布氏田鼠母體青春期捕食風險應激對后代反捕食行為和HPA軸基礎活動水平的影響

龐金月 李陜 劉園 楊生妹 武瑞勇* 魏萬紅,2*

(1 揚州大學生物科學與技術學院，揚州 225009)

(2 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州大學，揚州 225009)

捕食風險是影響獵物生態和進化的一種重要驅動力(Langerhans, 2007; Pettorelliet al., 2011)，有效的反捕食行為對動物的生存至關重要。動物可以通過減少覓食時間、提高警覺水平和防御能力等來應對捕食風險(Hunter and Skinner, 1998;Verdolin, 2006)，也可以通過改變棲息地的利用方式或遠離捕食者來規避這種風險(McCauley and Rowe, 2010; Coteet al., 2013 )。在高捕食風險下，動物的心理和生理功能也會發生改變，比如焦慮行為增加，應激激素、心率和血壓升高等(Ada‐mecet al., 2004; Masiniet al., 2005; Campeauet al., 2008; Zoladzet al., 2008)，這些改變往往會引起動物繁殖成功率和整體機能的降低(Boonstraet al.,1998;Lima,1998)。

捕食風險還可以觸發獵物“非遺傳母體效應”的跨代傳遞，最終影響后代的表型和適合度。僧帽蚤(Daphnia cucullata) 的胚胎暴露于幽靈蚊(Chaoborus flavicans) 的化學信號后，子代產生更大的“頭盔”以增加防御能力(Agrawalet al.,1999)。雌性三刺魚(Gasterosteus aculeatus)暴露于捕食風險后，子代表現出集群行為增加(Giesinget al., 2011)。懷孕的胎生蜥蜴(Zootoca vivipara) 暴露于蛇的氣味后，子代尾巴顯著增長，體溫選擇性降低，活動明顯增加(Bestionet al., 2014)。排卵前和排卵期的大山雀(Parus major) 暴露于雀鷹的模型和聲音后，雛鳥個體較小但翅膀生長速度較快，表現出能逃避捕食者的選擇性優勢(Co‐slovsky and Richner,2011)。妊娠期C57BL/6小鼠暴露于捕食者氣味可以增加子代成年后對該氣味引起的應激相關防御反應的改變，比如逃避行為和血清皮質酮(corticosterone, CORT) 水平增加(St-Cyr and McGowan,2015;St-Cyret al.,2017)。妊娠中期的根田鼠(Alexandromys limnophilus)暴露于艾鼬(Mustela eversmannii)抑制了子代的運動和探究行為，可能對子代的適合度以及種群波動產生負向效應(吳雁等， 2006)。妊娠期的布氏田鼠(La‐sipodomys brandtii) 暴露于貓(Felis catus) 的尿液，產生較多體重較輕的雌性后代，而雄性后代成年后增加探究和覓食行為，并且降低了應激下的血漿CORT 水平(Guet al.,2018,2020)。這些產前母性效應可能反映了一種反捕食防御的發育編程彈性機制(a flexible mechanism of developmental pro‐gramming)(Loveet al.,2013)。

動物的青春期應激作為一種環境因素，也具有跨代傳遞效應(Grogeret al.,2016)。研究發現青春期的雌性大鼠暴露于慢性溫和應激會影響F1 和F2代的焦慮樣行為和恐懼反應(Shachar-Dadonet al.,2009;Zaidan and Gaisler-Salomon,2015)，并伴隨著CORT 水平以及前額葉皮質中促腎上腺皮質激素釋放因子(corticotropin releasing factor,CRF)1 型受體mRNA 表達和靶向miRNA 的改變(Zaidanet al.,2013, 2021; Harkeret al., 2015; Bocket al., 2016)。青春期雌性SD 大鼠暴露于嗎啡，會引起后代隔離誘發的求救呼叫的減少(Bodiet al.,2016)。青春期大鼠經歷社會隔離，其后代應激軸(下丘腦―垂體―腎上腺軸, hypothalamic?pituitary?adrenal axis,HPA 軸)的基礎活動水平增加、下丘腦CRF和垂體CRF1 型受體豐度降低、海馬糖皮質激素受體表達增加，成年的雄性后代也表現出中樞和血漿神經活性類固醇3α, 5α-四氫孕酮的增加(Pisuet al.,2013)。這些研究表明，青春期應激的影響不只局限于接受應激的一代，也可能更廣泛地影響表觀基因組，從而影響F1 代甚至F2 代。但是，青春期暴露于捕食風險應激是否也具有跨代傳遞效應，后代的反捕食行為和應激激素水平如何改變尚無相關報道。

布氏田鼠是分布于我國內蒙古草原和俄羅斯貝加爾湖東南部地區的一種典型草原嚙齒動物。由于其啃食植物，具有挖倉儲草習性，嚴重破壞了草原植被和畜牧作物，被認為是草原害鼠(Zhanget al., 2003)。布氏田鼠是狐貍(Vulpes)、艾鼬、兔猻(Otocolobus manul)、獵隼(Falco cher‐rug)、高地禿鷹(Buteo hemilasius)和草原鷹(Aqui‐la nipalensis) 等食肉動物的重要食物來源(Samjaaet al., 2000)。研究發現青春期和成年期的布氏田鼠暴露于貓和黃鼬(Mustela sibirica) 的尿液和糞便時，表現出強烈的恐懼和防御反應(Hegabet al., 2014b)，并隨著暴露次數的增多而表現出適應(Hegabet al., 2014a；彭延等，2021)，但是妊娠期重復暴露于貓尿影響布氏田鼠的繁殖產量、后代質量和行為表型(Guet al., 2018, 2020)。產后重復暴露于貓尿，也會抑制雌性布氏田鼠的母性行為，并增加后代的運動能力(Wuet al.,2020)。最近的研究發現布氏田鼠在青春期時重復暴露于貓尿增加了同伴之間的親密行為，以及產后對其幼仔的育幼行為，并且這種經歷影響后代性比和質量(Wuet al.,2021)，那么這種經歷是否會影響后代的反捕食行為尚不清楚。

本研究以青春期雌性布氏田鼠作為親代實驗動物，在室內條件下重復暴露于貓尿，來測定其子代在青春期和成年期對該氣味的響應以及基礎的應激激素水平。旨在探討母體青春期捕食風險應激的跨代傳遞效應，為進一步豐富捕食者與獵物之間的協同進化理論和布氏田鼠的種群動態監測提供一定的參考。

1 研究方法

1.1 實驗動物

實驗動物為捕捉于內蒙古錫林郭勒草原，在揚州大學室內繁殖的布氏田鼠。幼體在出生后與其雙親共同生活到產后21 d 時斷奶分籠，將其單個飼養在22 cm×15 cm×18 cm 的飼養籠中，以木屑作為墊料，供給充足的水和標準鼠飼料(揚州儀征動物生物科技有限公司)。飼養房的光照周期為12 L∶12 D，室溫為22℃±3℃。所有實驗過程均按照《中國實驗動物飼養管理和使用指南》進行，并由揚州大學動物福利倫理委員會審核。

1.2 氣味源的制備

布氏田鼠對貓的糞便和尿液表現出強烈的恐懼和防御反應(Hegabet al., 2014b)，因此本研究以貓尿作為捕食者氣味源，以兔尿作為非捕食者氣味源，以蒸餾水作為對照氣味源。貓氣味源來自于從揚州大學文匯路校區捕捉的1 只成年雄貓(Felis silvestris catus)，兔氣味源來自于從揚州市農貿市場購買的1 只成年雄兔(Oryctolagus cunicu‐lus)。為了避免氣味的干擾，分別將貓和兔飼養于不同的房間，飼養籠的大小為120 cm×40 cm×30 cm，每天分別給予足夠的貓糧、兔飼料和水，溫度和光照周期同布氏田鼠的飼養環境。尿液從放置在飼養籠下面的干凈托盤(放置48 h) 中收集，過濾掉糞便或皮毛，在使用前儲存在?20℃冰箱。在開始實驗前，將尿液解凍并稀釋5倍，以確保有足夠的氣味來源。

1.3 實驗處理

實驗處理參照Wu 等(2021) 的方法進行。選擇體重、發情期基本一致的28 日齡的青春期雌性布氏田鼠36 只作為親代，將其分為3 組，每組12只個體，分別暴露于貓尿(cat odor, CO)、兔尿(rabbit odor, RO) 和蒸餾水(distilled water, DW)氣味源，每只動物每天暴露1 次，每次60 min，連續18 d (圖1)；所有的暴露過程都在08: 00—12: 00 進行。具體過程如下：將28 日齡的親代雌性田鼠轉運到氣味暴露房間的暴露箱(75 cm ×40 cm × 30 cm) 中，使其適應暴露箱60 min 后，將動物放回原飼養籠，連續適應2 d。30 日齡時開始親代應激實驗，將大約10 g 標準鼠飼料和一個浸泡1 mL 稀釋尿液或蒸餾水的棉花球(直徑5 cm)放入暴露箱中，隨后放入實驗鼠，時長60 min，連續18 d；每次實驗結束后用70%酒精溶液擦拭暴露箱以消除氣味干擾。親代應激暴露結束后在飼養籠中正常飼養至90 日齡，選取陌生正常雄鼠進行交配。子代在出生21 日齡時斷奶分窩，每只子代個體單獨飼養在22 cm × 15 cm × 18 cm的飼養籠中。從每組親代氣味源應激的后代中，選擇大小基本相同的子代個體進行行為和激素水平測定。分為兩批，其中一批在子代28 日齡時測定，另一批在子代90 日齡時測定，每批中每種處理的子代選擇24只，雌、雄各12只。

1.4 子代反捕食行為觀察

按照測試時應激反應增強的順序，將每只子代暴露于3 種氣味源，其中暴露于蒸餾水作為行為反應的基礎水平，兔氣味為非捕食者氣味反應，貓氣味為反捕食響應。實驗步驟在以上的基礎上進行了修改(圖1)。選取的青春期子代在28 日齡和29 日齡時單獨放在行為觀察箱中(同親代的氣味暴露箱)適應，隨后在30 日齡時暴露于蒸餾水，33 日齡時暴露于兔尿氣味源，36 日齡時暴露于貓尿氣味源。每次暴露15 min 并用攝像機記錄行為，實驗結束后用70%酒精溶液擦拭行為觀察箱。選取的成年期子代在90 日齡暴露于蒸餾水，93 日齡暴露于兔尿氣味源，96 日齡暴露于貓尿氣味源。使用Boris 軟件分析下列行為持續時間：隱藏，指田鼠頭部和身體完全躲在隱藏室中；嗅聞，指嗅聞氣味源；警戒性直立，指田鼠后腿站立，前肢抬起不需要任何東西支撐，四處張望；探頭，指田鼠的頭部和肩部探出隱藏室，身體的大部分仍藏在隱藏室；自飾，指田鼠用四肢梳理毛發；僵住，指除呼吸外完全靜止；其他行為。

圖1 實驗設計流程圖. 在時間軸上標出了實驗操作，數字代表出生后日齡；DW：母體青春期暴露于蒸餾水組；RO：母體青春期暴露于兔氣味組；CO：母體青春期暴露于貓氣味組Fig. 1 Schematic illustration of the experimental procedure. The experimental manipulations are labeled on the timeline,the numbers indicates the postnatal day. DW:distilled water group;RO:rabbit odor group;CO:cat odor group

1.5 Elisa檢測血清應激激素水平

青春期和成年期的子代在行為測試完成后快速斷頭采血，并將血漿樣品儲存在?20℃冰箱。用田鼠特異性的酶聯免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay, Elisa) 試 劑 盒(JL21590 和JL21595，上海江萊生物科技有限公司)，按照說明檢測血漿中促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH) 和CORT 濃度。每個樣品的濃度根據標準曲線計算所得，樣品重復2次，重復值之間的差異小于5%。

1.6 下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)表達水平的檢測

采集布氏田鼠血液后，快速取出腦并置于冷凍的培養皿上，冠狀切片后從1 mm 厚的切片中取出下丘腦組織。用添加蛋白酶抑制劑的RI‐PA 提取總蛋白，隨后用10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離變性的蛋白提取物，并轉移到PVDF 膜上。隨后用兔多克隆抗CRH (1∶1000, 10944-1-AP, Proteintech) 和抗β-actin (1∶5000, bs-0061R,北京博奧森生物技術有限公司) 的一抗孵育，4°C過夜。清洗后，膜用山羊抗兔IgG 二抗孵育(1∶5000, bs-0295G-HRP, 博奧森)。最后，使用增強的ECL 試劑盒和Tanon 5200 化學發光成像系統觀察蛋白條帶。用Image J 軟件進行定量分析。

1.7 數據統計分析

用SPSS 22.0 軟件進行數據統計分析。首先用單樣本Kolmogorov?Smirnov 檢驗所有數據是否符合正態分布，隨后使用雙因素方差分析(two?way ANOVA) 比較母體青春期處理對子代的行為、血漿應激激素和下丘腦CRH 表達水平的影響及性別間的差異。如果方差分析有處理主效應或交互作用，用Turkey HSD 進行事后多重比較檢驗。所有數據以平均值± 標準誤(mean ± SE) 表示，P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結果

2.1 子代青春期的行為反應

雙因素方差分析表明，母體的青春期處理顯著影響其子代在青春期暴露于蒸餾水時的警戒性直立行為(F2,66= 3.244,P= 0.05)。與DW 組的子代相比，RO 組的子代在青春期暴露于蒸餾水時表現較多的警戒性直立行為(P=0.041，圖2)。子代在青春期暴露于蒸餾水時，雌性后代比雄性后代表現較多的隱藏(F1,66= 6.189,P= 0.017)、僵住(F1,66=17.605,P<0.001)和探頭(F1,66=5.504,P=0.024)行為，較少的自飾行為(F1,38=9.983,P=0.003)。

圖2 母體青春期不同氣味源處理的子代在青春期暴露于蒸餾水的行為反應. A：隱藏的持續時間；B：自飾的持續時間；C：僵住的持續時間；D：探頭的持續時間；E：嗅聞的持續時間；F：警戒性直立的持續時間. DW：母體青春期暴露于蒸餾水組；RO：母體青春期暴露于兔氣味組；CO：母體青春期暴露于貓氣味組. *P<0.05，不同處理組之間的差異. #P<0.05，##P<0.01，不同性別之間的差異Fig. 2 The behavioral performances to acute distilled water exposure in adolescent offspring whose mother exposed to different odor resources dur‐ing adolescence. A:duration of concealing;B:duration of self-grooming;C:duration of freezing;D:duration of head-out;E:duration of sniffing;F:duration of vigilant rearing. DW: distilled water group; RO: rabbit odor group; CO: cat odor group. *P < 0.05, significant difference among the three exposure groups. #P<0.05,##P<0.01,significant difference between males and females

母體青春期處理對子代在青春期暴露于兔氣味時的行為反應沒有影響(圖3)，但是雄性子代比雌性子代表現較多的探頭(F1,66= 4.940,P=0.03) 和嗅聞(F1,66= 7.353,P= 0.009) 行為。

圖3 母體青春期不同氣味源處理的子代在青春期暴露于兔氣味的行為反應. A：隱藏的持續時間；B：自飾的持續時間；C：僵住的持續時間；D：探頭的持續時間；E：嗅聞的持續時間；F：警戒性直立的持續時間. DW：母體青春期暴露于蒸餾水組；RO：母體青春期暴露于兔氣味組；CO：母體青春期暴露于貓氣味組. #P<0.05，##P<0.01，不同性別之間的差異Fig. 3 The behavioral performances to acute rabbit odor exposure in adolescent offspring whose mother exposed to different odor resources during adolescence. A:duration of concealing;B:duration of self-grooming;C:duration of freezing;D:duration of head-out;E:duration of sniffing;F:du‐ration of vigilant rearing. DW:distilled water group;RO:rabbit odor group;CO:cat odor group. #P<0.05,##P<0.01,significant difference be‐tween males and females

母體青春期處理顯著影響子代在青春期暴露于貓氣味時的隱藏(F2,66= 9.661,P< 0.001)、自飾(F2,66= 16.742,P< 0.001)、探頭(F2,66=16.916,P< 0.001)、嗅聞(F2,66= 18.693,P<0.001) 和警戒性直立(F2,66= 6.279,P= 0.003)行為，隱藏(F1,66= 4.261,P= 0.043)、自飾(F1,66= 4.781,P= 0.032) 和僵住(F1,66= 11.313,P< 0.001) 行為表現出性別的差異， 探頭(F2,66= 3.502,P= 0.036) 和直立(F2,66= 4.943,P= 0.001) 行為受母體青春期處理與子代性別交互作用的影響。與DW 組(雄:P= 0.008; 雌:P= 0.003) 和RO 組(雄:P= 0.04; 雌:P= 0.042)的子代相比，CO 組的子代在青春期暴露于貓氣味時的隱藏行為顯著增多。此外，CO 組和RO組子代的自飾 (CO:P< 0.001; RO: 雄P=0.001)、探 頭(CO: 雄P= 0.023, 雌P< 0.001;RO: 雄P= 0.003, 雌P= 0.004) 和嗅聞行為(CO:P< 0.001; RO:P= 0.001) 顯著低于DW 組的子代。RO 組雌性子代的直立行為顯著低于DW 組的雌性子代(P= 0.001)，而探頭(雌P= 0.013)和嗅聞(P= 0.013) 行為顯著高于CO 組的子代(圖4)。

圖4 母體青春期不同氣味源處理的子代在青春期暴露于貓氣味的行為反應. A：隱藏的持續時間；B：自飾的持續時間；C：僵住的持續時間；D：探頭的持續時間；E：嗅聞的持續時間；F：警戒性直立的持續時間. DW：母體青春期暴露于蒸餾水組；RO：母體青春期暴露于兔氣味組；CO：母體青春期暴露于貓氣味組. *P<0.05，**P<0.01，不同處理組之間的差異.#P<0.05，不同性別之間的差異Fig. 4 The behavioral performances to acute cat odor exposure in adolescent offspring whose mother exposed to different odor resources during ad‐olescence. A:duration of concealing;B:duration of self-grooming;C:duration of freezing;D:duration of head-out;E:duration of sniffing;F:dura‐tion of vigilant rearing. DW:distilled water group;RO:rabbit odor group;CO:cat odor group. *P<0.05,**P<0.01,significant difference among the three exposure groups. #P<0.05,significant difference between males and females

2.2 子代成年期的行為反應

雙因素方差分析表明，母體青春期處理對子代在成年后暴露于蒸餾水時的行為反應沒有影響，但是成年雄性子代比雌性子代表現較多的警戒性直立行為(F1,66= 14.497,P< 0.001)(圖5)。

圖5 母體青春期不同氣味源處理的子代在成年后暴露于蒸餾水的行為反應. A：隱藏的持續時間；B：自飾的持續時間；C：僵住的持續時間；D：探頭的持續時間；E：嗅聞的持續時間；F：警戒性直立的持續時間. DW：母體青春期暴露于蒸餾水組；RO：母體青春期暴露于兔氣味組；CO：母體青春期暴露于貓氣味組. #P<0.05，不同性別之間的差異Fig. 5 The behavioral performances to acute distilled water exposure in adult offspring whose mother exposed to different odor resources during ado‐lescence. A:duration of concealing;B:duration of self-grooming;C:duration of freezing;D:duration of head-out;E:duration of sniffing;F:duration of vigilant rearing. DW:distilled water group;RO:rabbit odor group;CO:cat odor group. #P<0.05,significant difference between males and females

母體青春期處理只影響子代在成年后暴露于兔氣味時的探頭行為(F2,66=5.049,P=0.009)。與DW 組子代相比，CO 組的子代在成年暴露于兔氣味時表現較少的探頭行為(P=0.002,圖6)。此外，成年雌性子代比雄性子代表現出較多的嗅聞行為(F1,66=6.949,P=0.01)。

圖6 母體青春期不同氣味源處理的子代在成年后暴露于兔氣味的行為反應. A：隱藏的持續時間；B：自飾的持續時間；C：僵住的持續時間；D：探頭的持續時間；E：嗅聞的持續時間；F：警戒性直立的持續時間. DW：母體青春期暴露于蒸餾水組；RO：母體青春期暴露于兔氣味組；CO：母體青春期暴露于貓氣味組. **P<0.01，不同處理組之間的差異. #P<0.05，不同性別的差異Fig. 6 The behavioral performances to acute rabbit odor exposure in adult offspring whose mother exposed to different odor resources during ado‐lescence. A: duration of concealing; B: duration of self-grooming; C: duration of freezing; D: duration of head-out; E: duration of sniffing; F: dura‐tion of vigilant rearing. DW: distilled water group; RO: rabbit odor group; CO: cat odor group. **P < 0.01, significant difference among the three exposure groups. #P<0.05,significant difference between males and females

母體青春期處理顯著影響子代在成年后暴露于貓氣味時的警戒性直立行為(F2,66= 3. 533,P=0. 035)，子代性別影響隱藏(F1,66= 65. 634,P<0. 001)、自飾(F1,66= 5. 495,P= 0. 032) 和探頭(F1,66= 4. 467,P= 0. 038) 行為，而自飾行為也受母體青春期處理和子代性別交互作用的影響(F2,66=5. 965,P= 0. 004)。與DW 組(P= 0. 027) 和RO組(P=0. 021)子代相比，CO組的子代在成年后暴露于貓氣味時警戒性直立行為顯著增加，雄性子代的自飾行為也顯著降低(vs. DW:P= 0. 005;vs.RO:P= 0. 003)。在暴露于貓氣味時，成年雌性子代的隱藏行為顯著高于雄性，而探頭行為顯著低于雄性。在CO組的成年子代中，雌性暴露于貓氣味時的自飾行為顯著高于雄性(P<0. 001)(圖7)。

圖7 母體青春期不同氣味源處理的子代在成年后暴露于貓氣味的行為反應. A：隱藏的持續時間；B：自飾的持續時間；C：僵住的持續時間；D：探頭的持續時間；E：嗅聞的持續時間；F：警戒性直立的持續時間.DW：母體青春期暴露于蒸餾水組；RO：母體青春期暴露于兔氣味組；CO：母體青春期暴露于貓氣味組. *P<0.05，**P<0.01，不同處理組之間的差異. #P<0.05，##P<0.01，不同性別的差異Fig. 7 The behavioral performances to acute cat odor exposure in adult offspring whose mother exposed to different odor resources during adoles‐cence. A: duration of concealing; B: duration of self-grooming; C: duration of freezing; D: duration of head-out; E: duration of sniffing; F: duration of vigilant rearing. DW:distilled water group;RO:rabbit odor group;CO:cat odor group. *P<0.05,**P<0.01,significant difference among the three exposure groups. #P<0.05,##P<0.01,significant difference between males and females

2.3 子代HPA軸的基礎活動水平

Elisa 和Western Blot 的檢測結果表明，母體青春期處理顯著影響子代在青春期時的血漿ACTH (F2,66= 3.346,P= 0.041) 和 CORT(F2,66= 7.859,P= 0.001) 水平，而對下丘腦CRH 的表達沒有影響。CO 組的子代在青春期時(雌:P= 0.013; 雄:P= 0.037)，血漿中CORT的濃度顯著高于DW 組的子代；RO 組的子代在青春期時只有雄性的血漿ACTH (P= 0.052) 和CORT (P= 0.042) 濃度顯著高于DW 組的雄性子代(圖8A ~ C)。子代在青春期時的血漿ACTH (F1,66= 32.555,P< 0.001) 和 CORT(F1,66= 20.651,P< 0.001) 水平也受性別的影響，雌性比雄性具有較高的血漿ACTH (DW 組,P< 0.001; RO 組,P= 0.008; CO 組,P= 0.016 )和CORT (DW 組,P< 0.001; CO 組,P= 0.002)濃度。

母體青春期處理也顯著影響子代在成年后的血漿ACTH (F2,66= 7.752,P= 0.001) 和CORT(F2,66= 3.399,P= 0.039) 水平，而對下丘腦CRH表達沒有影響。Elisa的檢測結果表明RO組的子代在成年后血漿ACTH的濃度顯著高于DW組的成年子代(P=0.001)，而CORT 濃度低于CO 組的成年子代(P=0.03)(圖8D~F)。

圖8 母體青春期不同氣味源處理的子代在青春期和成年后的血漿ACTH 和CORT 濃度，以及下丘腦CRH 的表達水平. A：子代在青春期時的血漿CORT 濃度；B：子代在青春期時的血漿ACTH 濃度；C：子代在青春期時的下丘腦CRH 相對表達量；D：子代在成年后的血漿CORT 濃度；E：子代在成年后的血漿ACTH 濃度；F：子代在成年后的下丘腦CRH 相對表達量. * P< 0.05，不同處理組之間的差異.#P<0.05，不同性別之間的差異Fig. 8 The concentration of plasma ACTH and CORT, as well as hypothalamic CRH expression in offspring during adolescence and after adult‐hood,respectively. A:plasma CORT concentration in offspring during adolescence;B:plasma ACTH concentration in offspring during adolescence;C:relative expression of hypothalamic CRH in offspring during adolescence;D:plasma CORT concentration in offspring after adulthood;E:plasma ACTH concentration in offspring after adulthood; F: relative expression of hypothalamic CRH in offspring after adulthood. *P < 0.05, significant difference among the three exposure groups. #P<0.05,significant difference between males and females

3 討論

為了證實母體青春期捕食風險的“跨代傳遞”效應，本研究檢測了青春期的雌性布氏田鼠在重復暴露于貓氣味后，其子代在青春期和成年期的反捕食響應和應激激素水平。結果發現母體青春期的捕食風險應激可能影響后代的防御策略，子代在青春期暴露于相同的捕食風險氣味源時采用隱藏的消極回避策略，而子代在成年后采用警戒性直立的主動防御策略。這些可能與應激激素的基礎水平相關，因為本研究還發現子代在青春期時的血漿皮質酮水平升高，而成年時沒有變化。這些結果表明母體青春期暴露于捕食風險可以促進后代反捕食行為的表達，表現出“跨代傳遞”效應，后代的不同發育階段通過采用不同的反捕食策略，提高其在被捕食風險下的適應性生存能力。

本研究中，母體青春期重復暴露于貓氣味的子代在青春期時遭遇同樣的捕食風險氣味源時隱藏行為增多，嗅聞和探頭行為減少。通常情況下，獵物會尋找安全的位置減少遭遇捕食者或被捕食者攻擊的風險(Sievertet al.,2020)。本研究隱藏箱與自然狀態下的洞道相似，代表了這一安全的位置，因此隱藏行為是主要的行為反應，約占70%。隱藏行為增多，說明母體青春期暴露于貓氣味的子代在青春期時對捕食者氣味更為敏感，采用隱匿的策略來提高存活的可能。探頭行為指嚙齒動物將頭從洞道里探出來收集周圍環境信息的行為，一般被認為是一種風險評估行為(Dielenberget al.,2001;Hegabet al.,2014b)。正常的邏輯是，獵物在嗅聞到捕食者氣味后會撤退到安全位置，然后探頭進行風險評估。隱藏行為的增多，嗅聞和探頭行為的減少則說明這些子代在青春期時主要采用消極回避的防御策略來提高個體適合度。

此外，本研究還發現子代在青春期暴露于貓尿時的自飾行為減少。自飾行為是一種復雜的本能行為，在應對應激的行為適應中起重要作用。研究表明焦慮模型的嚙齒動物表現出自飾行為減少，互飾行為增多(Kalueffet al., 2016)，自飾行為的減少可能反映了較高的焦慮水平(Spruijtet al., 1992; Wuet al., 2013)。因此我們推測子代在青春期暴露于貓尿時，應激水平增加，表現出較高的焦慮，伴隨著自飾行為的降低。本研究中母體青春期重復暴露于貓氣味的子代在青春期時的血漿CORT水平明顯高于對照組子代，支持這一推測，說明這些子代在青春期時的應激水平較高。

警戒性直立是鼠類用后腿站立，并環視周圍環境發現潛在威脅的行為。這也是一種典型的防御反應，旨在幫助獵物收集較遠的威脅源信息，與探頭行為類似，也是一種風險評估行為(Dielen‐berget al., 2001; Bowenet al., 2012)。本研究發現母體青春期暴露于貓氣味的子代在成年后暴露于兔氣味時探頭行為減少，而暴露于貓氣味時探頭行為沒有改變，但警戒性直立行為增加，說明這些子代在成年后可能對捕食風險更為敏感。探頭和警戒性直立行為的目的都是為了收集周圍環境信息，當需要收集較遠的環境信息時，與捕食者沒有直接身體接觸的情況下，警戒性直立行為可能會比探頭行為更為頻繁。有學者認為警戒性直立行為的增加和探究行為的減少是對危險產生的一種長期適應性的改變(Fendt and Fanselow, 1999;Dielenberget al., 2001; Misslin, 2003; Kindermannet al., 2009)。因此我們推測母體青春期暴露于捕食風險會促進子代在成年后對這種風險應激的適應。與對照組子代相比，母體青春期暴露于貓氣味的子代在成年后CORT水平沒有明顯變化，也證實了這種適應性。在這種情況下，獵物往往選擇主動的防御策略，比如提高警戒水平。

母體青春期暴露于捕食風險后，子代在青春期時采用消極回避的防御策略，而在成年后采用警戒性的主動防御策略，這些結果都證明母體青春期的這種捕食風險經歷提高了后代的反捕食行為水平，從而可能提高個體適合度。很多研究已經證實了捕食風險在孕期和產后的“跨代母體傳遞效應”，比如大山雀翅膀長度的增加(Coslovsky and Richner, 2011)，三刺魚更緊密的集群行為(Giesinget al., 2011) 和蟋蟀靜止時間的增加(Storm and Lima,2010)，都支持本研究結果。這些研究說明，母體在任何階段遭遇應激都可能對后代產生持久的影響。母體效應引起子代表型的變化，可能是母體對子代出生后頻繁遭遇的生態應激源的一種預防和準備，當母體環境與子代環境相匹配時，可以提高子代對環境的適應性(Monaghanet al.,2009)。

綜上所述，本研究證實母體青春期捕食風險的“跨代傳遞”效應，這種經歷以階段性的效應提高后代的反捕食防御水平，子代青春期傾向于被動防御，成年后采用主動防御，這可能與基礎的應激激素水平相關。表明母體青春期的經歷對于后代行為和生理表型的重塑也非常重要，對于理解不同階段的“母體跨代傳遞”效應對后代行為表型的影響具有重要意義。