菊模擬加熱樣品制備

取新鮮亳菊5g，精密稱定，放入托盤中，置于不同溫度的干燥箱中模擬加熱，設定40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃六個溫度點，分別在1min、5min、10min、15min、30min、45min、60min、90min、120 min、240min、360min時取樣。

2.2 關鍵酶活性測定[7，8]

2.2.1 關鍵酶提取

取不同溫度不同時間點下加熱的亳菊，置于榨汁機中，加入少量石英沙和5%的甘油，再加入適量預冷的100mmol/L檸檬酸緩沖液（pH 4.0），榨汁1min成勻漿后于低溫下緩慢攪拌1h后抽濾。抽濾液轉移到離心管中，放置于低溫冷凍離心機中，12000r/min離心20min，取上清液作為粗酶液。

2.2.2 關鍵酶酶活性測定

在試管中加入0.2mL pNPG，0.6mL檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液（pH4.0）和0.2mL酶液，在50℃水浴條件下反應45min。反應結束后，向反應體系中加入2.5mL 1mol/L的Na2CO3終止反應，在400nm波長下測定其吸光度值。

2.3 含量測定[6]

2.3.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取對照品綠原酸、3，5-二咖啡?？鼘幩?、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、金合歡素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金合歡素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷和芹菜素適量至5mL容量瓶中，用70%甲醇定容，制成每毫升含有綠原酸1.02mg、3，5-二咖啡?？鼘幩?.236mg、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷0.752mg、木犀草素1.052mg、金合歡-7-O-β-D-葡萄糖苷0.608mg、金合歡素1.062mg、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷1.102mg和芹菜素1.032mg的對照品溶液，4℃保存備用。

2.3.2 供試液的制備

取不同溫度和時間下加熱亳菊鮮花約5g，精密稱定，精密加入70%甲醇50mL至具塞錐形瓶，稱定重量，超聲處理（功率500W，頻率45kHz），40min，放冷，再稱定重量，用70%的甲醇補足減失的重量，搖勻，0.45μm濾膜濾過，取續濾液即得。

2.3.3 HPLC條件

Agilent HC-C18（2）柱（4.6mm×250mm，5μm）;流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），線性梯度洗脫（0～8min，12%～17%A;8～25min，17%～19%A;25～30min，19%～19%A;30～60min，19%～52%A;60～65min，52%～12%A）;流速為1.0mL/min;柱溫為30℃;檢測波長為330nm，進樣體積20μL。

3 結果與討論

3.1 新鮮亳菊加工過程中關鍵酶活性變化規律

由圖1可知，關鍵酶在亳菊細胞內熱穩定性較好，亳菊在40℃及50℃狀態下加熱2h，關鍵酶酶活性仍很高，加熱超過6h才基本失去活性。隨溫度升高酶穩定性逐漸下降，當加熱溫度為60℃時，加熱2h酶活性就很微弱，當加熱溫度超過70℃時，酶活性會急劇下降，加熱45min基本失活。在溫度為90℃時，酶在10min內即基本失活。

本實驗研究的是亳菊細胞內關鍵酶熱穩定性，與課題組前期研究[6，8]提取純化得到的亳菊酶液進行的性質研究相比較，得到的規律基本相同。這說明關鍵酶在復雜的細胞內體系中和單一的細胞外體系內性質差別不大，將該酶純化后進行性質研究所得的結果可以適用于原藥材的復雜體系內。

3.2 新鮮亳菊模擬加工過程中主要成份含量變化規律

由圖2-4可知，加熱溫度對亳菊黃酮類成分影響較大。通過比較發現，在低溫狀態下，酶活性較大，酶活性保存時間較長。隨著加熱時間增加，酶活性穩定性逐漸降低但仍有酶活性。在此期間對應的黃酮苷類成分因關鍵酶的水解逐漸降低直至消失。在高溫狀態下，由于溫度在亳菊細胞內是漸進式升高，酶活性并沒有直接被滅活，15min內保持基本酶活性，在此期間黃酮苷類成分是逐漸降低的。高溫狀態下隨著加熱時間增長，亳菊細胞內也達到高溫狀態，關鍵酶酶活性基本消失，此后時間段黃酮苷類成分基本保持穩定。由圖2-4也可知，亳菊干燥狀態下（干燥2h，4h，6h），黃酮苷類成分含量在高溫狀態下要比低溫狀態下高，這是因亳菊干燥2h，4h，6h后，高溫滅活關鍵酶酶活性，使其不能水解黃酮苷生成黃酮苷元。但是黃酮苷元中木犀草素和芹菜素的含量隨著加熱時間的延長并沒有顯著的升高，這可能跟其結構性質及亳菊中存在的褐變酶有一定關系。亳菊中的褐變酶主要有多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）等，這些酶的存在會作用于亳菊中的酚類、黃酮類成分，使其發生氧化和聚合反應導致組織褐變，甚至腐敗變質，嚴重影響亳菊品質和質量[10]。目前國內有學者對亳菊褐變酶[11]和硫熏劑量對亳菊褐變酶和化學成分的影響[12]進行了報道，結果表明亳菊采收加工中酚類等成分變化的主要因素可能就是褐變酶被激活。因此我們推測亳菊加熱過程中在低溫狀態下褐變酶被激活，這兩種黃酮苷元被褐變酶氧化聚合而含量降低。當溫度升高時，由于褐變酶在新鮮亳菊組織體內，而溫度升高在新鮮亳菊組織內部是漸進式的，這就導致褐變酶在高溫狀態下是先被激活后被抑制，仍然會產生作用。黃酮類化合物大多數為強的金屬螯合劑[13]，熊運浩[14]對木犀草素-金屬配合物的制備進行了研究，并在中藥水煎液中發現木犀草素與金屬微量元素形成的配合物，蔡勝[15]，楚婧[16]，丁桂峰[17]，夏小明[18]等分別對木犀草素-金屬配合物的制備進行了研究，孫秀琴等[19]綜述了芹菜素和鐵、芹菜素和銅的螯合作用，結果表明木犀草素、芹菜素與金屬離子有較強的配位能力，木犀草素、芹菜素與金屬離子形式配合物也是影響其含量的一種因素。

4 討論

亳菊在加工過程中溫度的選擇會對亳菊質量產生很大影響。亳菊中由于存在關鍵酶，在一定溫度下會激活關鍵酶水解黃酮產生黃酮苷元。加工過程中溫度不同，導致關鍵酶活性不同，從對酶水解黃酮產生黃酮苷元影響，最終加工得到的亳菊品質差異很大。因此，在亳菊規范加工過程中應充分考慮溫度對關鍵酶活性和黃酮類成分的影響，根據其相關性選擇合適溫度的加工方法。亳菊中也存在褐變酶，推測該酶在加工過程中由于溫度的影響也會對黃酮苷元含量產生影響，具體影響及其基質還需要我們進一步研究。因此，在亳菊的加工過程中不僅要考慮到溫度變化對關鍵酶的影響，也要考慮亳菊中存在的褐變酶，規范亳菊加工工藝，保證亳菊質量。

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收稿日期：2021-09-27

通訊作者：張偉（1985-），男（漢族），碩士，副教授，研究方向：中藥炮制及中藥藥效物質基礎。

基金項目：國家自然科學基金面上項目（81973485）;國家自然科學基金青年科學基金項目（81303229）;安徽高校自然科學研究重點項目（KJ2020A0765）;中藥原料產品研發安徽普通高校重點實驗室（亳州學院）（KLAHEI18032）;亳州學院校級科研項目（BY2017C04）

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