肺泡灌洗液宏基因組二代基因測序在肺炎病原感染譜檢測中的意義

朱麗華，朱 波，芮 棵，熊御云，夏 琳，陰 晴

（江蘇大學附屬醫院檢驗科，江蘇 鎮江 212001）

肺炎是一類臨床上常見的肺部感染性疾病[1]。該病發病率高、病死率也高，尤其是重癥肺炎。及時確定患者體內病原體的種類，了解致病菌的耐藥情況是對肺炎患者進行藥物治療的必要條件。目前肺炎病原體常用的臨床檢測方法有涂片、細菌培養[2]、聚合酶鏈式反應及免疫血清學等，但這些方法存在周期長、過程復雜、靈敏度低及不能檢出未知病原體等缺點，已不能完全滿足臨床需求。近年來，隨著宏基因組二代基因測序技術[3]（metagenomic next-generation sequencing, mNGS）的不斷發展，mNGS逐漸成為感染性疾病一種新的病原學檢測方法。mNGS不依賴于傳統的微生物培養，直接對臨床樣本中的核酸進行高通量測序，然后與數據庫進行比對分析，根據比對到的序列信息來判斷樣本包含的病原微生物種類，能夠快速、客觀地檢測臨床樣本中的較多病原微生物，且無需特異性擴增，尤其適用于急危重癥和疑難感染的診斷。本次研究主要是探討肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）mNGS在肺炎病原感染譜檢測中的應用價值評估。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇 2020年6月—2021年6月在江蘇大學附屬醫院住院的56 例肺炎患者，納入標準[1]：①符合社區獲得性肺炎的診斷標準；②抗生素治療72h后，患者體溫仍持續＞38 ℃和（或）咳嗽咳痰、呼吸困難等臨床不適癥狀仍存在[1]；具體標準如下：發熱＞38 ℃且持續 3 d及以上；呼吸道的主要癥狀無改善或者進行性加重；肺部影像學有進展；抗生素使用升級；患者病情惡化需要進一步進行機械通氣。

1.2 方法

1.2.1 BALF的收集：患者在咪達唑侖靜脈鎮靜下，使用2%的利多卡因進行氣道黏膜表面局部麻醉。經鼻進鏡，將支氣管鏡末端伸入病變段或肺葉，溫熱生理鹽水（1 mL/kg）進行灌洗3 次，灌洗后立刻負壓抽吸，將回吸收的BALF吸收至痰液收集器中[2]。

1.2.2 BALF的送檢：同時留取兩份BALF標本各3mL于無菌杯中，其中一份外送華大基因公司進行病原微生物mNGS檢測。另一份送本院檢驗科微生物室進行傳統微生物培養（細菌培養和真菌培養）及抗酸染色涂片。mNGS標本的采集、保存和運輸嚴格按照華大基因公司的規范進行操作。

1.2.3 傳統的微生物分離培養及鑒定：取BALF標本10 μL分別接種5%羊血瓊脂平板、巧克力平板和沙堡羅平板。35 ℃、5% CO2培養過夜，BALF培養菌落≥104CFU/mL為陽性結果，低于上述菌落計數為陰性。菌落的鑒定采用布魯克質譜儀進行分析。

1.3 統計學處理 選擇統計軟件SPSS 23.0進行數據分析處理。計數資料以例數或百分率表示，mNGS與傳統微生物培養檢測結果之間的比較采用配對χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BALF mNGS和傳統培養病原微生物檢測結果及病原分布

2.1.1 BALF mNGS病原微生物檢測結果及病原分布：56 例BALF標本，mNGS檢測出38 種微生物，共69 株，其中細菌感染（36/69）最為常見，其中鮑曼不動桿菌（7/36）為最常見的感染菌，其次為銅綠假單胞菌（4/36）、肺炎鏈球菌（3/36）、肺炎克雷伯菌（3/36）及結核分支桿菌（3/36），其他感染菌為堪薩斯分支桿菌（2/36）和流感嗜血桿菌（1/36）等。共檢出真菌19 株（19/69），在真菌感染中最為常見的是白假絲酵母菌（6/19）和耶氏肺孢子菌（5/19），其次為曲霉菌（4/19）。檢出病毒10 株（10/69），病毒感染中以巨細胞病毒（3/10）最為常見，其中分離出2019新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）1 株（1/10）。檢出非典型病原體2 株：鸚鵡熱衣原體和肺炎支原體各1 株。

2.1.2 傳統微生物培養病原微生物檢測結果及病原分布：56 例BALF標本中，傳統微生物培養法檢出10 種微生物，共23 株，其中細菌17 株（17/23），分別為鮑曼不動桿菌（7/17）、銅綠假單胞菌（4/17）、肺炎克雷伯菌（2/17）、屎腸球菌（2/17）、基質貪銅菌（1/17）和肺炎鏈球菌（1/17）；檢出真菌6 株（6/23），主要為白假絲酵母菌（4/6）。

2.2 兩種方法病原微生物檢出種類的比較 56 例BALF標本中，45 例標本（80.4%）mNGS結果為陽性，其中30 例標本（53.6%）檢出一種病原微生物，12 例標本（21.4%）檢出兩種病原微生物，3例標本（5.4%）檢出三種及三種以上病原微生物；而傳統微生物培養法僅檢出21 例病原微生物，陽性率為37.5%。（表1）

表1 兩種方法病原微生物檢出種類數比較[例(%)]

2.3 兩種方法檢出率及一致性的比較 56 例BALF標本中，發現21 例標本（37.5%）兩種檢測方法均為陽性，且對細菌及真菌鑒定結果相同，11 例標本（19.6%）兩種檢測方法均為陰性，說明mNGS對病原微生物陽性檢測率及病原種類方面，與傳統培養法相比具有較好一致性。傳統微生物培養為陰性而mNGS為陽性有24 例（42.9%），兩種檢測方法差異具有統計學意義（P＜0.05），而這24 例的病原體分布主要為病毒、支原體和真菌，說明mNGS在病毒、支原體和真菌的檢測方面比傳統微生物培養具有明顯的優勢，兩種檢測方法對病毒、真菌及細菌檢測差異具有統計學意義（P＜0.05）。（表2，表3）

表2 兩種方法的檢出率比較[例]

表3 兩種方法對不同病原體的檢出的數目（例）

3 討論

肺炎是一類由細菌、病毒、支原體等病原體引起的肺部感染性疾病。臨床實踐表明，早期、快速精準確定病原微生物，正確選擇有效抗生素是肺炎診治的關鍵。目前肺炎病原體的實驗室常規檢測手段主要包括肺炎患者痰、BALF、血液等標本的微生物培養與鑒定、定量PCR及免疫熒光等方法。然而，這些常規方法存在病原體檢出陽性率低、只能根據已知病原體特點進行檢測等缺點，不利于醫生的早期診斷及合理用藥。近幾年，隨著測序技術和生物信息學的快速發展以及測序成本的降低，微生物mNGS技術正逐漸從科研走向了臨床，被應用于臨床標本病原微生物的篩查與鑒定，成為病原學診斷的一種新的檢測手段[3]。

微生物mNGS技術具有靈敏度高、高通量等特點，目前，已有超過38 000 個細菌基因組和超過5 000 個病毒基因組的序列被測定，其中包含了絕大部分與呼吸道感染性疾病相關病原體[4-6]。mNGS高通量技術優勢是通過對標本進行無差別測序和生物信息分析，不僅可以確定已知病原體，還可以檢測未知病原體[7-9]，如正在全球流行的SARS-CoV-2的快速病原學確定正是依賴于這種高通量測序技術。目前，BALF的病原學檢查是臨床肺部疾病，特別是肺炎診斷及鑒別診斷的重要手段。細菌、真菌、病毒等病原體引起的肺部早期感染，由于感染早期病原體載量低，很難通過傳統培養手段檢出病原體且難以鑒定出多種病原體引起的混合感染。本研究通過比較56 例肺炎患者BALF標本的mNGS與培養結果，發現mNGS檢測陽性率顯著高于傳統微生物培養法，這種優勢在兩種或三種病原體混合感染時表現更為明顯。此外，mNGS技術在真菌、支原體及病毒檢測方面也顯示出較高的敏感性。通過對56 例肺炎患者BALF標本mNGS檢測，分析病原分布發現，細菌感染主要為鮑曼不動桿菌，真菌感染主要為白假絲酵母菌，病毒感染主要為巨細胞病毒，且以單一病原感染為主，這也為臨床肺炎感染經驗用藥提供了一定的參考。

綜上所述，本研究將高通量測序應用于肺炎患者BALF病原體檢測，并比較了mNGS與傳統微生物培養兩種方法在BALF細菌檢出率及檢出種類的差異，初步研究結果表明：mNGS的通量高，敏感性高，不僅可以同時檢出多種常見菌，還可以檢出罕見菌。同時，在真菌、支原體、病毒等病原體檢測方面也顯示出較高檢出能力。此外，通過對比發現兩種方法在檢出細菌的種類方面具有較好的一致性。因此，mNGS在檢測病原體方面具有高通量、高敏感性、高準確性等優點，在肺炎診斷方面具有廣闊的應用前景。本研究為高通量測序應用于病原體相關肺炎的精準診斷和治療提供了有益的探索。但值得注意的是，除培養法外，熒光定量PCR、多重PCR及數字PCR也是感染性疾病特定病原體檢測的常用方法[10-11]。與mNGS相比，PCR的靈敏度及通量雖不及mNGS，但PCR的假陽性率更低，檢測成本低廉且檢測周期更短，目前仍是感染性疾病分子診斷的主流平臺。因此，作為肺炎病原體分子診斷技術手段，PCR與mNGS之間是一種優勢互補、相輔相成的關系。常規培養、PCR及mNGS檢測組合需根據病人病情及臨床需要進行選擇。