響應面法優化大白樁菇液體發酵工藝

王志偉，郭 尚，侯雷平，李艷婷

（1.山西農業大學 園藝學院，山西 太谷 030801；2.山西農業大學 山西功能食品研究院，山西 太原 030031）

大白樁菇（Leucopaxillusgiganteus）又名大青蘑、雷蘑、青腿子或竹菇[1]，隸屬于擔子菌門（Basidiomycota）傘菌目（Agricales）白蘑科（Tricholomataceae）白樁菇屬（Leucopaxillus）[2]。大白樁菇不僅味道鮮美、營養價值豐富[3]，還可治小兒麻疹、煩燥不安等[4]。此外，研究大白樁菇多糖、蛋白質、杯傘素等生物活性物質，發現其具有清除過量自由基、提高免疫功能、抗腫瘤活性等生物學功能[5-6]。

大白樁菇是臺蘑的代表種類之一[7]，近年來，由于當地居民的過度采摘，其產量面臨著逐年縮減的威脅；另外，由于大白樁菇生長周期長、馴化難度大，目前尚未實現人工栽培。王謙等[8]研究發現，大白樁菇菌絲生長的最適溫度為25~26℃，最佳pH值為5~6，最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為尿素。利用液體發酵獲得蘑菇菌絲體是一種簡便、快捷的方法，其具有發酵周期短、方法簡單、易于控制、成本低等特點[9]。王永斌等[10]對大白樁菇液體發酵條件進行了優化，結果表明，大白樁菇最佳深層發酵條件為：培養溫度28℃，培養時間9 d，搖床轉速140 r/min。有研究表明，液體培養得到的菌絲體和農業生產得到的蘑菇子實體（菌核），在化學組成和生理功能上相似[11]。這些研究為大白樁菇的開發利用提供了有價值的參考，但對其培養過程中不同培養條件下活性物質積累的研究鮮有報道。

本試驗通過對大白樁菇液體發酵過程中不同碳源、氮源、碳氮比、p H影響其菌絲體干質量及活性物質的積累研究，以期為大白樁菇的進一步開發利用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試大白樁菇菌株由山西農業大學山西功能食品研究院提供。

1.2 儀器設備

SM 830立式壓力蒸汽滅菌器（重慶雅馬拓科技有限公司）；SW-CJ-2D超凈工作臺（上海茸研儀器有限公司）；GXZ-1000A光照培養箱（寧波樂電儀器制造有限公司）；0.000 1 g電子天平（瑞士梅特勒托利多）；移液槍（德國艾本德公司）；TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；臺式高速冷凍離心機（鹽城市安信實驗儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化與液體菌種的制備 將大白樁菇菌種接種于固體培養基（培養基配方：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，維生素B110 mg/L）在24℃下暗培養20 d。采用打孔器挑取直徑為0.5 cm已培養好的菌種置于液體培養基（培養基配方：葡萄糖30 g/L，蛋白胨6 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.25 g/L，維生素B110 g/L）中，培養溫度25℃，搖床轉速150 r/min，避光培養15 d，作為菌種備用。

1.3.2 單因素試驗 利用5種碳源（葡萄糖（C1）、海藻糖（C2）、蔗糖（C3）、麥芽糖（C4）、乳糖（C5））代替液體培養基中的碳源，配制培養基。按5%的接種量接入液體菌種，24℃、130 r/min振蕩培養10 d，終止培養。用尼龍布（0.10 mm）分離菌絲體和發酵液，菌絲體通過蒸餾水沖洗3次，60℃烘干至恒質量，稱量記錄；發酵液置于4℃冰箱中保存，用于后續試驗。以不添加碳源的培養基為空白對照（C6），每種配方設3個重復。

利用5種氮源（蛋白胨（N1）、牛肉浸膏（N2）、酵母粉（N 3）、硫酸銨（N4）、麩皮（N5））代替液體培養基中的氮源，配制培養基，以不添加氮源的培養基為空白對照（N6），每種配方設3個重復。

以葡萄糖（含碳量40%）為碳源、蛋白胨（含氮量16%）為氮源，在其他成分不變的條件下，通過調整蛋白胨的含量使其碳氮比分別為2.5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1，每種配方設3個重復。

以葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源，在其他成分不變的條件下，通過調整培養基的pH值，使其pH值分別為4、5、6、7、8、9，每種配方設3個重復。

1.3.3 菌絲體提取液的制備 將干燥后的菌絲體研磨至0.25 mm，精確稱質量0.5 g，加入20倍體積的水，設置溫度80℃，在超聲波中提取1 h，5 000 r/min離心10 min，取上清液，即為水提液，重復提取，合并2次的水提液。沉淀物加入20倍體積的無水乙醇，設置溫度60℃，在超聲波中提取1 h，5 000 r/min離心10 min，取上清液，即為醇提液，重復提取，合并2次的醇提液。

1.3.4 成分測定 總糖含量采用苯酚-硫酸法測定；還原糖含量采用DNS法測定[12]；總黃酮含量采用AlCl3-NaNO2法測定[13]；總酚含量采用福林酚法測定[14]。

粗多糖含量=總糖含量－還原糖含量 （1）

1.3.5 響應面優化液體培養試驗 在單因素試驗的基礎上，分別選取碳源（海藻糖）、氮源（牛肉浸膏）、p H這3個因素為考察對象，以菌絲體干質量為響應值，利用Design-expert 8.0軟件設計3因素3水平試驗，每個試驗設置3個重復，如表1所示。

表1 響應面試驗設計Tab.1 The test design of response sur face

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2013軟件和SPSS Statistics 22統計軟件對數據進行處理和分析；采用Design-expert 8.0進行響應面試驗設計與分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 碳源對大白樁菇菌絲體干質量及活性成分含量的影響 由圖1可知，液體發酵過程中，不同的碳源對大白樁菇菌絲體干質量及活性成分的含量均有明顯的影響。與對照相比，5種碳源均能提高大白樁菇的菌絲體干質量，其中，海藻糖是菌絲體干質量積累的最佳碳源，菌絲體干質量為5.17 g/L，其次為葡萄糖和蔗糖。葡萄糖有利于菌絲體多酚物質的積累，水提物中多酚含量為8.15 mg/g，醇提物中多酚含量為0.92 mg/g，其次為蔗糖和麥芽糖，這與BARROS等[15]的研究結果一致；以葡萄糖為碳源的發酵液中多酚含量最高，為1.10 mg/mL，其次為麥芽糖，二者間無顯著性差異。蔗糖有利于菌絲體黃酮物質的積累，水提和醇提物中黃酮總含量為4.76 mg/g，以蔗糖為碳源的發酵液中黃酮含量最高，為0.83 mg/mL，其次為海藻糖。以蔗糖為碳源的菌絲體中粗多糖的含量最高，為232.24 mg/g，其次是海藻糖，為217.90 mg/g。碳源對大白樁菇菌絲體的積累及活性成分的含量影響不一，因此綜合各指標可推斷，液體培養中海藻糖是菌絲體干質量積累的最佳碳源，葡萄糖是菌絲體多酚積累的最佳碳源，蔗糖是菌絲體黃酮和粗多糖積累的最佳碳源。

2.1.2 氮源對大白樁菇菌絲體干質量及活性成分含量的影響 由圖2可知，液體發酵過程中，不同的氮源對大白樁菇菌絲體干質量及活性成分的含量均有明顯的影響。與對照相比，5種氮源均能提高大白樁菇的菌絲體干質量，其中，牛肉浸膏和硫酸銨能顯著提高大白樁菇菌絲體干質量，二者間無顯著性差異，其次為蛋白胨。蛋白胨有利于菌絲體多酚物質的積累，水提物中多酚含量為9.24 mg/g，醇提物中多酚含量為2.22 mg/g。以硫酸銨為氮源的發酵液中多酚含量最高，為1.57 mg/mL，其次為酵母粉，多酚含量為1.47 mg/mL。蛋白胨有利于菌絲體黃酮物質的積累，水提和醇提物中黃酮總含量為4.71 mg/g，以酵母粉為氮源的發酵液中黃酮含量最高，為1.09 mg/mL，其次為硫酸銨，黃酮含量為1.04 mg/mL。以蛋白胨為氮源的菌絲體中粗多糖的含量最高，為173.05 mg/g，其次是硫酸銨，為139.45 mg/g。氮源對大白樁菇菌絲體的積累及活性成分的含量影響不一，因此綜合各指標可推斷，牛肉浸膏是菌絲體干質量積累的最佳氮源，蛋白胨是菌絲體活性成分積累的最佳氮源。

2.1.3 碳氮比對大白樁菇菌絲體干質量及活性成分含量的影響 由圖3可知，液體發酵過程中，不同的碳氮比對大白樁菇菌絲體的干質量及活性成分的含量均有明顯的影響。在碳氮比為10∶1時，菌絲體干質量達到最大，隨著碳氮比的增大，菌絲體干質量總體上呈下降的趨勢，這可能是碳源含量過高，造成了富營養狀態，抑制了菌絲體的生長。隨著碳氮比的增加，多酚含量總體上呈現上升的趨勢，在碳氮比為20∶1時，菌絲體多酚物質的積累達到最大，此時水提物中多酚含量為8.37 mg/g，醇提物中多酚含量為3.35 mg/g。隨著碳氮比的增加，菌絲體黃酮物質的積累呈現先增加后減少的趨勢。在碳氮比為20∶1時，菌絲體醇提物的黃酮含量達到最大，為3.56 mg/g；在碳氮比為30∶1時，菌絲體水提物的黃酮含量達到最大，為0.59 mg/g。在碳氮比為20∶1時，菌絲體的粗多糖含量達到最大，為226.49 mg/g，其次是碳氮比為30∶1時，粗多糖含量為218.61 mg/g。碳氮比對大白樁菇液體培養中菌絲體的積累及活性成分的含量影響不一，因此綜合各指標可推斷，碳氮比為10∶1時是菌絲體干質量積累的最佳碳氮比；碳氮比為20∶1是菌絲體活性物質積累的最佳碳氮比。

2.1.4 pH對大白樁菇菌絲體干質量及活性成分含量的影響 由圖4可知，液體發酵過程中，不同的p H值對大白樁菇菌絲體的干質量及活性成分的含量均有明顯的影響。在pH值為5時，菌絲體干質量達到最大（4.82 g/L），隨著p H值的增大或減小，菌絲體干質量都呈下降趨勢，因此，pH值為5時最有利于菌絲體干質量的積累。pH值為5時也有利于菌絲體多酚物質的積累，水提物中多酚含量為8.62 mg/g，醇提物中多酚含量為0.88 mg/g，其次是pH值為6。pH值為7時，發酵液中多酚含量最高，為1.16 mg/mL，其次是pH值為6。pH值為6時，有利于菌絲體黃酮物質、粗多糖的積累，醇提物中黃酮含量為5.29 mg/g，水提物中黃酮含量為0.56 mg/g，菌絲體的粗多糖含量為221.02 mg/g。pH對大白樁菇菌絲體干質量的積累及活性成分的含量影響不一，因此綜合各指標可推斷，p H值為5是菌絲體干質量、多酚物質積累的最佳pH值；pH值為6是菌絲體黃酮、粗多糖積累的最佳p H值。

2.2 響應面試驗優化

在單因素試驗的基礎上，以菌絲體干質量（Y）作為響應值，對海藻糖（A）、牛肉浸膏（B）、pH（C）3個因素進行3因素3水平的Box-Behnken試驗，試驗設計及結果如表2所示。將各因素使用Designexpert 8.0軟件對試驗結果進行統計分析，由表3可知，模型P值<0.01，說明該模型有意義且達到了極顯著水平；失擬項P=0.123 4（P>0.05），不顯著，表明該方程合理可靠。一次項A、B對結果影響顯著（P<0.05），C對結果影響不顯著（P>0.05），交互項AB對結果影響顯著（P<0.05），AC、BC對結果影響不顯著（P>0.05），二次項A2、C2對結果影響極顯著（P<0.01），B2對結果影響不顯著（P>0.05），3個單因素對菌絲體干質量的影響順序為B>A>C，即：牛肉浸膏>海藻糖>pH。經Designexpert 8.0軟件擬合出回歸方程為：Y=5.35－0.13A－0.16B+0.075C－0.21AB+0.06AC+0.15BC－0.55A2－0.12B2－0.35C2。

表2 響應面試驗設計因素水平及結果Tab.2 Factor levels and r esults of response sur face test design

表3 二次回歸方程方差分析Tab.3 Anova of quadratic regression equation

圖5可直觀反映影響菌絲體干質量的3個因素兩兩之間的交互作用，隨著海藻糖、牛肉浸膏、pH的增加，菌絲體干質量均出現先升高后降低的趨勢，且均出現極值。AB、BC相互作用的曲面比較大，AC相互作用的曲面比較小，說明海藻糖與牛肉浸膏、牛肉浸膏與pH的交互作用明顯，海藻糖與pH的交互作用不明顯。沿牛肉浸膏（B）方向比海藻糖（A）的響應面坡度更陡，說明牛肉浸膏對大白樁菇液體發酵培養的影響大于海藻糖，與方差分析結果一致；沿海藻糖（A）方向比pH（C）方向的響應面坡度更陡，說明海藻糖對大白樁菇液體發酵培養的影響大于pH，與方差分析結果一致。

由響應面法分析得出的最佳培養方案為：海藻糖25.08 g/L、牛肉浸膏6.33 g/L、p H值4.95、磷酸二氫鉀0.5 g/L、硫酸鎂0.25 g/L、維生素B110 mg/L，在此配方下進行5次驗證試驗，得出大白樁菇菌絲體干質量為5.26 g/L，與預測值接近，相對誤差為2.77%，證明該培養方案是有效可行的。

3 結論與討論

食用菌屬于異養微生物，主要由培養基來提供生長所需的營養物質，如碳源、氮源、無機鹽、生長因子等[16-17]，此外，液體發酵過程中培養基的p H、搖床轉速、培養溫度、接種量等都會影響食用菌菌絲體的生長與發育。碳源是食用菌最重要的營養源之一，為食用菌的生長發育提供能量[18]，大白樁菇液體發酵過程中均能利用供試的5種碳源，對菌絲體干質量的影響從大到小排序為：海藻糖>葡萄糖>蔗糖>麥芽糖>乳糖，這與張秋卉[6]的研究結果相一致。劉小霞等[19]研究表明，海藻糖對于草菇退化菌種有較好的復壯效果，有可能是由于大白樁菇菌種在繼代培養過程中出現了菌種退化現象，因此，導致了海藻糖的作用效果較為突出。氮源是菌絲生長過程中必需的營養物質[20]，大白樁菇液體發酵過程中均能利用供試的5種氮源，其影響從大到小排序為：牛肉浸膏>硫酸銨>蛋白胨>酵母粉>麩皮（以菌絲體干質量為指標），這與王謙等[8]的研究結果不一致，一方面可能是由于試驗所設的氮源較少，未涵蓋所有的氮源，另一方面可能是采用的培養方式、培養基中的微量元素存在差異。液體發酵培養基可提供菌絲生長所需的各種營養物質，且適宜的營養比例可促進菌絲生長及次生代謝產物的積累[21]，大白樁菇在液體發酵過程中，碳氮比為10∶1時，菌球干質量、菌球密度均能達到最大。由于在液體發酵過程中會隨著培養時間的增加，培養液的p H值發生一定的變化，試驗中的pH值均為滅菌前所調試的初始pH值，在pH值為5時菌絲體干質量達到最大，之后隨著p H的增加，菌絲體干質量呈下降趨勢，因此，大白樁菇液體發酵的最適pH值為5。

食用菌在液體發酵過程中會產生多種化合物，主要來自于其胞內外浸出液和發酵過程中產生的次級代謝產物，某些活性物質的含量可能遠遠高出子實體中的含量[22]。多酚類是食用菌代謝產物中最重要的組分之一，具有顯著的抗炎效果[23]；黃酮類物質具有抗氧化、抗癌、抗過敏、增強免疫功能等諸多功效[24-25]；多糖是食用菌生物活性最顯著、含量最高的物質[22]，目前，食用菌多糖的開發與利用越來越受重視[26]，衛銀等[27]研究表明，發酵液濃縮比例、乙醇濃度、醇沉時間、發酵液pH值都會影響蛹蟲草胞外多糖的提取量。大白樁菇在液體發酵過程中，獲得最高菌絲體干質量的培養基配方并不能積累到最大含量的活性物質，表明了同一個培養基配方不能同時兼顧發酵產物中高菌絲體干質量與高活性物質含量的獲得，這與林群英等[28]的研究結果相一致。在所設置的試驗方案中研究表明，葡萄糖、硫酸銨、p H值為5有利于菌絲體多酚物質的積累；蔗糖、蛋白胨、pH值為6有利于菌絲體黃酮、粗多糖的積累；碳氮比為20∶1均有利于菌絲體3種活性成分的積累。本試驗結果可為大白樁菇液體發酵過程中活性物質的獲得提供一定的參考依據。

在單因素試驗的基礎上，結合響應面分析法優化大白樁菇液體發酵工藝以獲得其更高干質量的菌絲體，其最佳配方為：海藻糖25.08 g/L、牛肉浸膏6.33 g/L、pH值4.95、磷酸二氫鉀0.5 g/L、硫酸鎂0.25 g/L、維生素B110 mg/L。在試驗中尚未對發酵周期進行研究，許多研究表明，不同發酵時長對菌絲體干質量及活性物質的積累存在著顯著的影響，今后可在該方面進行深入研究，為大白樁菇的開發利用提供更詳盡的參考依據。