基于CNCPS6.5的泌乳早期奶牛乳真蛋白質產量對可代謝蛋氨酸供應量的Meta分析

高 巍，劉晨黎

(石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832000)

乳蛋白是乳汁中真蛋白質(包括酪蛋白和乳清蛋白)和非蛋白質含氮化合物(包括尿素、氨、氨基酸、尿酸、肌酸和肌酐等)的統稱。乳中真蛋白質含量(MTPC)約為93%。乳蛋白含有人體所需的所有必需氨基酸(EAA)和多種生物活性蛋白質，營養價值很高。因此，如何提高牛乳中真蛋白質含量和產量就是廣大奶牛生產和科研人員尤為關注的問題。許多國家加大了牛奶多成分定價體系中乳蛋白的權重。我國最新發布的巴氏殺菌乳標準[1]將乳蛋白(≥2.9 g/100 g)列為一項主要指標。

相較于遺傳選育來說，營養調控無疑是改善乳真蛋白質含量(MTPC)和產量(MTPY)的一種快速有效的手段。過瘤胃氨基酸保護性技術及其產品的問世，開啟了改善MTPY與蛋白質轉化效率，降低飼養成本和環境污染的營養“調控之窗”[2-4]。近半個世紀的研究結果表明，奶牛在飼喂青貯玉米和苜?；A日糧下，蛋氨酸(Met)和賴氨酸(Lys)通常是對乳蛋白質合成限制作用最大的EAA，提出了代謝蛋白質中Met(Met%MP)和Lys(Lys%MP)含量分別達到7.2%和2.4%最佳[5-6]。關于MTPY對可代謝蛋氨酸供給量(mMetS)的劑量效應關系的meta分析表明，MTPY是可以由mMetS來預測的[7-9]。但是，上述meta分析沒有區分奶牛的泌乳期，奶牛在不同泌乳期的劑量效應關系可能是不同的；其次，從瘤胃微生物蛋白質合成到乳腺中乳蛋白質的合成，都與代謝能(ME)的供應水平密不可分。ME供給不足，氨基酸可能會分解供能，蛋白質的轉化效率降低。因此，以ME進食量為基礎的mMetS來預測牛乳MTPY，明確ME和氨基酸供給量比例關系，可能預測效果更好。最后，日糧中添加瘤胃保護性氨基酸的飼養試驗多采用縱貫設計，而瘤胃后灌注氨基酸的試驗多為交叉設計(含拉丁方)，試驗期普遍較短。試驗設計類型對研究結果是否會產生干擾有待驗證?；谝陨戏治?，本文對泌乳早期荷斯坦奶牛的MTPY與mMetS的劑量效應關系進行了Meta分析。

1 材料與方法

1.1 文獻檢索、選擇標準與日糧模型評價

在Web of Science檢索平臺上，以“lactating dairy cows”或“lactating dairy cattle”與“Methionine”或“metabolizable methionine”作為檢索詞進行文獻檢索，檢索年代為1980年至今。另一個檢索方式是從已發表的相關Meta分析[6-11]的參考文獻中獲取，盡可能最大范圍地檢索出相關研究文獻，作為分析的候選對象。

文獻篩選標準如下：(1)試驗采用的是荷斯坦牛，提供了奶牛的體重、胎次及泌乳天數(DIM<120 d)、泌乳量及乳成分等指標的測量值；(2)奶牛飼喂以青貯玉米、苜蓿干草或青貯為基礎的全混合日糧(TMR)，列出TMR日糧組成、營養水平及主要原料的主要營養成分信息和干物質采食量(DMI)；(3)補飼Met的來源為皺胃或十二指腸灌注DL-Met或日糧中添加瘤胃保護性蛋氨酸(RP-Met)且在CNCPS6.5飼料數據庫中可調用的產品，如MetSmart，Alimet，Mapron，MFP，Smartamine M，Rhodimet AT88等，以便對TMR日糧進行模型評價。頸靜脈灌注Met或其他新型RP-Met產品的試驗報道排除在外。(4)試驗設計有不添加或不灌注Met但飼喂相同日糧的對照組；(5)公開發表于純學術的如《J.Dairy Sci.》，《J.Nutr.》，《J.Anim.Sci.》，《Anim.Feed Sci.Techn.》等國際知名期刊。

在CNCPS6.5模型的‘Cattle inputs’模塊錄入每篇文獻報道的奶牛相關信息，如奶牛的品種、類型、體重、產奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、試驗期內的平均DIM等。MTPC未說明的，則按乳粗蛋白率乘以0.93來計算，用以計算MTPY。其他未明確報道的指標如年齡、胎次、妊娠與否等則統一設定為60月齡，胎次為3，未妊娠。在CNCPS6.5模型的飼料數據庫中調取與文獻報道類似的飼料原料，包括RP-Met產品等，在‘Feeds’模塊中對每種飼料原料按文獻報道的養分含量數值來錄入，未報道的指標則按類似原料的信息來錄入。在CNCPS6.5模型的‘Recipes’模塊中按文獻報道的日糧組成比例和奶牛DMI來擬合TMR日糧，最大限度接近原始文獻報道的日糧營養水平，特別是DM%、ME與MP平衡狀況、CP%與RDP%、NDF%與NFC%、礦物質與維生素ADE等是否滿足其營養需要。要求達到模型預測值不超過文獻報道數值的10%[9]。在CNCPS6.5模型的‘Locations’模塊中輸入牛舍環境與飼養管理信息，如文獻中未明確說明，則按模型默認設置。

符合本研究篩選條件的文獻共計20篇，含23項試驗80個處理，其中對照30個，處理組50個。13項試驗采用的試驗設計類型為縱貫設計，平均試驗期為(83.3±32.1)d，其余10項試驗為交叉設計類型(含拉丁方設計)，平均試驗期為(18.1±9.1)d。將上述文獻的相關信息分別錄入CNCPS6.5進行模型評價，并用SAS9.4的Univariate過程[12]對每一個指標進行單變量分析，結果詳見表1。

表1 Meta分析文獻數據集資料匯總(干物質基礎)※

1.2 數據統計分析

為了解數據集中哪些變量可解釋最大的方差變異，運用SAS9.4的Princomp過程進行主成分分析[12]。在此基礎上，分別以mMetS(g/d)、Met%MP(%)或Met/ME(g/Mcal)作為自變量，以數據集中23項獨立的試驗作為隨機效應，采用SAS9.4的NLMIXED過程擬合Logistic模型參數(群體上漸近線A、形狀參數B和時間尺度k)。以試驗方差、模型方差和AIC數值最小者為最優。運用擬合出的最優模型預測MTPY，對殘差與預測值進行回歸分析，分析預測模型偏差和RMSE值[13]。采用線性混合模型(mixed procedure)進行回歸分析，消除單個試驗的隨機效應后，探索處理對MTPY的固定效應，建立預測回歸方程。所用的統計模型為：

Yij=+Si+B1Xij+biXij+eij

式中：Yij為依變量；為總截距(固定效應)；Si為第i項試驗的隨機效應；B1為依變量Y對自變量X的總體回歸系數(固定效應)；Xij為第i項試驗中第j個連續型自變量的觀察值；bi為第i項試驗中Y對X的回歸系數(隨機效應)；eij為殘差。Si、bi和eij均假定為獨立隨機變量[14]。為探討試驗設計類型(交叉設計與縱貫設計)是否與自變量存在互作影響，故在統計模型中引入一個二值分類變量M(M=c，代表交叉設計類型crossover design；M=l，代表縱貫設計類型longitudinal design)，并進行回歸分析。統計模型為：

Yijk=+Si+j+Sij+B1Xij+biXij+BjXij+eijk

式中：j為分類變量M不同水平下的截距(固定效應)；Bj為分類變量M在不同水平下對自變量Xij的回歸系數(固定效應)。其余同上。

代謝蛋白質中MET增量(△mMetS)的邊際效率分析。本次Meta分析建立的數據集包含23項試驗共80個處理，其中對照組30個，處理組50個。將每項試驗中的每一個處理組與相應的對照組的MTPY、mMetS相減，即可得到△MTPY和△mMetS。牛乳蛋白質中Met的含量按2.76%計,則Met%MP用于乳蛋白質合成的凈效率=(△MTPY×0.0276)/△mMetS。與此同時，根據非線性混合模型(NLMIXED)擬合出的Logistic模型的參數A、B和k計算邊際效率=[ABe(-Met/k)]/k[1+Be(-Met/k)][7]。

2 結果與分析

2.1 主成分分析

前6個主成分的解釋方差比例分別為30.3%、18.9%、12.97%、9.59%、7.24%和5.87%，累積解釋方差達到了84.9%(圖1)。第一主成分主要包括MP供給量、ME進食量和RUP%DM等變量。第二主成分包括了體重、CP%DM和RDP%DM。第三主成分主要包括mMetS、mMetS/ME比和Lys∶Met比。第四、五和六主成分主要為DIM、RDP%DM和NFC%DM?？梢钥闯?，與MTPY關系密切的飼糧因素主要是MP(含Met/Lys)與ME進食量、日糧蛋白質水平與蛋白質結構比例等，與其負相關的主要是碳水化合物成分(NFC、NDF等)。能量與蛋白質(含AA)之間的關系尤為密切。有鑒于此，本文重點以Met%MP、mMetS(g/d)以及mMetS/ME比作為Logistic模型自變量來預測MTPY。

圖1 主成分分析陡坡圖和已解釋方差

2.2 非線性混合模型對乳中真蛋白質產量的預測

由表2看出，當以mMetS作為擬合的自變量時，模型擬合的試驗方差、模型方差以及AIC值均最小，擬合效果最好。故后續分析中均以mMetS作為自變量來擬合的模型參數來預測MTPY。以mMetS為預測自變量時，Logistic模型參數A為1 333.7，與Vyas與Erdman[8]報道的數值1311非常接近，但高于Doepel等[7]報道的數值1 194。本文擬合的參數A值較高的原因是，我們是預測泌乳早期奶牛的MTPY。模型預測的MTPY的平均值為1 040.6 g/d，與Vyas與Erdman[9]的平均值1 058 g/d高度一致，而Doepel等[7]的平均值為738 g/d。造成這種差異的主要原因是，Doepel等[7]的數據集中排除了所有日糧添加RP-Met產品的試驗，因為不能確定這些產品中的Met實際的可利用性數據。本文數據集中文獻使用的RP-Met產品均是CNCPS6.5軟件飼料數據庫中收錄的產品，其可提供的可代謝蛋氨酸的數量由模型預測生成。類似的，Vyas與Erdman[8]是采用NRC的預測模型來生成相關數據，這可能是本文的預測值與其比較一致的一個重要原因。

表2 NLMIXED過程擬合的Logistic模型參數(平均值±SE)

MTPY的觀測值減去模型預測值所得殘差與預測值的回歸分析結果見圖2。如圖所示，殘差與0軸的聚合程度不高，多數分布于±200 g/d范圍內。個別值偏低，位于(-200)～(-400)之間，這是由于個別試驗報道的MTPY過高所致?；貧w分析顯示，MTPY預測存在斜率偏差，其中在預測的MTPY較低時，殘差往往為負值(P<0.01)。此結果與Vyas與Erdman[9]的類似。在他們的Logistic模型預測值中，有兩個處理組的MPY觀測值過大，使得計算出的殘差值極低，導致回歸分析存在斜率偏差(殘差=0.101×MPY-105.5，R2=0.38，P<0.01)。

圖2 殘差對MTPY預測值的回歸分析(殘差=-3365.2+3.2374MTPY，R2=0.1962)

2.3 混合模型回歸分析

采用無結構(TYPE=UN)的協方差參數估計表明，隨機效應中的截距和斜率無互作效應(協方差參數UN(2,1)項的P=0.9765)。故進一步采用方差分量法(TYPE=VC)分析。MTPY預測值經殘差校正后(MTPY校正)，再與mMetS進行回歸分析，得到預測回歸方程：MTPY校正=(951.03±38.2)+(3.05±0.67)×mMetS(R2=0.1912，RMSE=143.2)。

二值變量M與自變量(mMetS)之間存在顯著的互作關系(P=0.0231)。M取值為C時，也就是試驗設立類型為交叉設計時，對試驗的固定效應可能會造成干擾。由于本次Meta分析數據集只有23項試驗，其中10項為交叉設計試驗，數量很有限，還需要更多試驗數據的驗證分析。

2.4 △mMetS的邊際效率分析

共有50個處理組的△MTPY和△mMetS值參與計算邊際效率，剔除了7個異常值(負值)后，其余43個數值繪制散點圖，如圖4“*”所示。散點分布、PBspline樣條曲線及直線回歸均表明，隨著小腸mMETs的增加，Met用于合成乳蛋白質的效率是逐漸降低的。其變化范圍從最高70%到最低0.74%。此結果與之前的結果非常一致。Doepel等[7]報道小腸可代謝蛋氨酸轉化為乳蛋白質中Met的效率由46%降低到14%，類似的，Vyas與Erdman[8]發現，當Met的供給量從25 g/d增加的70g/d時，小腸可代謝Met的邊際效率從44%下降到12%。因為本分析的mMetS的范圍比他們的更寬，下限更低，所以Met的邊際效率的最高達70%。但平均為17.3%，中位數為12.6%。新版《奶牛營養需要》[1]將MP用于乳蛋白質合成的效率設定為67%，而本文和其他meta分析的結果均提示，MP中AA用于乳蛋白質合成的效率不是恒定不變的，而是隨著AA供給量的增大，轉化效率逐步降低的。

圖3 混合模型下可代謝Met進食量與牛乳中真蛋白質產量的回歸關系

圖4 模型預測值與實測值計算邊際效率對比

將數據集中的43個處理組的mMetS和Logistic模型參數(A、B、k)分別計算其邊際效率，所得數值制作散點圖，如圖4中的“△”所示。用Logistic模型預測值計算得到的邊際效率，其總體變化趨勢與實際觀測值的邊際效率的趨勢相同，也是隨△mMetS的增大，邊際效率逐步降低，但變化范圍很窄，從5.38%到4.57%，平均5.03%，變異系數只有4.05%。Vyas與Erdman[8]同樣采用Logistic模型參數計算的邊際效率表明，當蛋氨酸的進食量從25 g/d增加到70 g/d時，MTPY的邊際相應效率從16 g/d下降到4 g/d。造成這種較大差異的原因，我們認為可能主要是Meta分析的文獻數據集的不同。Vyas與Erdman[8]的數據集沒有區分奶牛的泌乳期。而本文的數據集是由20篇文獻針對泌乳早期奶牛(DIM<120 d)進行的23項試驗(含50個處理組和30個對照組)組成的。泌乳早期奶牛的泌乳機能旺盛，養分用于泌乳的凈效率(扣除維持需要)很高，所以，△MTPY對△mMetS的響應的敏感度不高。

3 結論

本研究表明，對MTPY起正效應的飼糧因素主要是MP(含AA)和ME進食量，起負效應的飼糧因素主要包括碳水化合物成分如NFC或NDF等。但是，單一因素所發揮的決定性作用都不大，前6個主成分累積可解釋的方差還不到85%。這就提示我們，奶牛乳蛋白質的合成是一個非常復雜的生理過程，受到多種飼糧因素的影響。

荷斯坦奶牛在飼喂玉米青貯、苜蓿干草或青貯等粗飼料的TMR日糧下，泌乳早期的MTPY可以由mMetS(g/d)來預測。預測效果優于mMetS/ME比或Met%MP。使用mMetS的優點是，在設計飼糧配方時，只需要考慮每頭奶牛每天RP-Met產品的適宜添加量，而無須考慮由于DMI的變動而調整其在飼糧中的養分濃度。當然也需要了解，補飼RP-Met產品的邊際效率會隨補飼量的增加而降低，并非恒定不變的。

本研究還發現，試驗設計類型為交叉設計時，對試驗的固定效應可能會造成干擾，原因可能與交叉設計的試驗期過短有關。